復(fù)合益生菌發(fā)酵培養(yǎng)基與凍干保護(hù)劑的篩選

張曉月，王 濤，左志晗，孫家塍，劉洪瑞，張晶晶，孫金生

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，益生菌由于能夠在一定程度上促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，因此應(yīng)用廣泛[1-2]，尤其是利用益生菌發(fā)酵生產(chǎn)的飼料產(chǎn)品越來越受到養(yǎng)殖業(yè)的青睞[3].目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中應(yīng)用的菌種比較匱乏且單一，可應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的菌種篩選也沒有新的突破.擺脫菌種結(jié)構(gòu)的單一性、提高應(yīng)用效果是急需解決的重要問題[4].益生菌制劑主要分為單一菌劑和復(fù)合菌劑，單一菌劑是指有效活菌是單一微生物的制劑，如芽孢桿菌制劑、酵母菌制劑等，單一菌劑雖然針對(duì)性較強(qiáng)、發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，但作用效果比較單一，很難應(yīng)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境復(fù)雜和水生生物疾病多樣的情況.復(fù)合菌劑是指由2 種以上微生物構(gòu)成的制劑，如芽孢桿菌與乳酸菌組成的復(fù)合微生物添加劑[5]，復(fù)合菌劑不僅具有多種功效，且相較于單一菌劑使用效果更加顯著，但大多質(zhì)量無法保證且無法滿足養(yǎng)殖行業(yè)的需求.如有些復(fù)合益生菌的搭配不夠科學(xué)，針對(duì)性不強(qiáng)，無法適用于不同的養(yǎng)殖環(huán)境和水體，常常不能夠發(fā)揮其應(yīng)有效果.

益生菌制劑在飼料加工、運(yùn)輸、貯存過程中容易失去活性[6]，也存在定植于動(dòng)物腸道時(shí)間較短或僅少數(shù)能定植在腸壁發(fā)揮作用[7]等問題，因此益生菌制劑的保存和制備方法尤為重要.菌種保存和發(fā)酵劑的制備是保證益生菌制劑能夠正常發(fā)揮原有效果的保障，可以保證菌種活性，減少益生菌制劑在保存及運(yùn)輸過程中的活性損失[8].現(xiàn)用于益生菌保存和制備的方法主要有真空干燥、冷凍干燥以及噴霧干燥法[9].其中真空冷凍干燥技術(shù)具有適用范圍廣、存活率高、保藏時(shí)間長(zhǎng)、菌種穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，同時(shí)在儲(chǔ)存和運(yùn)輸方面成本低且方便快捷[10-12]，是益生菌發(fā)酵劑制備較為理想的方法.可用于微生物凍干保護(hù)劑的物質(zhì)有很多，按照保護(hù)劑的性質(zhì)可分為多元醇類、糖類、蛋白質(zhì)類、氨基酸和肽類[13-14]，要根據(jù)微生物的不同使用適合的保護(hù)劑種類和濃度才能夠獲得較好的保護(hù)作用.

本課題組前期從健康水產(chǎn)動(dòng)物腸道中分離篩選出了4 株益生效果較好的動(dòng)物內(nèi)源性益生菌，即枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、格式乳球菌（Lactococcus garvieae）、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）和酵母菌（Yeast），本研究以4 株菌為實(shí)驗(yàn)菌株，進(jìn)行發(fā)酵共培養(yǎng)，通過無機(jī)鹽去除實(shí)驗(yàn)優(yōu)化初始培養(yǎng)基，通過凍干保護(hù)劑篩選實(shí)驗(yàn)選出適合的保藏保護(hù)劑.研究可為開發(fā)適合水產(chǎn)養(yǎng)殖用復(fù)合益生菌制劑提供實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

枯草芽孢桿菌（YA）、格式乳球菌（M4ⅡY）、施氏假單胞菌（JM）、酵母菌（Y），均由本實(shí)驗(yàn)室前期從水產(chǎn)動(dòng)物半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）腸道中分離鑒定，-80 ℃冰箱中保存.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

試劑：乙酸鈉、蛋白胨、磷酸氫二鉀，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；酵母粉、檸檬酸氫二銨，上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司；吐溫80，天津歆毅翎科技有限公司；牛肉浸粉，天津市寶坻區(qū)軍揚(yáng)生物試劑銷售中心；葡萄糖，天津市沃凱生物科技有限公司；硫酸鎂、硫酸錳，天津凱瑪特化工科技有限公司；TSB 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（HB4114-19）、YPD 液體培養(yǎng)基（HB5193-1）、MRS 肉湯培養(yǎng)基（海博#HB0384-1），青島海博生物技術(shù)有限公司.

