曲霉強(qiáng)化發(fā)酵對瀏陽豆豉風(fēng)味品質(zhì)的影響

吳梓仟，劉晶晶，鄧高文，周 曉，蔣立文，胡嘉亮，覃業(yè)優(yōu)，劉 洋,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南壇壇香食品科技有限公司，湖南 長沙 410128）

豆豉歷史悠久，因其營養(yǎng)價值較高且香氣特殊深受廣大消費者喜愛。瀏陽豆豉是湖南傳統(tǒng)特色發(fā)酵豆制品，其歷史可追溯至唐代。在湘菜中，瀏陽豆豉具有增鮮提味的作用，名菜“臘味合蒸”“蒸鮮魚”，便是以其作佐料，如此才有“南方人不可一日無豉”[1]的說法。瀏陽豆豉為曲霉型豆豉代表，以黑豆為原料，經(jīng)過清洗、浸泡、蒸煮、攤涼冷卻、制曲、晾霉、洗霉、渥堆、轉(zhuǎn)桶、渥堆、出曬等工序制成。傳統(tǒng)的制曲工藝多采用自然發(fā)酵，以曲霉為優(yōu)勢菌與其他微生物共同作用分泌眾多酶系，將原料中的蛋白質(zhì)、碳水化合物等大分子物質(zhì)降解，經(jīng)過復(fù)雜的生化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)[2-3]。然而由于傳統(tǒng)豆豉發(fā)酵呈開放式，發(fā)酵過程中易受氣候、溫度、濕度等自然條件的影響，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定。

純種發(fā)酵可以提高產(chǎn)品的安全性及縮減產(chǎn)品的生產(chǎn)周期，但是產(chǎn)品品質(zhì)往往不及自然發(fā)酵。文鶴等[4]利用從曲霉型豆豉后發(fā)酵過程中分離篩選得到的1 株產(chǎn)香酵母WLW用于純種豆豉發(fā)酵，結(jié)果顯示自然發(fā)酵豆豉中共檢測出87 種揮發(fā)性成分，而純種發(fā)酵豆豉中僅檢測出44 種揮發(fā)性成分，遠(yuǎn)不如自然發(fā)酵風(fēng)味豐富。李薇[5]因永川豆豉發(fā)酵周期長，利用純種米曲霉（Aspergillusoryzae）制曲制做“速成豆豉”，盡管生產(chǎn)效率有所提升，但由于純種發(fā)酵參與微生物較少造成酶系單一，“速成豆豉”的揮發(fā)性物質(zhì)的含量與數(shù)量均低于傳統(tǒng)發(fā)酵，導(dǎo)致風(fēng)味不及傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉。相比純種發(fā)酵，強(qiáng)化發(fā)酵（將一種或多種外源微生物接入到未經(jīng)滅菌的原料中進(jìn)行發(fā)酵的方式）既可以模擬自然發(fā)酵過程中多菌株共同發(fā)酵的特點，又有利于控制微生物，降低品控風(fēng)險，是實現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品工業(yè)化生產(chǎn)的重要途徑。劉琨毅等[6]利用地衣芽孢桿菌強(qiáng)化發(fā)酵普洱茶，結(jié)果顯示強(qiáng)化發(fā)酵可以明顯改善茶葉中的特征成分；Pang Xiaona等[7]選擇具有高酒精耐受性和酯酶活性的本土乳酸菌對白酒進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵，最終表明強(qiáng)化發(fā)酵可有效促進(jìn)白酒中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)乙酸乙酯的形成，從而改善白酒風(fēng)味；Merlo等[8]通過利用植物乳桿菌強(qiáng)化發(fā)酵果汁，改善了發(fā)酵果汁的味道。但目前瀏陽豆豉強(qiáng)化發(fā)酵的研究鮮有報道。

