維生素D 對紫外線誘導(dǎo)豚鼠皮膚曬傷的治療作用及緊密連接蛋白Claudins 家族的影響

滕用華 凌倩 周秀英 林華龍 黃崇煥

曬傷是一種典型的由于暴露在紫外線后皮膚局部出現(xiàn)紅斑、水腫甚至大皰的一種急性光毒性皮炎, 包括表皮損傷, 導(dǎo)致激活的免疫細(xì)胞流入受傷的皮膚創(chuàng)面, 形成局部炎癥環(huán)境, 進(jìn)一步加劇炎癥和延緩組織修復(fù)［1,2］。Scott 等［3］和Das 等［4］的研究提示, 維生素D可能具有治療曬傷的作用, 但具體劑量和機(jī)制仍未明確。本文擬通過建立豚鼠皮膚曬傷模型, 進(jìn)一步驗證維生素D 對曬傷的治療作用及初步探索維生素D 對緊密連接蛋白Claudins 家族的調(diào)節(jié)作用, 以期發(fā)現(xiàn)維生素D 治療曬傷的作用機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 普通級白化豚鼠36 只, 雌性, 體質(zhì)量250 g, 健康, 購自武漢市萬千佳興生物科技有限公司,許可證號：SCXK(卾)2021-0011。

1.2 儀器 ES-J120 電子分析天平(天津市德安特傳感技術(shù)有限公司)；游標(biāo)卡尺(AIRAJ)；HH-4 恒溫水浴鍋(常州天瑞儀器有限公司)；無菌注射器(江蘇治宇醫(yī)療器材有限公司)；HGSS-Z 型紫外太陽模擬器(北京衡工儀器有限公司)。

1.3 試藥 維生素D3(98%, MYM BIOLOGICAL TECHNOLOGY COMPANY LIMITED)；硫化鈉(AR, 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 豚鼠曬傷模型的建立 將36 只豚鼠隨機(jī)分成模型組、空白對照組、維生素D 低劑量組、維生素D中劑量組、維生素D 高劑量組、維生素D 預(yù)防治療組,每組6 只。實驗開始前, 將所有雌性白化豚鼠在動物房飼養(yǎng)7 d 以適應(yīng)環(huán)境, 豚鼠體質(zhì)量均值為250 g。實驗前1 d, 進(jìn)行脫毛處理, 首先將被毛剪短, 在豚鼠脊柱兩側(cè)涂抹10%的硫化鈉溶液, 再用剃毛刀剃出面積為5 cm×4 cm 的脫毛區(qū)。除空白對照組以外, 對其余5 組小鼠進(jìn)行處理：輻照前將豚鼠固定四肢, 進(jìn)行麻醉, 置于HGSS-Z 型紫外太陽模擬器下, 只對脫毛處進(jìn)行照射, 儀器預(yù)熱 15 min, 將光源固定在距豚鼠背部約10 cm 處, 照射時間為8 min［5］。紫外線輻照劑量［6］：中波紫外線(UVB)的輻照強(qiáng)度2.22 mW/(cm2·s), 輻照面積(S)為9 cm2, UVB 的輻照劑量為1.14×104mW。

1.4.2 給藥方法 建模成功后, 維生素D 低劑量組(1500 IU/kg)、維生素D 中劑量組(3000 IU/kg)、維生素D 高劑量組(6000 IU/kg)、維生素D 預(yù)防治療組(6000 IU/kg, 造模前7 d 開始灌胃給藥, 1 次/d)均給予相應(yīng)劑量維生素D 灌胃, 1 次/d, 給藥7 d；模型組和空白對照組給予等量生理鹽水, 在給藥期間用每天拍照的形式來記錄豚鼠創(chuàng)面愈合情況。

1.5 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

1.5.1 豚鼠創(chuàng)面愈合率 通過計算硫酸紙小方格來評估豚鼠曬傷愈合情況, 具體做法是在豚鼠第一次給藥前和最后一次給藥后, 把硫酸紙覆蓋在豚鼠曬傷的部位, 用筆沿豚鼠曬傷的邊緣進(jìn)行傷口描繪, 再將描繪圖形描至小方格紙, 最終通過計算豚鼠曬傷小方格的格數(shù)來表示創(chuàng)面面積［7］, 最后計算豚鼠創(chuàng)面愈合率。豚鼠創(chuàng)面愈合率=(豚鼠首次給藥前的創(chuàng)面面積-豚鼠末次給藥后的創(chuàng)面面積)/豚鼠首次給藥前的創(chuàng)面面積×100%。

1.5.2 豚鼠組織學(xué)檢查 在豚鼠最后一次給藥后, 用剪刀將豚鼠曬傷部位的皮膚剪下, 清洗后將皮膚固定在10%的甲醛溶液中, 對曬傷皮膚進(jìn)行石蠟包埋、切片, 再進(jìn)行組織的蘇木精-伊紅染色(HE 染色), 高倍顯微鏡下觀察各組豚鼠皮膚曬傷情況并拍照, 通過圖片來比較各組豚鼠曬傷皮膚的愈合程度。