凍干保護(hù)劑：可溶性淀粉、甘油，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；脫脂奶粉，蒙牛乳業(yè)集團(tuán)有限公司.

初始培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉浸粉5 g，酵母粉5 g，MgSO40.1 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二銨2 g，K2HPO42 g，MnSO40.05 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 值為7.4.

1.3 菌種活化及擴(kuò)大培養(yǎng)

將4 株益生菌由保藏狀態(tài)恢復(fù)到室溫狀態(tài)，使用一次性接種環(huán)分別將枯草芽孢桿菌與施氏假單胞菌菌液涂布于固體TSB 平板上，格氏乳球菌菌液涂布于MRS 平板，酵母菌菌液涂布于YPD 平板上.涂布后將平板置于培養(yǎng)箱中，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，待長(zhǎng)出單菌落后，重復(fù)上述步驟，再次活化.

1.4 培養(yǎng)基優(yōu)化（去除無機(jī)鹽）

以培養(yǎng)基中不去除任何無機(jī)鹽為對(duì)照組，逐一去除初始培養(yǎng)基中的各種無機(jī)鹽（硫酸鎂、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、硫酸錳），其余成分保持不變，配制成液體培養(yǎng)基，調(diào)pH 值到7.4，121 ℃條件下滅菌20 min. 待培養(yǎng)基冷卻后，將活化好的4 株菌（1×108mL-1），以2%的接種量同時(shí)接入到液體培養(yǎng)基中，各液體培養(yǎng)設(shè)置3 個(gè)平行. 置于搖床上，220 r/min、28 ℃培養(yǎng)15 h（時(shí)間依據(jù)每株菌的生長(zhǎng)曲線比對(duì)后確定）.將菌株的共培養(yǎng)液梯度稀釋后分別涂布于MRS、TSB、YPD 固體平板上，分別對(duì)4 株菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù).其中，枯草芽孢桿菌與施氏假單胞菌均涂布于TSB 培養(yǎng)基上.依據(jù)菌落形態(tài)區(qū)分計(jì)數(shù)：枯草芽孢桿菌菌落為多邊形，邊緣毛糙不整齊；施氏假單胞菌菌落為白色圓形，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊.

1.5 固定化吸附劑的選擇

1.5.1 吸附劑吸水性的比較

以稻殼粉、玉米芯粉、牡蠣殼粉和玉米粉4 種粉末作為吸附劑，分別稱取5 g，放入50 mL 燒杯中，每種吸附劑設(shè)置3 組平行，燒杯中加蒸餾水至吸附劑完全被水浸沒，靜置2 h 后過濾去除多余水分.稱量吸水飽和后吸附劑的質(zhì)量，并計(jì)算出各種吸水材料的吸水率.計(jì)算公式如下：

式中：m2為吸水飽和后吸附劑的質(zhì)量；m1為吸水前吸附劑的質(zhì)量.

1.5.2 吸附劑對(duì)于4 株菌吸附效果的比較

對(duì)4 株菌進(jìn)行菌種活化，同時(shí)接種于共發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行混菌發(fā)酵.稱取4 種吸附劑各2 g 于三角瓶中，向每個(gè)三角瓶中加入混菌發(fā)酵液20 mL，將其混勻.靜置吸附30 min 后取上清液，梯度稀釋后涂平板菌落計(jì)數(shù)，分析4 種吸附劑的吸附效果.

1.6 益生菌制劑的干燥

采用低溫真空冷凍干燥法對(duì)益生菌制劑進(jìn)行干燥處理.將活化好的混菌轉(zhuǎn)移到凍存管中，加入不同的保護(hù)劑混合均勻（設(shè)置3 個(gè)平行），先在4℃條件下預(yù)冷12 h，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中冷凍24 h，最后轉(zhuǎn)入低溫真空冷凍干燥機(jī)中處理26 h，得到凍干菌粉.

1.7 真空凍干保護(hù)劑的篩選

將活化好的混菌轉(zhuǎn)移到凍存管中，每個(gè)凍存管中加入不同含量不同種類的凍干保護(hù)劑：甘油，體積分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%、5%；脫脂奶粉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、8%、12%、16%、20%；可溶性淀粉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、8%、12%、16%、20%.每種保護(hù)劑的每個(gè)含量設(shè)置3 個(gè)平行，進(jìn)行低溫冷凍干燥.干燥后將凍干菌粉進(jìn)行復(fù)水并稀釋平板計(jì)數(shù)，對(duì)4 株菌的存活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并計(jì)算，計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化（去除無機(jī)鹽）