本實驗室前期從瀏陽豆豉中鑒定并分離純化出2 株不產(chǎn)毒的優(yōu)勢黃曲霉（A.flavus）菌株[9]，但其對瀏陽豆豉風(fēng)味品質(zhì)的影響還有待進(jìn)一步研究。鑒于此，以陜西小黑豆為原料，采用自然發(fā)酵（NF）、A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵、優(yōu)勢菌株（A.flavus7214、A.flavus7622）強(qiáng)化發(fā)酵以及優(yōu)勢混菌發(fā)酵（A.flavus77，A.flavus7214∶A.flavus7622=1∶1）5 種發(fā)酵方式制備瀏陽豆豉。通過對比強(qiáng)化發(fā)酵豆豉與NF豆豉的感官評定、游離氨基酸含量、有機(jī)酸含量、揮發(fā)性成分組成以及電子鼻評價結(jié)果，科學(xué)地評價強(qiáng)化發(fā)酵對瀏陽豆豉風(fēng)味品質(zhì)的影響。這對瀏陽豆豉的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化、可控化及數(shù)字化控制具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：實驗室從瀏陽豆豉分離純化得到的優(yōu)勢菌株A.flavus7214（實驗室自藏）與A.flavus7622（CGMCC 20735）；A.flavus77（將A.flavus7214和A.flavus7622等比例混合）；A.oryzae購于濟(jì)寧玉園生物科技有限公司。

麩皮 億鄉(xiāng)情名優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品創(chuàng)業(yè)店；黑豆（陜西腎型小黑豆）湖南壇壇香食品科技有限公司；氯化鈉、乙腈、甲醇、無水乙醇、磷酸（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；16 種氨基酸標(biāo)品、7 種有機(jī)酸標(biāo)品（均為優(yōu)級純）長沙隆和化波實驗用品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100 services型島津LC-20a液相色譜儀、7890B 5977型氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀美國Agilent 公司；PEN3 電子鼻 德國Airsense公司；TG16-WS型臺式高速離心機(jī) 湘潭湘儀儀器有限公司；DFY-10000D型搖擺式高速磨粉機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；BSa224S分析天平 德國Sartorius有限公司；57330-U型手動SPME進(jìn)樣器、57310-U型聚二甲基硅氧烷萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 瀏陽豆豉的制備

1.3.1.1 強(qiáng)化菌株制備

按照麩皮∶蒸餾水=1∶0.95混勻作為菌種擴(kuò)配的培養(yǎng)基，加入到300 mL錐形瓶中（1.5 cm厚）；121 ℃高壓蒸汽鍋滅菌25 min。冷卻至室溫，把保存菌種斜面接入到培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h。

1.3.1.2 工藝流程

選擇新鮮的黑豆→清洗→浸泡→蒸煮（2 h）→攤涼冷卻→NF/強(qiáng)化發(fā)酵制曲（3～7 d，28～35 ℃）→晾霉（1～2 d）→洗霉→渥堆（1～2 d，室溫）→轉(zhuǎn)桶（加3%鹽）→渥堆（1～2 d，室溫）→出曬（1～2 d）→成品

1.3.2 游離氨基酸測定

參照GB/T 30987—2020《植物中游離氨基酸的測定》[10]，采用高效液相色譜法。

1.3.3 有機(jī)酸測定

參考GB/T 5009.157—2016《食品中有機(jī)酸的測定》[11]，采用高效液相色譜法。有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線特征Table 1 Retention times and quantitative calibration curves for organic acids

1.3.4 電子鼻測定

參考Wang Shuyan等[12]電子鼻測定方法并稍作修改。直接將進(jìn)樣針頭插入含樣品的密封樣品瓶中進(jìn)行測定。測定條件：采樣時間1 s/組；傳感器自清洗時間120 s；傳感器歸零時間10 s；樣品準(zhǔn)備時間5 s；進(jìn)樣流量600 mL/min；分析采樣時間120 s。電子鼻傳感器性能描述如表2所示。