1.5.3 Western blot 于給藥結(jié)束后24 h 后取豚鼠背部皮膚組織, 進(jìn)行蛋白提取、總蛋白溶液變性, 電泳,轉(zhuǎn)膜, 封閉, 一抗孵育, 二抗孵育, 發(fā)光檢測等步驟,檢測Claudin-1、Claudin-3、Claudin-4、Claudin-5、Claudin-7、Claudin-8 的表達(dá), 比較各組豚鼠曬傷皮膚中Claudins 蛋白的表達(dá)量, 并進(jìn)行結(jié)果分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 豚鼠形態(tài)學(xué)結(jié)果 模型組、維生素D 低劑量組、維生素D 中劑量組、維生素D 高劑量組、維生素D 預(yù)防治療組豚鼠皮膚在經(jīng)過紫外線的照射后都出現(xiàn)了面積大小比較相近的紅斑。且在照射后第2 天即用藥前,各組曬傷豚鼠的皮膚紅斑處多轉(zhuǎn)為紅腫, 給藥7 d 后,模型組豚鼠曬傷的皮膚表面紅腫逐漸擴(kuò)散、結(jié)水泡,與其他給藥組相比較為嚴(yán)重, 且結(jié)痂和脫痂的速度均較慢；維生素D 低劑量組愈合情況比模型組稍好, 但不明顯；維生素D 中劑量組豚鼠曬傷創(chuàng)面紅腫擴(kuò)散面積較小, 水泡也較少；維生素D 高劑量組紅腫擴(kuò)散得到控制, 有散在的少量水泡；維生素D 預(yù)防治療組與模型組相比愈合情況明顯更好, 且出現(xiàn)結(jié)痂, 結(jié)痂面積縮小。見圖1。

圖1 六組豚鼠形態(tài)學(xué)結(jié)果

2.2 各組豚鼠給藥結(jié)束后創(chuàng)面愈合率比較 維生素D中劑量組豚鼠創(chuàng)面愈合率高于模型組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；維生素D 高劑量組、維生素D 預(yù)防治療組豚鼠創(chuàng)面愈合率顯著高于模型組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。維生素D 低劑量組豚鼠創(chuàng)面愈合率與模型組比較, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組豚鼠給藥結(jié)束后創(chuàng)面愈合率比較( ±s, %)

表1 各組豚鼠給藥結(jié)束后創(chuàng)面愈合率比較( ±s, %)

注：與模型組比較, aP＜0.05；bP＜0.01

組別只數(shù)創(chuàng)面愈合率模型組620.57±8.12維生素D 低劑量組6 30.36±8.15維生素D 中劑量組6 36.62±9.18a維生素D 高劑量組6 48.06±5.06b維生素D 預(yù)防治療組6 63.76±7.13b

2.3 組織學(xué)檢查結(jié)果 從HE 染色結(jié)果可見, 空白對照組豚鼠皮組織結(jié)構(gòu)基本正常, 表皮未見明顯增厚；組織內(nèi)未見有紅細(xì)胞充盈；可見大量毛囊, 組織內(nèi)未見有脂肪空泡。模型組豚鼠皮組織結(jié)構(gòu)重度異常, 棘層結(jié)構(gòu)消失；真皮層膠原纖維大量缺失, 組織內(nèi)可見有大量脂肪空泡, 可見大量炎癥細(xì)胞浸潤, 毛囊結(jié)構(gòu)大量減少。維生素D 預(yù)防治療組和維生素D 高劑量組豚鼠皮組織結(jié)構(gòu)輕度異常, 表皮可見輕微變薄, 可見真皮層有少量炎癥, 可見有少量空泡, 毛囊結(jié)構(gòu)可見, 組織修復(fù)較好, 且維生素D 預(yù)防治療組動物表皮的修復(fù)比維生素D 高劑量組更為完好。維生素D 中劑量組和維生素D 低劑量組皮組織結(jié)構(gòu)仍表現(xiàn)為輕、中度異常,表皮可見輕微增厚, 表皮層可見少量血痂覆蓋, 細(xì)胞排列紊亂, 可見真皮層有少量炎癥, 可見有少量空泡, 與模型組對比有好轉(zhuǎn), 但修復(fù)不明顯。見圖2。

圖2 六組豚鼠組織學(xué)檢查結(jié)果

2.4 維生素D 對豚鼠皮膚Claudins 家族的影響 模型組與空白對照組相比, 豚鼠皮膚Claudin 表達(dá)顯著減少；維生素D 低劑量組與模型組比較, 豚鼠皮膚Claudin 表達(dá)有所提高, 但不明顯；維生素D 中劑量組、維生素D 高劑量組、維生素D 預(yù)防治療組與模型組比較, 豚鼠皮膚Claudin 表達(dá)有顯著提高, 與組織學(xué)結(jié)果相符合。見圖3。

