鴨梨PbADC 基因的鑒定及在果心褐變中的表達

李慶秀，鄧 冰，寇曉敏，李 萍，吳海清，4，梁麗雅，閆師杰，4*

（1 天津農(nóng)學院 食品科學與生物工程學院 天津300384 2 山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 山西晉中030801 3 天津農(nóng)學院 基礎科學學院 天津300384 4 天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術工程中心 天津300384 5 天津農(nóng)學院 農(nóng)學與資源環(huán)境學院 天津 300384）

鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd cv.Yali）屬于薔薇科白梨品系的一種，是我國最早的出口商品之一[1-2]。鴨梨作為我國出口梨的主打品種，以其鮮嫩多汁、酸甜可口、香氣濃郁、耐貯藏等優(yōu)點而備受消費者青睞，然而其在貯藏期間極易發(fā)生逆境傷害，導致果實內(nèi)部褐變，嚴重降低了果實的貯藏質量和食用口感，從而造成嚴重的經(jīng)濟損失[3-4]，因此解決鴨梨褐變問題十分必要。

有研究顯示，內(nèi)源多胺在植物細胞中的累積水平越高，對植物的脅迫抗逆性就越強，而多胺合成酶基因表達水平的上調(diào)是其累積的先決條件[5-6]。多胺（Polyamines，PAs）是一類含有2 個或更多氨基組成的帶正電荷的小分子化合物，在生物體內(nèi)普遍分布[7-10]。高等植物體內(nèi)的主要多胺有腐胺、亞精胺和精胺，它們對植物的生長發(fā)育及逆境響應起著非常重要的調(diào)控作用[11-14]。當果蔬受到逆境傷害時，其游離態(tài)腐胺會轉變成亞精胺和精胺，從而得到較高含量的游離態(tài)亞精胺和精胺來抵御逆境脅迫及自身衰老過程中的一系列傷害[15]。王頡等[16]研究表明外源多胺處理可以顯著降低鴨梨果心組織CO2含量，抑制其褐變的發(fā)生。多胺的生物合成主要有兩條途徑，一條是通過鳥氨酸脫羧酶（ODC）將鳥氨酸轉化為腐胺；另一條精氨酸脫羧酶（Arginine decarboxylase，ADC）催化精氨酸經(jīng)脫羧和酶促反應后，再形成腐胺（Putrescine，Put）。ADC 是植物在逆境脅迫條件下合成多胺的關鍵限速酶，能夠將精氨酸轉化為Put，該途徑為高等植物所獨有，其結構與功能備受關注[17-20]。精氨酸脫羧酶（ADC）是依賴磷酸吡哆醛（PLP）的一類酶，廣泛存在于微生物和動植物中，且ADC 一般存在于植物的細胞質中，對外界各種脅迫反應都十分敏感。目前研究發(fā)現(xiàn)ADC 在植物抗逆、根系發(fā)育及細胞伸長等方面具有重要的功能，而其在果蔬，特別是鴨梨等果蔬采后褐變中的功能尚未見報道。

本研究以鴨梨果心為材料，從鴨梨轉錄組數(shù)據(jù)中篩選并鑒定PbADC 基因，通過生物軟件來預測其基本生物學特性，并利用qRT-PCR 技術對其在鴨梨采后貯藏期間的表達模式進行分析。通過以上研究為探索PbADC 基因在鴨梨采后果心褐變中的調(diào)控機制提供依據(jù)，為進一步解析鴨梨果心褐變機理奠定分子和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鴨梨于2020 年采自河北省辛集市，采摘時間為8 月26 日（盛花期后145 d），即早采鴨梨：挑選大小均一、無機械傷和病蟲害的果實，采摘后當天運回冷庫，預冷24 h 后進行急速降溫【直接放于（0±0.5）℃】和緩慢降溫處理【先放入12 ℃的冷庫中，每5 d 降2 ℃，30 d 降到（0±0.5）℃】，每個處理各10 箱。分別在貯藏0，30，60，90，120，150，180 d 和210 d 進行果心組織取樣，用液氮將所有樣品速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2 試驗設備與儀器

TAdvanced 96 溫度梯度PCR 儀，德國耶拿分析儀器公司；Quantagene q225 熒光定量PCR 儀，北京酷博科技有限公司；GenSens 2100 凝膠成像儀，上海勤翔科學儀器有限公司；PowerPac Basic 1645050 電泳儀，美國伯樂公司；Eppendorf 5418小型臺式高速離心機，德國艾本德股份公司；NanoDrop one 超微量分光光度計，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因鑒定 參考韓云云等[21]的方法，并略作修改。利用在線軟件SMART 和Pfam 對從轉錄組數(shù)據(jù)中篩選的基因進行注釋，使用NCBI 中的Blast P 分析ADC 蛋白的保守結構域，基因結構用IBS 1.0 軟件進行可視化。