表2 傳感器性能描述Table 2 Sensor performance description

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

1.3.5.1 豆豉香味物質(zhì)的提取

將萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口，在250 ℃老化25 min；與此同時將2 g樣品與20 mL飽和氯化鈉溶液放置于50 mL頂空瓶中，將頂空瓶置于恒溫水浴磁力攪拌鍋中，在70 ℃預(yù)熱10 min，將老化完畢的萃取頭穿過密封墊插入頂空進(jìn)樣瓶內(nèi)后推出纖維頭（距離樣品表面約10 mm），頂空吸附40 min后插入氣相色譜進(jìn)樣口解吸5 min即可。

1.3.5.2 豆豉香味物質(zhì)的分析鑒定

采用GC-MS對提取出來的香味物質(zhì)進(jìn)行分析。CD-WAX石英毛細(xì)管柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣（He），流速1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流進(jìn)樣。程序升溫：起始柱溫為40 ℃，保持5 min后，以3 ℃/min的速率升溫至140 ℃保持5 min，再以5 ℃/min的速率升溫至210 ℃保持10 min，最后以5 ℃/min的速率升溫至240 ℃保持3 min。MS條件：電子電離源；接口溫度220 ℃，離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z45～500。

1.3.5.3 豆豉香味物質(zhì)的定性定量分析

利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST 20對揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，采用面積百分比法計算揮發(fā)性化合物的相對含量。

1.3.6 感官評價

參考并修改張佳男[13]感官評定方法。采用排序試驗法對不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵瀏陽豆豉成品進(jìn)行感官評價，感官評價于（25±2）℃的感官評價室進(jìn)行，對5 位來自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院的科研人員進(jìn)行感官評定培訓(xùn)。滋味強(qiáng)度采用10 點線性坐標(biāo)，0（極弱）～10（極強(qiáng)），品評人員對每個樣品與標(biāo)品進(jìn)行比較打分，其中2.5/5/7.5/10 分分別對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品含量，具體感官評價打分標(biāo)準(zhǔn)參考表3。

表3 感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Criteria for sensory evaluation of Douchi

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件、WinMuster、GM-MS分析軟件等分析實驗數(shù)據(jù)；用Excel、DataGraph、OmicStudio tools（https://www.omicstudio.cn/tool）等進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉游離氨基酸結(jié)果分析

發(fā)酵時，大豆中蛋白質(zhì)被微生物分泌的蛋白酶分解為多肽和游離氨基酸[14-15]。由圖1可知，利用A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉，豆豉中的游離氨基酸總量下降40.70%，而分離菌株強(qiáng)化發(fā)酵可提升游離氨基酸總量，范圍為19.6%～104.3%，其中A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉和A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中游離氨基酸總量最高，分別為12.30%與10.40%，這可能與A.flavus7214具有高產(chǎn)蛋白酶有關(guān)[9]。通常，游離氨基酸具有一定的呈味特性，如鮮味（天冬氨酸、谷氨酸）、甜味（蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸）和苦味（纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸）等，對形成豆豉的特殊風(fēng)味具有重要意義[8]。豆豉中苦味氨基酸的含量占比最高（A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉排居首位為4.03%，A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉次之為3.36%，A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉最低為1.57%），其次是鮮味氨基酸、甜味氨基酸，這與康蕾等[16]對不同單菌制曲豆醬氨基酸研究分析一致。此外，游離氨基酸中呈鮮味的谷氨酸含量占比最高，結(jié)果與大豆原料中含有較高的谷氨酸結(jié)論吻合[18]，其中，谷氨酸在A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中含量最高（2.23%），A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉次之（1.98%）。甜味氨基酸與鮮味間存在協(xié)同作用，可使鮮味增強(qiáng)[17]。甜味氨基酸含量最高的樣品為A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉及A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉，最低為A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉，含量分別為2.03%、1.67%及0.55%。

圖1 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵瀏陽豆豉游離氨基酸含量Fig.1 Free amino acid contents in Liuyang Douchi fermented by different strains

