同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定雞蛋中硝基咪唑類藥物及其代謝物

邱肖依，王冬梅，李佳寬，許 晴，王夢穎，管卓龍，盧躍鵬，涂鳳琴

（武漢食品化妝品檢驗所，國家市場監(jiān)管重點實驗室（食用油質量與安全），湖北 武漢 430040）

硝基咪唑類藥物是一類含有5 位硝基取代咪唑雜環(huán)結構的化合物。甲硝唑（metronidazole，MNZ）、洛硝噠唑（ronidazole，RNZ）、地美硝唑（dimetridazole，DMZ）和異丙硝唑（ipronidazole，IPZ）是常見的硝基咪唑類藥物，羥基甲硝唑（metronidazole-OH，MNZOH）、羥基異丙硝唑（ipronidazole-O H，IPZOH）和羥甲基甲硝咪唑（1-methyl-2-hydroxymethyl-5-nitroimidazole，HMMNI）分別是MNZ、IPZ、DMZ和RNZ的代謝物。硝基咪唑類藥物被廣泛用于治療畜禽的滴蟲病、厭氧菌感染等疾病[1]，有不法商家將其添加到飼料中可提高飼料的轉化率，增加動物的體質量。由于MNZ、RNZ、DMZ等含有硝基雜環(huán)的化合物具有潛在致癌、致畸作用[2]，歐盟理事會將其列入A類禁用藥物，不得在任何食品中檢出[3-4]，2002年我國農業(yè)部第193號公告和國家藥品監(jiān)督管理局第227號公告中規(guī)定，甲硝唑、地美硝唑及其鹽、酯及制劑不允許以促進動物生長為目的在所有食品動物中使用。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》[5]明確規(guī)定地美硝唑、甲硝唑允許作治療作用，但是不得在動物食品中檢出。2019年我國農業(yè)農村部第250號公告明確規(guī)定食品動物中禁止使用洛硝達唑和替硝唑。雞蛋是我國居民日常膳食中極為重要的營養(yǎng)食物，其質量安全事關人民群眾身體健康。在日常監(jiān)督抽檢工作中發(fā)現(xiàn)，蛋雞的養(yǎng)殖過程存在使用硝基咪唑類藥物的情況，雞蛋中檢出硝基咪唑類藥物的現(xiàn)象時有發(fā)生，因此有必要開發(fā)硝基咪唑類藥物的快速檢測方法，進一步提高雞蛋質量安全風險監(jiān)測水平。

目前報道的檢測硝基咪唑類藥物的測定方法主要有液相色譜法[6-10]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法[11]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[2-3,12-19]。對比3 種檢測方式，液相色譜法存在靈敏性不高、無法準確定性的缺點；氣相色譜-質譜聯(lián)用法前處理過程通常需要衍生化，且RNZ和HMMNI衍生產物相同，氣相色譜-質譜聯(lián)用法無法對兩者區(qū)分；液相色譜-串聯(lián)質譜法由于其靈敏度高、選擇性好、無需衍生化，在復雜基質樣品硝基咪唑類藥物的分析檢測中應用最為廣泛。我國現(xiàn)行有效的動物性食品中硝基咪唑類藥物的檢測標準主要包括GB 31658.23—2022《動物性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》[20]和GB/T 21318—2007《動物源食品中硝基咪唑殘留量檢驗方法》[21]，前者規(guī)定了對豬牛羊和雞的肌肉和肝腎中MNZ、MNZOH、DMZ和HMMNI殘留量進行測定，后者的適用范圍包括豬雞牛的肌肉和肝腎、魚肉、奶粉和蜂蜜，兩者的測定范圍均不包含雞蛋。雞蛋中硝基咪唑類藥物的檢測方法主要參照SN/T 2624—2010《動物源性食品中多種堿性藥物殘留量的檢測方法》[22]，而該方法凈化過程使用兩個固相萃取柱，前處理操作較繁瑣。當前，大部分文獻采用固相萃取法對提取液進行富集和凈化[6-9,12,15-16,23-24]。張麗媛等[15]建立液相色譜-串聯(lián)質譜法測定雞肉及雞蛋樣品中3 種硝基咪唑類藥物，PCX固相萃取柱凈化，定量限為5 μg/kg。Xia Xi等[23]采用SCX小柱對樣品進行富集凈化，結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定豬腎中硝基咪唑類藥物及其代謝物。馬東杰等[24]對比了PCX、MCX、SCX三種陽離子固相萃取柱對硝基咪唑類化合物的凈化效果，發(fā)現(xiàn)DMZ的平均回收率在50%左右，IPZ的平均回收率小于10%，使用HLB凈化IPZ的平均回收率也不到10%，使用PRiME HLB固相萃取柱MNZ、RNZ、IPZ、DMZ的平均回收率均達到70%以上。固相萃取柱的使用通常需活化、上樣、淋洗、洗脫，過程耗時，凈化過程中目標物流失、洗脫不完全等原因都會對實驗的回收率產生不利影響，且使用成本高。近年來，QuEChERS作為一種快速、簡單、廉價、高效、安全的前處理技術，在動物性食品獸藥殘留檢測中應用較為廣泛[10,14,25-26,29-31]。