為實(shí)現(xiàn)4 株水產(chǎn)養(yǎng)殖用益生菌的共發(fā)酵培養(yǎng)并且保證每株菌的數(shù)量，需要找出能夠使它們共同生長(zhǎng)的培養(yǎng)基.根據(jù)4 株益生菌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)分別使用的培養(yǎng)基成分得出初始培養(yǎng)基成分，在利用該初始培養(yǎng)基進(jìn)行混菌發(fā)酵時(shí)，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌始終不生長(zhǎng).由于4 株菌所使用的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分均相似，只有無機(jī)鹽差別較大，推測(cè)可能是某種無機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)有一定的影響，因此設(shè)計(jì)去除無機(jī)鹽實(shí)驗(yàn)，分別統(tǒng)計(jì)去除某一種無機(jī)鹽后4 株益生菌的數(shù)量，結(jié)果如圖1 所示.

圖1 去除無機(jī)鹽后4 株益生菌的數(shù)量Fig.1 Quantity of four probiotic strains after removing of inorganic salts

由圖1（a）可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中分別去除檸檬酸氫二銨和硫酸鎂時(shí)，酵母菌的數(shù)量下降，顯著低于對(duì)照組的數(shù)量，說明這2 種無機(jī)鹽是酵母菌生長(zhǎng)不可缺少的成分；當(dāng)分別去除乙酸鈉和磷酸氫二鉀時(shí)酵母菌的數(shù)量也有所下降，但與對(duì)照組之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；去除硫酸錳對(duì)酵母菌沒有顯著影響.由圖1（b）可以看出，當(dāng)分別去除檸檬酸氫二銨和硫酸錳時(shí)，施氏假單胞菌的數(shù)量顯著下降，生長(zhǎng)受到限制，去除磷酸氫二鉀和乙酸鈉對(duì)施氏假單胞菌的數(shù)量沒有顯著影響，去除硫酸鎂時(shí)酵母菌的數(shù)量增加.由圖1（c）可以看出，培養(yǎng)基中分別去除檸檬酸氫二銨和硫酸錳時(shí)，格氏乳球菌的生長(zhǎng)受到顯著影響，而去除其他3 種無機(jī)鹽對(duì)其沒有顯著限制作用.由圖1（d）可以看出，培養(yǎng)基中只有去除了乙酸鈉枯草芽孢桿菌才能正常生長(zhǎng)，因此乙酸鈉是限制枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的最主要因素.

2.2 固定化吸附劑的選擇

2.2.1 吸附劑的吸水性

選取4 種常見吸附劑進(jìn)行吸水性的比較，分別計(jì)算每種材料的吸水量和吸水率，結(jié)果如圖2 所示.由圖2 可以看出，玉米芯粉的吸水率最高，為5.30%；其次是稻殼粉，吸水率為1.69%，每5 g 的平均吸水量為8.44 g；再次為玉米粉，吸水率為1.26%，每5 g 的平均吸水量為6.29 g；牡蠣殼粉的吸水效果最差，吸水率為0.70%，每5 g 的平均吸水量為3.48 g.

圖2 不同吸附劑的吸水性Fig.2 Water absorption of different adsorbents

2.2.2 吸附劑對(duì)4 株菌的吸附效果

比較4 種吸附劑對(duì)益生菌的吸附效果，結(jié)果如圖3 所示.由圖3 可以看出，4 種吸附材料對(duì)不同菌株表現(xiàn)出不同的吸附能力.綜合來看，牡蠣殼粉對(duì)酵母菌和格氏乳球菌的吸附效果最好，上清液中剩余的菌株濃度分別為3.95×107mL-1和14.0×107mL-1；對(duì)施氏假單胞菌和枯草芽孢桿菌吸附效果較差，上清液中剩余的菌株濃度分別為7.77×107mL-1和8.73×106mL-1.稻殼粉與牡蠣殼粉的吸附效果相似，對(duì)酵母菌和格氏乳球菌表現(xiàn)出較好的吸附效果，上清液中剩余菌株濃度分別為2.25×108mL-1和1.71×108mL-1；對(duì)枯草芽孢桿菌和施氏假單胞菌的吸附效果較差.比較4 種吸附劑，玉米粉對(duì)4 株菌都有較強(qiáng)的吸附性，上清液中菌體濃度總體上低于其他3 種吸附劑，尤其對(duì)枯草芽孢桿菌和施氏假單胞菌有顯著吸附效果，上清液中菌體剩余濃度分別為4.53×106mL-1和1.73×107mL-1.而玉米芯粉只對(duì)枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出顯著吸附效果，上清液中剩余菌株濃度為0.46×106mL-1，對(duì)施氏假單胞菌、格氏乳球菌、酵母菌都表現(xiàn)出較差的吸附效果.因此最終將玉米粉確定為4 株菌混合發(fā)酵制劑的固定化吸附劑.