2.2 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉有機(jī)酸成分分析

有機(jī)酸有助于穩(wěn)定豆豉香氣、提高豆豉品質(zhì)[19]。如圖2所示，按照不同菌種發(fā)酵瀏陽豆豉有機(jī)酸總含量由大到小進(jìn)行排序為A.flavus7622＞A.flavus77＞A.flavus7214＞A.oryzae＞NF，可知瀏陽豆豉有機(jī)酸含量因強(qiáng)化發(fā)酵而提升，增幅范圍在0.08～0.55 mg/g之間。所有樣品中草酸、酒石酸以及蘋果酸的含量均不足0.05 mg/g，且閾值較高，對風(fēng)味影響的不明顯。乳酸、乙酸、檸檬酸和丁二酸含量較高且各樣品間差異較大。其中乳酸為酯類物質(zhì)的前體物質(zhì)，酯類香氣化合物可因乳酸含量的增加而增多，并且由于乳酸具有柔和的口感，因此也會使豆豉的口感順滑綿長[20]，除A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉外，其余樣品中乳酸含量較NF豆豉均有增加，A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中增加幅度最大（57.24%）。乙酸味道刺激[21]，低濃度時可使豆豉口感豐富，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中乙酸均出現(xiàn)不同程度的增長（0.01～0.39 mg/g），上調(diào)最大的為A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉。有報道稱乳酸與乙酸比值越大，產(chǎn)品口感越柔和[22]，NF豆豉比值最高，約為119。檸檬酸酸味較強(qiáng)，口感圓潤清爽[23]，A.flavus77與A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵的豆豉中檸檬酸含量分別增加了0.10 mg/g和0.11 mg/g。丁二酸又名琥珀酸，具有酸味、咸味、苦味等特點，且呈味閾值低，對豆豉的風(fēng)味具有重要影響[21]。A.oryzae、A.flavus7214與A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中丁二酸的含量較高，特別是A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉（0.28 mg/g）。

圖2 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵瀏陽豆豉有機(jī)酸含量Fig.2 Contents of organic acids in Liuyang Douchi fermented by different strains

2.3 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉揮發(fā)性成分分析

5 種不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵的瀏陽豆豉經(jīng)過GC-MS分析共鑒定出了9 類化合物，共92 種物質(zhì)，分別為酯類（20 種）、酸類（11 種）、醛類（12 種）、酮類（9 種）、醇類（7 種）、吡嗪類（8 種）、烷烴類（10 種）、酚類（7 種）和其他化合物（8 種）。根據(jù)圖3a可知，不同樣品檢出的風(fēng)味物質(zhì)組成差異明顯。NF中吡嗪類及酸類為主要化合物，分別占其總揮發(fā)性物質(zhì)的33.84%與17.48%。A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉則以酸類（24.62%）、醛類（16.37%）為主；分離菌株中，A.flavus77與A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的酸類與醛類占比最多，相較于NF均有不同程度提高，A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉分別增長17.55%和7.9%，A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉分別提升25.76%和6.28%。A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉則以酸類（13.98%）及吡嗪類（13.15%）為主，對比NF，前者上升11.21%，后者下降6.84%。整體而言，酸類、醛類和吡嗪類是5 種不同菌種發(fā)酵瀏陽豆豉的主要化合物。N F 豆豉及強(qiáng)化發(fā)酵豆豉（A.oryzae、A.flavus7214、A.flavus7622和A.flavus77）中分別被檢測出51、57、46、41、43 種揮發(fā)性化合物，而5 種不同菌種豆豉共有的化合物僅20 種（圖3b），如乙酸、3-甲基丁醛、苯甲醛、苯乙醛、四甲基吡嗪、2-甲氧基苯酚等，而5 種不同菌種豆豉樣品的特有成分分別有12、11、7、5 種以及2 種，表明強(qiáng)化發(fā)酵能夠影響豆豉的揮發(fā)性物質(zhì)的形成，進(jìn)一步影響豆豉香氣。