本研究經(jīng)過實驗對比，采用十八烷基鍵合硅膠（C18）作為凈化吸附劑，基于改良的QuEChERS技術結合同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜，建立了一種同時測定雞蛋中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留的分析方法。該方法操作簡便、定量結果準確、靈敏度高，使用弗帕斯檢測實驗室能力驗證（food analysis performance assessment scheme，F(xiàn)APAS）對樣品進行驗證，具有良好的準確度和精密度，適用于大批量樣品的快速測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硝基咪唑類化合物及內標（100 mg/L）（MNZ、RNZ、DMZ、IPZ、MNZOH、HMMNI、IPZOH、RNZ-D3、DMZ-D3、IPZ-D3、MNZOH-D2、HMMNI-D3、IPZOH-D3）北京曼哈格生物科技有限公司；乙腈（色譜純）德國Merck公司；甲酸（色譜純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL）美國Waters公司；CNWBOND HC-C18SPE填料（40～63 μm）上海安譜科學儀器有限公司；水為Milli-Q系統(tǒng)制備的超純水（18.2 MΩ·cm）。

2022年FAPAS雞蛋中硝基咪唑類藥物的測定能力驗證樣品（產品編號FCVD13-EGG2）由英國食品與環(huán)境研究院提供。

1.2 儀器與設備

Q-TRAP 6500質譜儀（配電噴霧電離Turbo V離子源）美國AB SCIEX公司；LC 30A液相色譜儀日本Shimadzu公司；Allegra X-15R離心機 美國Beckman公司；Vortex-Genie 2渦旋振蕩儀 美國SCND公司；PM5-2000TL超聲波清洗器 普律瑪儀器公司；N-EVAP水浴氮吹儀 美國OA公司；ME204電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL，流動相：A為0.1%（體積分數(shù)）甲酸溶液，B為乙腈；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～1.0 min，90.0% A、10.0% B；1.0～3.0 min，90.0%～40.0% A、10.0%～60.0% B；3.0～3.5 min，40.0%～10.0% A、60.0%～90.0% B；3.50～6.01min，10.0% A、90.0% B；6.01～ 6.02 min，10.0%～90.0% A、90.0%～10.0% B；6.02～9.00 min，90.0% A、10.0% B。

1.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧電離（electronspray ionization，ESI）正離子模式；檢測方式：多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；離子源溫度500 ℃，電噴霧電壓5 000 V；氣簾氣壓力275.79 kPa；霧化氣壓力379.21 kPa；輔助加熱氣壓力379.21 kPa；碰撞氣體Medium。其他質譜參數(shù)見表1。

表1 硝基咪唑類藥物及代謝物質譜采集參數(shù)Table 1 MS parameters for 5-nitroimidazoles and their metabolites

1.3.3 標準工作溶液的配制

標準溶液的制備：準確移取1 mL的RNZ、MNZ、IPZ、DMZ、MNZOH、HMMNI、IPZOH標準物質至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋，配制成10 mg/L的混合標準儲備液。準確移取上述硝基咪唑類混合標準儲備液1 mL至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配制質量濃度為100 ng/mL的硝基咪唑類混合標準中間溶液。準確移取1 mL的RNZ-D3、DMZ-D3、IPZ-D3、MNZOH-D2、HMMNI-D3、IPZOH-D3標準物質，用甲醇溶解配制成10 mg/L的硝基咪唑類混合內標儲備液。準確移取硝基咪唑類混合內標標準儲備液1 mL至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配制質量濃度為100 ng/mL的混合內標標準中間溶液。