圖3 維生素D 對豚鼠皮膚Claudin 蛋白的影響

3 討論

當(dāng)皮膚被紫外線照射后, 尤其是被波長為290～320 nm 的中波紫外線(ultraviolet B, UVB)照射時, 細(xì)胞內(nèi)氧自由基會增加, 使皮膚出現(xiàn)老化、水腫、DNA損傷等癥狀, 結(jié)果為直接或間接的誘發(fā)皮膚曬傷的發(fā)生［8,9］。據(jù)統(tǒng)計, 在美國, 關(guān)于導(dǎo)致急診科(ED)的曬傷負(fù)擔(dān)知之甚少。平均而言, 日光灼傷急診的護(hù)理費用為1132.25 美元(±28.69 美元)。因曬傷而就診的流行率和費用在夏季增加［10］。因此, 為了更好的模擬自然曬傷, 作者在該研究中采用的是290～320 nm 的中波紫外線模擬曬傷模型。

在前期查閱文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn), 建立曬傷模型時如何選取實驗動物較關(guān)鍵, 大鼠品系的選擇對實驗也有影響,通過對比發(fā)現(xiàn)豚鼠的皮膚對紫外線照射比較敏感, 與豚鼠相比較, 大鼠的皮膚較厚, 當(dāng)對大鼠予以同等輻照劑量時, 曬傷卻不明顯, 這就意味著選豚鼠有可能更容易建模成功, 且體質(zhì)量在250 g 以下的豚鼠單側(cè)體表面積不足, 照射面積不夠, 同理小鼠體表面積太小, 無法滿足曬傷需要的傷口大?。?］。因此, 該研究中選用體質(zhì)量為250 g 的豚鼠進(jìn)行模擬實驗。

Scott 等［3］在一項研究中發(fā)現(xiàn)高劑量口服維生素D3后, 機(jī)體能夠通過抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá), 減弱局部皮膚對紫外線的炎癥反應(yīng), 抑制紫外線誘導(dǎo)的皮膚損傷, 從而使皮膚紅斑減輕, 皮膚表皮結(jié)構(gòu)的損傷減少。從本研究中的皮膚創(chuàng)面愈合率和形態(tài)學(xué)研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn), 維生素D低劑量組(1500 IU/kg)對曬傷有一定的治療作用,但效果不明顯, 隨著劑量的增加治療效果顯著增強(qiáng), 而維生素D 預(yù)防治療組(6000 IU/kg)與維生素D 高劑量組(6000 IU/kg)對比, 治療效果更優(yōu), 也驗證了維生素D 對皮膚具有潛在的治療作用, 且治療效果和維生素D 的劑量、給藥時間呈正相關(guān)。

通常廣義上的皮膚屏障包括色素屏障、物理屏障及免疫屏障等諸多方面, 其中物理屏障結(jié)構(gòu)由緊密連接(tight junction, TJ)和角質(zhì)層(stratum corneum, SC)構(gòu)成, TJ 和SC 共同阻止了外部抗原由內(nèi)部成分由內(nèi)而外的泄漏或者由外向內(nèi)的滲透［11］。TJ 是由許多緊密連接蛋白組成的連接著復(fù)合物介導(dǎo)的、圍繞上皮或者內(nèi)皮細(xì)胞的側(cè)膜、密封著細(xì)胞間隙的最外端的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的吻合鏈帶。TJ 又包括胞漿蛋白和跨膜蛋白。胞漿蛋白又包括ZO 家族和Cingulin 等, 可以連接跨膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白F-actin, 胞漿蛋白在細(xì)胞頂端與基底外側(cè)的區(qū)域限制溶質(zhì)的自由通過；跨膜蛋白則包括Claudins 家族、黏連蛋白JAM 家族等, 跨膜蛋白的細(xì)胞外環(huán)部分之間可以互相融合, 可封閉細(xì)胞間隙［12］。當(dāng)前已知Claudins 家族參與了銀屑病、特應(yīng)性皮炎、玫瑰痤瘡、接觸性皮炎等多種皮膚疾病發(fā)病機(jī)制, 通過上調(diào)Claudins 的表達(dá)有利于緩解皮膚疾病［13］。本研究中, 通過Western blot 檢測豚鼠皮膚組織中Claudins家族的表達(dá), 從蛋白印跡實驗中可見, 隨著維生素D給藥劑量和給藥時間的增加, Claudins 的表達(dá)有上調(diào)趨勢, 且以Claudin-5、Claudin-7、Claudin-8 共3 種蛋白的表達(dá)更為明顯, 說明維生素D 治療皮膚曬傷的作用可能與Claudins 家族的表達(dá)有關(guān), 具體機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步探討。