圖3 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵瀏陽豆豉各揮發(fā)性化合物種類相對含量（a）和數(shù)量Venn圖（b）Fig.3 Relative contents of volatile compounds (a) and Venn diagram of numbers of volatile compound species (b) in Liuyang Douchi fermented by different strains

大多數(shù)酯類產(chǎn)生香味可使人心情愉悅，能夠賦予豆豉花果的香氣[24-25]。如表4所示，A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中酯類化合物相對含量最高，A.flavus7214略低，NF與A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中酯類化合物相對含量最低。3-甲基-1-丁醇乙酸酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、2-乙酸苯乙酯為5 種樣品共有物質(zhì)，但相對含量少且樣品間差異不明顯。苯乙酸甲酯、2-羥基-3-苯基丙酸乙酯、十六烷酸甲酯、亞油酸乙酯、2-甲基丁酸乙基酯、9,15-十八碳二烯酸甲酯、十八碳烯酸乙酯、十八烷酸乙酯均為強(qiáng)化發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物。其中亞油酸乙酯僅在A.flavus7622和A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中存在，且在A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中相對含量較高（4.95%），亞油酸乙酯是一種能產(chǎn)生果香味的高級脂肪酸[21]，能使瀏陽豆豉香味更加協(xié)調(diào)、濃郁。

表4 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵瀏陽豆豉揮發(fā)性成分Table 4 Volatile components of Liuyang Douchi fermented by different strains

醛類物質(zhì)主要由不飽和脂肪酸的氧化以及Strecker降解兩條路徑產(chǎn)生，閾值較低，對豆豉風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[26-27]。如表4所示，5 種樣品的醛類化合物相對含量由大到小分別為：A.oryzae、A.flavus7214、A.flavus7622、A.flavus77、NF。其中3-甲基丁醛、苯甲醛和苯乙醛相對含量最高，且為5 種豆豉的共有物質(zhì)。3-甲基丁醛具有獨特的麥芽味、堅果味、巧克力味，閾值較低（0.06 μg/kg）[28-29]，其在A.oryzae與A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中相對含量最高，比NF分別提升了127.70%與98.65%。苯甲醛廣泛存在于植物中，具有堅果香味，可為豆豉提供類似醬油的咸香和醬香[30]。與NF豆豉相比，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中苯甲醛均有不同程度增加，其中A.flavus7214與A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵對苯甲醛相對含量提升幅度最大（均為69%）。苯乙醛可為豆豉提供花香、甜香、蜂蜜香[31]。強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中苯乙醛相對含量均高于NF豆豉。強(qiáng)化發(fā)酵還會產(chǎn)生一些新的物質(zhì)，反-2-壬烯醛為A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的特征成分，其主要由酯類與游離脂肪酸反應(yīng)及糖化時不飽和脂肪酸氧化而產(chǎn)生[32]，呈現(xiàn)出黃瓜味與烤肉味[33]。2-庚醛則為A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的特征成分，具有草香氣味[34]。2-八烯醛僅在A.flavus7214及A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中產(chǎn)生，可給予豆豉似黃瓜的清香味[35]。

吡嗪是由蛋白質(zhì)/氨基酸熱分解及蛋白質(zhì)/氨基酸與糖發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生[36]。如表4所示，5 種樣品中，NF的吡嗪類物質(zhì)相對含量最高，其次依次是A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉、A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉、A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉及A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉。四甲基吡嗪與2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪是5 種樣品共有的物質(zhì)。呈現(xiàn)醬香味的四甲基吡嗪相對含量最多，通常與細(xì)菌代謝有關(guān)[30]，強(qiáng)化發(fā)酵時曲霉數(shù)量的增加可能導(dǎo)致細(xì)菌增殖和代謝被抑制，因此強(qiáng)化發(fā)酵豆豉所產(chǎn)生的四甲基吡嗪相對含量不及NF豆豉。