取適量硝基咪唑類混合標準中間液、硝基咪唑類混合內標標準中間液，用體積分數(shù)10%乙腈溶液配制成0.5～20 ng/mL、內標質量濃度為5 ng/mL的工作曲線。

1.3.4 試樣制備

新鮮雞蛋洗凈后去殼，用組織勻漿機攪拌均勻，置于聚乙烯瓶中，于－20 ℃儲存。

1.3.5 提取

準確稱取2.0 g（精確到0.01g）混勻后的樣品，加入100 μL 100 ng/mL的硝基咪唑類混合內標標準中間溶液，再加入10 mL乙腈和1 g NaCl渦旋混合10 min，超聲10 min，以4 500 r/min離心5 min，上清液待凈化。

1.3.6 凈化

取5.0 mL上述提取液，加入400 mg C18，渦旋2 min，以4 500 r/min離心5 min，取全部上清液加入2mL乙腈飽和正己烷，渦旋1 min，4 500 r/min離心5 min，棄去正己烷層，于40 ℃氮吹干，加入1.0 mL 10%（體積分數(shù)）乙腈溶液復溶，過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Analyst軟件（AB SCIEX公司）對研究的硝基咪唑類藥物進行超高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析、數(shù)據(jù)采集和處理，采用Microsoft Excel進行統(tǒng)計計算和圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 質譜參數(shù)優(yōu)化

使用流動注射泵以恒流方式進樣，分別將質量濃度為100 ng/mL的7 種硝基咪唑類化合物的標準溶液，以及氘代內標標準溶液依次注入到離子源中，在ESI正離子模式下進行母離子全掃描，得到最優(yōu)的各待測目標物的分子離子峰。以確定的分子離子峰為母離子進行二級質譜碎片離子掃描，獲得碎片離子信息，得到二級質譜圖，選取豐度較高子離子。根據(jù)前面選出的母、子離子，組建MRM離子對，優(yōu)化碰撞能量與去簇電壓并確定定量離子及定性離子。優(yōu)化后相關參數(shù)見1.3.2節(jié)。選出的離子對數(shù)量符合EC/657指令中使用質譜法確證的4 個識別位點的要求。

2.1.2 色譜條件優(yōu)化

目前報道的關于測定硝基咪唑類藥物的文獻[23-29]和標準[20-21]，分析柱均使用反相色譜柱，增加色譜柱長能更有效地提高樣品基質中目標分析物和共流出物的分離度并降低基質效應（matrix effect，ME）影響[27]，因此本方法采用選用柱長150 mm的C18色譜柱進行分析。實驗選用Waters XBridge C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）和Agilent EclipsePlus C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）兩種色譜柱進行考察。結果表明超微填料（粒徑≤2 μm）Agilent EclipsePlus C18色譜柱可以獲得更好的分離效果，色譜峰峰形尖銳對稱。流動相采用有機相＋水相改善出峰情況，有機相比較乙腈和甲醇，兩者都可獲得較好的色譜峰形和信號響應，使用乙腈目標物能更好地實現(xiàn)基線分離，且可減少溶劑效應的干擾；在正離子掃描模式下，水相中甲酸的加入能夠增加目標物響應，改善目標物的峰形，進一步比較0.1%的甲酸溶液和5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸），結果表明乙酸銨加入后部分色譜峰響應降低。因此實驗使用Agilent EclipsePlus C18色譜柱作為分析柱，選擇0.1%的甲酸溶液-乙腈作為系統(tǒng)流動相。不同粒徑填料的色譜柱及不同流動相對7 種硝基咪唑類化合物影響見圖1。

圖1 7 種硝基咪唑類化合物的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of seven NMZs