1.3.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構建及多序列比對 PbADC蛋白和其部分同源序列使用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的BLAST 檢索并下載，系統(tǒng)發(fā)育樹使用MEGA 6.0軟件進行構建，PbADC 蛋白與其親緣關系較近的ADC 蛋白使用DNAMAN 軟件進行多序列比對。

1.3.3 蛋白生物信息學分析 參考韓云云等[21]的方法對PbADC 蛋白進行生物信息學分析。

表1 蛋白生物信息學分析軟件Table 1 The software of protein bioinformatics analysis

1.3.4 果心褐變指數(shù)的測定 參考閆師杰等[22]的方法，并略作修改；分別在貯藏0，30，60，90，120，150，180 d 和210 d 隨機從急降和緩降處理的10箱鴨梨中各選取30 個鴨梨，每組10 個，把鴨梨切開后統(tǒng)計其果心子房室的褐變情況。褐變指數(shù)計算方法見式（1）。

1.3.5 總RNA 提取和相對表達量測定 參考張引引[2]和樊曉嵐等[23]的方法，略作改動。

1.3.5.1 總RNA 提取和反轉錄 根據(jù)植物多糖多酚試劑盒說明書進行鴨梨果心組織樣品總RNA 的提?。恢苽?%的瓊脂糖凝膠，并用水平電泳檢測RNA 提取的質量；采用Nanodrop 超微量分光光度計測定RNA 在不同波長下（260 nm 和280 nm 處）的OD 值，來確定RNA 的濃度及純度。使用寶生物的反轉錄試劑盒（RR047A）將1 μL 的總RNA 為模板進行反轉錄，合成cDNA（具體操作參照說明書），反應結束后保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.5.2 相對表達量測定 將獲得的cDNA 參照確定的基因序列用NCBI blast primer 設計用于熒光定量PCR 反應的引物（表2）。參照試劑盒說明書把熒光定量PCR 反應體系充分混勻后，放于熒光定量PCR 儀中進行反應，反應結束后根據(jù)得到的溶解曲線和擴增曲線確定數(shù)據(jù)的可靠性，并進行計算。將PbActin（登錄號GU830958.1）作為內(nèi)參基因，用降溫前（貯藏0 d）樣品中的相關基因表達量作為標準，使用2-△△Ct方法計算出不同樣品的基因相對表達量[21]。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.3.6 精氨酸脫羧酶（ADC）活性的測定 采用植物精氨酸脫羧酶試劑盒進行精氨酸脫羧酶（ADC）活性的測定。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析 利用Excel 2016 和IBM SPSS 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和方差分析，使用Origin 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 PbADC 基因鑒定

從鴨梨轉錄組數(shù)據(jù)中得到1 條與ADC 基因具有同源性的編碼序列，通過SMART 在線工具對該序列所編碼的蛋白進行結構域分析，結果表明PbADC 蛋白第 127～399 位氨基酸殘基為Orn_Arg_deC_N 結構域（圖1），再結合CDD 注釋結果確定該序列為PbADC 基因的編碼序列。而后對PbADC 基因的DNA 序列進行分析，結果顯示該基因DNA 序列長度為3 020 bp，其最長開放閱讀框為2 193 bp，編碼730 個氨基酸。

圖1 PbADC 基因結構域預測Fig.1 Domain prediction of PbADC gene

2.2 PbADC 氨基酸序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構建

為分析PbADC 與其它植物ADC 蛋白的進化關系，通過MEGA 6.0 軟件，用ML 法進行構建鴨梨（Pyrus bretschneideri）、杜梨（Pyrus betulifolia）、蘋果（Malus domestica）、秋子梨×西洋梨（Pyrus ussuriensis × Pyrus communis）、湖北海棠（Malus hupehensis）、桃（Prunus persica）、月季（Rosa chinensis）、葡萄（Vitis vinifera）、雷公藤（Tripterygium wilfordii）、棗（Ziziphus jujuba）、川桑（Morus notabilis）、栓皮櫧（Quercus suber）、核桃（Juglans regia）、木薯（Manihot esculenta）ADC 蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹。結果（圖2）表明，PbADC 蛋白與杜梨、秋子梨×西洋梨、蘋果和海棠ADC 親緣關系較近。同時使用DNAMAN 軟件對PbADC、杜梨、秋子梨×西洋梨、蘋果和湖北海棠ADC 蛋白的氨基酸序列進行多重序列比對分析，結果（圖3）顯示其整體一致性為96.66%，且均含一個完整的Orn_Arg_deC_N結構域，并具有2 個關鍵的酶活位點：氨基末端的賴氨酸（K）和羧基末端的半胱氨酸（C），并在第151～169 位殘基發(fā)現(xiàn)精氨酸脫羧酶家族2-磷酸吡哆醛結合位點。