酸類物質(zhì)多具有刺激性氣味[37]，如表4所示，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中酸類化合物相對含量均高于NF豆豉，其中A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中酸類化合物相對含量最高（43.21%）。乙酸是相對含量最高的酸類化合物，相較于NF豆豉，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中乙酸相對含量均有不同程度增加，A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉相對含量提升幅度最大，為9.38%，此結(jié)果與有機(jī)酸結(jié)果不一致，可能由于在發(fā)酵過程中豆豉會同時產(chǎn)生揮發(fā)性和非揮發(fā)性酸，而使用GC-MS檢測未經(jīng)處理的樣品時，僅可識別到樣品中揮發(fā)性酸[38]。

酚類物質(zhì)一般呈現(xiàn)煙熏香與木香[39]，如表4所示，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的酚類化合物相對含量不及NF豆豉高。醇類物質(zhì)多來源于微生物對糖/氨基酸的發(fā)酵代謝作用[26]，其相對含量總量為A.oryzae＞A.flavus7622＞NF＞A.flavus7214＞A.flavus77。酮類化合物一般通過不飽和脂肪酸氧化/降解及氨基酸降解產(chǎn)生，通常表現(xiàn)出花香和果香[40]。但其在5 種樣品中整體差異不大，且相對含量較低，對風(fēng)味的貢獻(xiàn)有限。烴類化合物盡管相對含量不低，但其閾值通常較高，因此對產(chǎn)品風(fēng)味貢獻(xiàn)不大[41]。

2.4 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉電子鼻結(jié)果分析

如圖4a所示，不同傳感器對樣品表現(xiàn)出不同的響應(yīng)強(qiáng)度，其中W5S（靈敏度大，對氮氧化合物靈敏）、W1S（對短鏈烷烴靈敏）、W1W（對硫化物靈敏）、W2W（芳香成分，對有機(jī)硫化物靈敏）四個傳感器對豆豉的響應(yīng)值較高（響應(yīng)值＞4）。A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉在W1S的響應(yīng)值最高，可見其短鏈烷烴含量較多，A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵的瀏陽豆豉在W5S、W1W、W2W的響應(yīng)值最高，說明A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵的豆豉中氮氧化合物、芳香化合物以及硫化物含量較高。各樣品在其余6 個傳感器的響應(yīng)值較低且差異較小。整體上看，NF和A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的雷達(dá)分析圖譜幾乎重疊，提示這兩種發(fā)酵方式生產(chǎn)的豆豉主要揮發(fā)性化合物較為相似。

圖4 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵瀏陽豆豉電子鼻雷達(dá)（a）及PCA（b）圖Fig.4 Radar map (a) and PCA plot (b) of Liuyang Douchi fermented by different strains based on electronic nose data

選取80～83 s的信號作為電子鼻分析的時間點，每個樣品平行測定4 次進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。PCA是將采集到的傳感器響應(yīng)值信號進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換、降維，并將其線性分類，包含PC1、PC2方差貢獻(xiàn)率。方差貢獻(xiàn)率越高，說明該指標(biāo)能較好地反映原多指標(biāo)信息。一般情況下，總貢獻(xiàn)率在70%～80%以上時可使用[42]。由圖4b可知，5 種樣品在PC1貢獻(xiàn)率為91.61%，PC2貢獻(xiàn)率為7.78%，累計貢獻(xiàn)率為99.39%，基本涵蓋了樣品的大部分原始信息，且差異主要表現(xiàn)在PC1上。不同菌種瀏陽豆豉樣品在氣味上有所差異，A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉與NF豆豉部分重疊，可見其氣味相近。A.flavus7214樣品與其他4 種樣品相互之間距離相對較遠(yuǎn)，其氣味與其他4 種樣品區(qū)別較大。