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

在7 種硝基咪唑類化合物均未檢出的空白雞蛋樣品中加入5 μg/kg硝基咪唑類化合物混合標準溶液，分別以乙腈、1%甲酸-乙腈、甲醇、乙酸乙酯有機溶劑作為提取液，對比7 種硝基咪唑類化合物的提取效果。結果表明：甲醇和乙酸乙酯的鹽析效果較差，不利于分層，且甲醇提取液雜質較多，后續(xù)凈化復雜，使用1%甲酸-乙腈和乙腈提取時，回收率無明顯差異，乙腈具有沉淀蛋白等作用，提取液顏色較淺且各目標物回收率均滿足實驗要求，綜合考慮，選擇乙腈作為提取液。不同提取溶劑對硝基咪唑類化合物回收率的影響見圖2。

圖2 不同提取溶劑對硝基咪唑類化合物回收率的影響Fig.2 Effects of different extraction solvents on the recoveries of NMZs

2.3 凈化方式的優(yōu)化

近年來，新型凈化固相萃取小柱Prime HLB和QuEChERS作為快速高效的前處理技術，在動物性食品藥物殘留檢測中應用較為廣泛[10,14,24-26,28-31]。實驗對比Prime HLB和C18對硝基咪唑類藥物的凈化處理效果，結果表明，Prime HLB和C18的平均回收率沒有明顯差異，不同凈化材料對目標物回收率的影響如圖3所示。Prime HLB采用親水親脂平衡填料，使用通過策略進行固相萃取凈化，可獲得相對較好的回收率，C18對于除去非極性雜質有較好的效果，部分化合物的回收率較采用Prime HLB稍低。但是雞蛋基質復雜，采用Prime HLB凈化后部分化合物（HMMNI和IPZOH）目標峰附近仍有干擾峰，影響定量結果準確性，所以選擇C18為前處理凈化方式。經(jīng)過兩種凈化材料處理后HMMNI和IPZOH提取離子流圖見圖4。

圖3 兩種凈化方式的凈化效率對比Fig.3 Effect of purification methods on the recoveries of NMZs

圖4 HMMNI和IPZOH提取離子流圖Fig.4 Extracted ion chromatograms of HMMN and IPZOH

實驗進一步考察C18不同用量（50、200、400、600 mg）對目標化合物的影響。結果表明C18用量600 mg時DMZ和IPZ峰面積相對50 mg C18增加17.8%和31.8%，C18用量400 mg HMMNI峰面積相對50 mg C18增加了6.18%，MNZ、RNZ、MNZOH和IPZOH的峰面積有下降趨勢，對比添加量50 mg和400 mg峰面積相對偏差為3.01%、3.70%、4.86%和6.39%，差異不明顯，硝基咪唑類化合物的峰面積與C18用量關系見圖5。使用400 mg C18填料對部分目標物存在吸附作用，但是吸附作用不明顯，但是凈化后HMMNI絕對響應峰面積增加，DMZ和IPZ絕對響應峰面積增加明顯，綜上分析，使用400 mg C18作為合適的吸附劑用量。

圖5 C18吸附劑用量對硝基咪唑類化合物峰面積的影響Fig.5 Effects of the amount of C18 sorbents on the peak areas of NMZs

2.4 方法評價

2.4.1 線性范圍、檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）將標準及內標混合系列工作液分別注入液相色譜-串聯(lián)質譜儀中，測定相應的峰面積，以標準系列工作液中硝基咪唑化合物的質量濃度為橫坐標，以硝基咪唑化合物與其內標的峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，硝基咪唑化合物在0.5～20.0 ng/mL范圍內線性相關系數(shù)（r）均大于0.999，呈現(xiàn)良好的線性關系（表2）。以信噪比為3確定方法LOD，以信噪比為10確定方法LOQ，得出雞蛋基質中硝基咪唑及其代謝物的LOD在0.1～0.25 μg/kg之間，LOQ在0.3～1.0 μg/kg之間，方法的LOD均低于標準方法SN/T 2624—2010的檢測低限（1 μg/kg），方法靈敏度較高。

表2 硝基咪唑類化合物線性方程、相關系數(shù)、LOD和LOQTable 2 Linear equations,correlation coefficients,LODs,LOQs of NMZs