圖3 不同吸附劑對(duì)益生菌的吸附效果Fig.3 Adsorption effect of different adsorbents on four probiotic strains

2.3 真空凍干保護(hù)劑的篩選

為了使益生菌制劑便于施用和保存，采用真空冷凍干燥技術(shù)，將混菌菌液干燥制成粉末制劑.在此過程中凍干保護(hù)劑的選擇對(duì)最終制劑中菌種的活性至關(guān)重要，因此本研究對(duì)可溶性淀粉、甘油和脫脂奶粉這3 種凍干保護(hù)劑的作用效果進(jìn)行了比較，結(jié)果如圖4 所示.

圖4 凍干保護(hù)劑對(duì)益生菌的保護(hù)效果Fig.4 Protective effect of freeze-drying protective agents on four probiotec strains

由圖4（a）可以看出，可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)，枯草芽孢桿菌的存活率可達(dá)42.3%，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高到12%時(shí)菌株存活率為42.6%，達(dá)到最高，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高到16%及以上時(shí)枯草芽孢桿菌的存活率均無明顯變化；可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%～12%時(shí)，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，格氏乳球菌和酵母菌的存活率逐漸升高，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到12%時(shí)，二者的存活率均達(dá)到最高，分別為52.3%和71.3%，可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)再升高到16%及20%時(shí)，二者的存活率無明顯變化；而施氏假單胞菌在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%的可溶性淀粉中存活率最高，為70.3%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高到20%對(duì)其存活率幾乎沒有影響.由圖4（b）可以看出，甘油作為保護(hù)劑時(shí)，枯草芽孢桿菌、格氏乳球菌和酵母菌在18%的甘油保護(hù)下存活率最高，分別達(dá)到55.3%、69.9%和67.3%，甘油體積分?jǐn)?shù)升高到22%及以上對(duì)枯草芽孢桿菌、格氏乳球菌的活性無明顯影響，但酵母菌的活性開始降低；而施氏假單胞菌在14%的甘油中存活率最高，達(dá)63.3%，甘油體積分?jǐn)?shù)升高到22%及以上時(shí)其活性開始降低.由圖4（c）可以看出，脫脂奶粉作為保護(hù)劑時(shí)，枯草芽孢桿菌和施氏假單胞菌在20%的脫脂奶粉中存活率最高，分別為72.3%和64.0%，格氏乳球菌在16%的脫脂奶粉中存活率最高，可達(dá)76.7%，酵母菌在8%和16%的脫脂奶粉中存活率相近并達(dá)到最高，分別為65.0%和65.1%，脫脂奶粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步升高對(duì)4 個(gè)菌株的存活率均無顯著影響. 綜合來看，3 種凍干保護(hù)劑中脫脂奶粉對(duì)4 株菌的保護(hù)效果最好.

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)枯草芽孢桿菌、格式乳球菌、施氏假單胞菌和酵母菌進(jìn)行發(fā)酵共培養(yǎng)，制成復(fù)合益生菌制劑，探究培養(yǎng)基中無機(jī)鹽、吸附劑和凍干保護(hù)劑對(duì)復(fù)合制劑的影響.合適的共發(fā)酵培養(yǎng)基可以實(shí)現(xiàn)復(fù)合益生菌制劑中菌株的共培養(yǎng)[15].培養(yǎng)基是實(shí)現(xiàn)共發(fā)酵培養(yǎng)的關(guān)鍵，不同組分對(duì)不同微生物產(chǎn)生的影響也不相同，組分間也會(huì)有交互作用，對(duì)微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生影響.本研究對(duì)4 株菌共發(fā)酵初始培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化與篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在去除乙酸鈉的培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌才會(huì)生長(zhǎng)，而對(duì)其余菌株生長(zhǎng)影響不顯著；在共發(fā)酵培養(yǎng)基中分別去除檸檬酸氫二銨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀和硫酸錳4 種無機(jī)鹽均會(huì)對(duì)某些菌株的生長(zhǎng)造成抑制，所以4 種無機(jī)鹽在共發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加十分必要.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在共發(fā)酵過程中保證碳源、氮源兩大營(yíng)養(yǎng)要素的前提下，無機(jī)鹽的種類對(duì)微生物的生長(zhǎng)至關(guān)重要，后期將會(huì)進(jìn)一步優(yōu)化無機(jī)鹽和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分的含量.Niu 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，微生物對(duì)無機(jī)鹽的需求量很少，通常低濃度起促進(jìn)作用，而高濃度可能會(huì)產(chǎn)生抑制，最適的無機(jī)鹽種類及濃度需根據(jù)菌種的生理特性等條件確定，這與本研究結(jié)果相似.現(xiàn)階段復(fù)合益生菌制劑在生產(chǎn)和加工過程中面臨的主要問題為菌體易受外界影響而失活，本研究發(fā)現(xiàn)，在制劑加工過程中，共發(fā)酵培養(yǎng)基中無機(jī)鹽成分及比例對(duì)菌株的生長(zhǎng)有顯著影響.