圖2 PbADC 蛋白與部分物種ADC 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of PbADC protein and ADC protein of some species

圖3 PbADC 與其它同源蛋白的序列比對Fig.3 Sequence alignment of PbADC with other homologous proteins

2.3 PbADC 蛋白生物信息學分析

2.3.1 PbADC 理化性質分析 采用在線軟件ProtParam 預測了PbADC 的理化性質。PbADC 氨基酸殘基為730，其中甘氨酸（Gly，9.60%）、亮氨酸（Leu，10.10%）、絲氨酸（Ser，9.30%）、纈氨酸（Val，8.10%）和丙氨酸（Ala，8.60%）是該蛋白中最主要的幾種氨基酸；分子式為C3463H5406N940O1063S37，分子質量為78.403 ku；含正電（Arg+Lys）的氨基酸數(shù)58 個，含負電（Asp+Glu）的氨基酸數(shù)87 個；理論等電點為5.23，不穩(wěn)定系數(shù)為42.64（大于40），屬于酸性不穩(wěn)定蛋白。

2.3.2 PbADC 蛋白二、三級結構分析 使用SOPMA 和SWISS-MODEL 在線工具分析并預測了PbADC 的二、三級結構，結果顯示PbADC 蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成，其中α-螺旋占42.05%、無規(guī)則卷曲占35.48%、延伸鏈和β-轉角分別占15.48%和6.99%（圖4a 和4b）。

圖4 PbADC 蛋白的二、三級結構預測Fig.4 The prediction of secondary structure and tertiary structure of PbADC protein

2.3.3 PbADC 蛋白親水性分析 使用ExPASy-ProtScale 在線工具分析了PbADC 的親水性，結果表明PbADC 蛋白表面存在722 個親疏水基團，以第188 位氨基酸殘基（Met）的疏水能力最強，為2.567；在第143 位（Tyr）疏水能力最弱，為-2.111（圖5）。從總體上看，PbADC 蛋白表面的總親水位點數(shù)量（375 個）大于總疏水位點（347 個），且總平均親水系數(shù)為-0.044，說明該蛋白為親水蛋白。

圖5 PbADC 蛋白的親水性分析Fig.5 Hydrophilic analysis of PbADC protein

2.3.4 PbADC 蛋白細胞定位與信號肽分析 利用SignalP 4.1 Server 對PbADC 蛋白的信號肽進行了預測，發(fā)現(xiàn)前60 位氨基酸中最高的信號肽、初始剪切位點和綜合剪切位點的分值均低于0.5（圖6a），且信號肽預測的結果顯示為no，表明不存在信號肽。蛋白質的跨膜區(qū)域主要是指膜內(nèi)在蛋白和細胞膜的膜脂相結合的部位，為了尋找跨膜結構域，用TMHMM Server 在線工具對PbADC蛋白進行了預測，結果表明該蛋白的跨膜螺旋數(shù)量為0，沒有跨膜結構（圖6b）。綜上所述，推測PbADC 為一種非分泌蛋白，不會進入其它細胞器發(fā)揮作用。利用PSORT 和Cell-Ploc 在線軟件對PbADC 在細胞中的定位情況進行了預測，結果發(fā)現(xiàn)PbADC 蛋白主要存在于細胞質中。

圖6 PbADC 蛋白的細胞定位與信號肽分析Fig.6 Cell localization and signal peptide analysis of PbADC protein

2.4 PbADC 基因在鴨梨采后褐變過程中的表達模式分析

果心褐變指數(shù)是顯示褐變嚴重程度的一個重要指標，它既可看出整體果實的褐變情況，也可看出單個果心的褐變程度。不同處理組鴨梨果心的褐變指數(shù)隨貯藏時間的增加而增加（圖7a）。在貯藏120 d 時，急降和緩降處理組的鴨梨均出現(xiàn)了不同程度的果心褐變，褐變指數(shù)分別為0.217 和0.167。急速降溫和緩慢降溫兩個處理組相比，急速降溫處理組的果心褐變指數(shù)均高于緩慢降溫處理組（P<0.05），說明急速降溫處理加速了鴨梨的果心褐變。