2.4.2 回收率與精密度

對空白樣品進行低、中、高3 個水平的添加回收實驗，硝基咪唑類化合物添加量分別為0.5、1.0、5.0 μg/kg，每個添加水平進行6 次平行實驗，以考察方法的回收率和精密度。結果表明（表3），雞蛋中7 種硝基咪唑類的回收率為96.5%～112.7%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.82%～8.14%。符合標準GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》[32]規(guī)定的回收率和精密度的要求。

表3 硝基咪唑類化合物的加標回收率和精密度Table 3 Recoveries and precision RSDs of NMZs from spiked samples

2.4.3 ME的評價

方法按照（ME=基質標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率）評價ME。當ME小于0.85時，存在基質抑制效應；當ME為0.85～1.15時，ME不明顯；當ME大于1.15時，存在基質增強效應[33]。準確稱取2.0 g樣品，加入10 mL乙腈和1 g NaCl旋渦混合10 min，超聲 10 min，以4 500 r/min離心5 min，取5.0 mL上清液，凈化處理后加入7 種硝基咪唑類化合物和內標標準溶液，配制成0.5～20 ng/mL基質標準工作溶液。分別作基質和溶劑的外標和內標曲線，內標質量濃度為5 ng/mL。結果表明，除HMMNI（MEex=0.774）和RNZ（MEex=0.814）存在抑制效應外，其他幾種硝基咪唑類化合物經(jīng)過本法凈化后各基質溶液中ME不明顯。方法通過內標法進行矯正后，7 種硝基咪唑類化合物的ME不明顯，因此本法采用溶劑標準曲線和內標法測定7 種硝基咪唑類化合物含量，ME評價如表4所示。

表4 硝基咪唑類化合物的ME評價Table 4 Matrix effects of MNZs

2.4.4 方法比對與實際樣品分析

采用建立的同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法對FAPAS考核樣品（編號02477）雞蛋中的硝基咪唑類化合物進行測定，與標準方法SN/T 2624—2010結果進行比對。考核樣待測目標物為本方法測定的7 種硝基咪唑類化合物，DMZ靶值為5.15 μg/kg，HMMNI 靶值為11.0 μg/kg，MNZ靶值為7.81 μg/kg，MNZOH靶值為5.17 μg/kg，RNZ、IPZ和IPZOH未檢出，z值表示測定值與真值之間的偏離程度，|z|≤2則結果滿意。未檢出目標物采用加標回收的方式進行評價（加標量5.0 μg/kg）。兩種方法對DMZ、HMMNI、MNZ、MNZOH、RNZ、IPZOH的測定結果（表5）比較接近，相對偏差分別為2.28%、3.36%、2.83%、6.82%、0.20%、9.90%。能力驗證結果表明，本方法對雞蛋中4 種硝基咪唑類化合物的測定結果均在|z|≤2的置信區(qū)間。RNZ、IPZ、IPZOH采用本方法測定的加標回收率分別為101%、106%和102%，SN/T 2624—2010的加標回收率分別為101%、76.6%和92.2%。綜上，采用本方法對雞蛋中7 種硝基咪唑類化合物測定結果滿意。

表5 雞蛋中硝基咪唑類化合物的不同分析方法比對Table 5 Comparison of different analytic methods for detection of MNZs in eggs

應用建立的同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法對購自超市和農產品批發(fā)市場的38 批次雞蛋樣品中7 種硝基咪唑類化合物進行測定。38 批次樣品中，檢出1 批次MNZ陽性樣品，甲硝唑含量為320 μg/kg，超過限量1.0 μg/kg，其他樣品均未檢出7 種硝基咪唑類化合物，說明在國家明令禁止的情況下，仍存在不法分子違規(guī)使用硝基咪唑類藥物的情況。

3 結論

本實驗建立了同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定雞蛋中7 種硝基咪唑類藥物的方法。方法LOD為0.1～0.25 μg/kg，LOQ為0.3～1.0 μg/kg，結果準確度高，前處理操作簡便，具有快速、高效、易推廣的優(yōu)點，適用于大批量雞蛋中硝基咪唑類藥物的快速篩查、定性定量檢測，對于雞蛋中硝基咪唑類藥物殘留情況的監(jiān)測具有重要的應用價值。