2.5 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉感官評價結(jié)果分析

如圖5所示，A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉香味得分明顯高于其他樣品，A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉評分最低。這可能因為A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中對香味貢獻(xiàn)最大的酯類、醛類以及酸類成分均明顯高于NF（圖3a）。在滋味方面，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的鮮味與咸味增加最明顯。鮮味在5 種樣品中普遍較強(qiáng)，根據(jù)李學(xué)賢等[17]對游離氨基酸改善作物風(fēng)味的綜述內(nèi)容可推測與甜味氨基酸與鮮味的協(xié)同作用有關(guān)（圖1）。從結(jié)果看，分離菌株強(qiáng)化發(fā)酵可以增進(jìn)豆豉的鮮味，尤其是A.flavus7214及A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉鮮味強(qiáng)度較高，較NF相比評分高約30%，與鮮味游離氨基酸結(jié)果一致（圖1）。A.flavus77的咸味提升最明顯（從3.6 分升至5.0 分），這可能是由于豆豉中濃度較高的鮮味氨基酸提升了舌頭對咸味的感知[43]。適當(dāng)?shù)乃嵛犊梢越o豆豉滋味增加一定層次感，僅A.flavus77發(fā)酵豆豉強(qiáng)度低于NF，A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉酸味較強(qiáng)（4.0 分），與有機(jī)酸結(jié)果有較小差異，可能與有機(jī)酸之間的協(xié)同、掩蔽及抑制作用有關(guān)[22]，同時有機(jī)酸閾值高低也會對感官結(jié)果產(chǎn)生影響[44-45]?？辔峨m不愉悅，但是可以增加一定的豐富度。除A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉外，其余樣品豆豉的苦味均強(qiáng)于NF豆豉，其中A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉苦味感知最強(qiáng)，為4.8 分，這可能與豆豉中呈苦味游離氨基酸的增加有關(guān)（圖1）。甜味作為大眾接受度最高的滋味，只有A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉強(qiáng)于NF豆豉，其余樣品甜味均弱于NF豆豉。綜上，風(fēng)味變化最明顯的為A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉。

圖5 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵瀏陽豆豉感官雷達(dá)圖Fig.5 Sensory evaluation radar map of Liuyang Douchi fermented by different strains

3 結(jié)論

分離菌株強(qiáng)化發(fā)酵豆豉對比NF豆豉，游離氨基酸與有機(jī)酸總量分別提升19.6%～104.3%和0.08～0.55 mg/g。特別是A.flavus77菌株強(qiáng)化發(fā)酵對谷氨酸以及乙酸釋放的促進(jìn)效果明顯（分別提升108.41%和182.24%），說明強(qiáng)化發(fā)酵有助于瀏陽豆豉的蛋白降解及有機(jī)酸的形成。通過GC-MS從各豆豉樣品中鑒定出9 類化合物共92 種物質(zhì)，其中酯類化合物種類最豐富（20 種），酸類化合物總計相對含量最高，共有的揮發(fā)性化合物僅20 種。較NF相比，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的酯類、醛類以及酸類化合物含量有明顯增長，特別是苯乙醛與苯甲醛，給予豆豉花香、堅果香。此外，強(qiáng)化發(fā)酵還會生成一些新的揮發(fā)性化合物，如散發(fā)果香味的亞油酸乙酯、帶來清香的2-八烯醛。電子鼻數(shù)據(jù)顯示，A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉與NF豆豉差異最小。而A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉與其他樣品差異明顯，且對氮氧化合物、芳香成分及有機(jī)硫化物更為靈敏。感官評價結(jié)果亦顯示，A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉整體風(fēng)味更好，香味突出（6.0 分），鮮味與甜味也較強(qiáng)（分別為6.0 分和3.6 分）。綜上，強(qiáng)化發(fā)酵可以通過促進(jìn)游離氨基酸、有機(jī)酸以及揮發(fā)性化合物質(zhì)的釋放，實現(xiàn)對豆豉風(fēng)味的調(diào)控。本研究有助于揭示強(qiáng)化發(fā)酵對瀏陽豆豉品質(zhì)的影響，可為瀏陽豆豉的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化、可控化以及工廠化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。