圖7 PbADC 基因在鴨梨采后褐變過程中的表達模式分析Fig.7 Expression pattern analysis of PbADC gene during postharvest browning of Yali pear

精氨酸脫羧酶（ADC）作為多胺合成通路中的一個重要酶，對外界環(huán)境的脅迫響應最為敏感[24]。結果（7b）表明，在貯藏的前60 d，鴨梨ADC 基因上調(diào)表達，其中ADC 基因在緩降處理中的表達比急降處理高（P<0.05），并且緩降鴨梨的表達量最高為376.7。ADC 基因在鴨梨果心中的表達量雖隨貯藏時間延長而降低，但仍是緩降鴨梨的表達量高，說明緩慢降溫能促進鴨梨ADC 基因的表達，有助于其抵抗低溫脅迫導致的果心褐變。精氨酸脫羧酶在不同處理下均呈先升后降的變化趨勢，這與ADC 基因的表達情況基本一致（圖7c）。在整個貯藏期間，緩慢降溫處理下的ADC 酶活性均高于急速降溫處理（P<0.05），且在貯藏60 d 時，ADC 酶活性最高，為68.89 U/L。結合鴨梨果心褐變情況分析，整個貯藏期緩慢降溫處理組鴨梨果心褐變指數(shù)低，褐變情況少，可能是因為鴨梨果實中的ADC 酶活力較高，能夠合成大量的多胺，從而提高了鴨梨的抗冷性，降低了果心褐變的風險。

3 討論與結論

作為一種新型植物生長的調(diào)節(jié)劑或“第二信使”，多胺具有穩(wěn)定細胞膜、參與植物成熟衰老過程以及響應逆境等多種功能[25]。ADC 屬于磷酸吡哆醛依賴性酶（Pyridoxal 5＇－phosphate de-carboxylase，PLPDE）基因超家族Ⅲ型的重要成員，其含有1 個PLPDE 典型的Orn_Arg_deC_N 結構域，是生物體內(nèi)多胺生物合成的一個重要限速酶[17，26]。本研究發(fā)現(xiàn)鴨梨PbADC 基因序列最長ORF 為2 193 bp，編碼730 個氨基酸。鴨梨與柑橘和草莓等其它果樹具有相似的ADC 基因序列，柑橘PtADC 基因的ORF 含2 256 bp，編碼751 個氨基酸[27]；森林草莓FvADC 基因的ORF 含2 154 bp，編碼717 個氨基酸[28]。PbADC 蛋白是定位于細胞質的非分泌親水性不穩(wěn)定蛋白，二級結構以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，該結果與其它ADC 蛋白的細胞定位情況一致[27-29]。除此之外，本研究通過同源序列比對發(fā)現(xiàn) PbADC 包含完整的Orn_Arg_deC_N 結構域，含有家族保守的2-磷酸吡哆醛結合位點和兩個重要的酶活位點，這些與已有的一些物種的ADC 同源蛋白相吻合，是鑒定磷酸吡哆醛依賴性酶基因超家族Ⅲ型PLPDE 家族成員的關鍵結構域。

有研究表明，ADC 基因在植物抗逆中的作用較大。孫培培[30]研究表明，枳的PtADC 基因能夠提高柑橘的低溫耐受力，降低H2O2和超氧陰離子的積累。劉榮等[31]通過RACE 技術，從芒果中分離得到MiADC 基因，并發(fā)現(xiàn)其在轉錄水平上能夠受到低溫的調(diào)控，是一類對低溫具有應答作用的基因。孫虹麗[32]在梨褐皮與多胺代謝的研究中發(fā)現(xiàn)花后ADC 基因的表達量先增加后降低，這一現(xiàn)象與多胺的變化趨勢相吻合，是造成果皮褐色的主要因素。在貯藏初期，ADC 基因的表達量增加，其通過上調(diào)表達來提高對低溫的抗性，從而降低了緩降鴨梨果心褐變的發(fā)生。

本研究在鴨梨轉錄組數(shù)據(jù)中篩選并鑒定到了1 條由PbADC 基因編碼的序列，通過對該序列編碼的蛋白進行生物信息學分析，明確了其生物學特性，并利用qRT-PCR 方法分析了PbADC 基因在鴨梨采后果心褐變中的表達模式。綜上所述為進一步揭示鴨梨采后果心褐變發(fā)生機制奠定了理論基礎。