微生物應(yīng)用過程中，游離分散的細(xì)胞易受到環(huán)境因子的影響，導(dǎo)致菌的活性及密度不高，進(jìn)而影響整個(gè)生物反應(yīng)過程[17].針對(duì)這一問題，微生物固定化技術(shù)越來越受到研究者關(guān)注，該技術(shù)主要采用物理或化學(xué)方法將微生物通過吸附、共價(jià)結(jié)合、截留及包埋等方式固定在特定材料中，再將整體加入到反應(yīng)體系中，以此提升微生物活性與密度[18-19].本研究首先通過固定化吸附劑對(duì)比實(shí)驗(yàn)，確定了菌株發(fā)酵液在進(jìn)行凍干之前所需的最佳固定化吸附劑，4 種常用的固定化吸附劑牡蠣殼粉、稻殼粉、玉米粉和玉米芯粉中，最適合做4 株菌發(fā)酵液固定化吸附劑的是玉米粉.與其他3 種吸附劑相比，玉米粉對(duì)4 株菌都有較強(qiáng)的吸附性.吸水性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4 種吸附劑中，玉米粉的吸水效果較差，但是對(duì)菌體有較強(qiáng)的的吸附性，由此說明吸水性好的固定化吸附劑不一定對(duì)菌體的吸附效果好，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，不能盲目選擇.

液態(tài)的益生菌制劑通常對(duì)包裝和保存條件要求較高，且容易造成菌體活性降低，不利于市面上流通及使用[20].真空冷凍干燥技術(shù)可將液態(tài)的益生菌制成固態(tài)的益生菌制劑，菌粉水分含量低，有利于長(zhǎng)期保存，菌體存活率較高，發(fā)酵活力較好，遺傳特性穩(wěn)定[21]，是目前制備微生態(tài)制劑的常用方法[22-23].然而，菌體在冷凍干燥過程中會(huì)暴露在額外的應(yīng)激壓力下，細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，再結(jié)晶過程中會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成損傷，降低成品活性[24]，所以凍干保護(hù)介質(zhì)成為提升菌體存活率的重要影響因素. 實(shí)際操作中由于益生菌細(xì)胞的差異，不同的凍干保護(hù)劑對(duì)不同菌體的保護(hù)效果有很大差異[25]，如脫脂奶粉常用作乳酸菌的凍干保護(hù)劑，且效果較好[26].本研究進(jìn)行了凍干保護(hù)劑篩選實(shí)驗(yàn)，采用的甘油、可溶性淀粉和脫脂奶粉均為常見的凍干保護(hù)劑.用3 種凍干保護(hù)劑對(duì)共培養(yǎng)的4 株菌進(jìn)行凍干保護(hù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，脫脂奶粉保護(hù)效果最好，每種菌的活性均可達(dá)到64%以上，脫脂奶粉最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定為16%，將其作為復(fù)合制劑的凍干保護(hù)劑.昝繼清等[27]在精釀啤酒酵母SCE14 凍干保護(hù)劑的篩選優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，保護(hù)劑海藻糖、蔗糖、脫脂奶粉作為凍干保護(hù)劑效果較好；陳顏紅等[28]在植物乳桿菌LP-7501S 凍干保護(hù)劑優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，效果較好的保護(hù)劑為脫脂奶粉、山梨醇、蔗糖，而海藻糖作用效果不顯著.由此可見，同一種保護(hù)劑對(duì)不同菌株作用效果不同，需要依據(jù)復(fù)合菌株的綜合特性選擇凍干保護(hù)劑.

本研究通過初始培養(yǎng)基中單一無機(jī)鹽去除實(shí)驗(yàn)，確定了4 株水產(chǎn)養(yǎng)殖用益生菌的復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)基.通過固定化吸附劑和凍干保護(hù)劑的對(duì)比篩選實(shí)驗(yàn)，確定了復(fù)合益生菌使用的固定化吸附劑和凍干保護(hù)劑及其最佳使用濃度，為后續(xù)復(fù)合益生菌制劑的開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).