16 種殺菌劑對3 種水稻病原細(xì)菌的室內(nèi)抑菌效果研究

侯雨萱 于林 李陽 諶江華

（1 中國水稻研究所/水稻生物育種全國重點實驗室，杭州 311400；2 麗水市土肥植保能源總站，浙江 麗水323000；3 寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040；*第一/通信作者：houyuxuan@caas.cn）

植物病原細(xì)菌是一類重要的病原微生物，包含假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、歐文氏菌屬（Erwinia）、雷爾氏菌屬（Ralstonia）、泛菌屬（Pantoea）和腸桿菌屬（Enterobacter）等20 多個屬，造成我國糧食和經(jīng)濟(jì)作物上約70 種細(xì)菌性病害的發(fā)生流行[1]。

黃單胞菌屬代表種稻黃單胞桿菌致病變種（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）引起的白葉枯病是危害水稻的世界性重要病害，引起水稻葉片產(chǎn)生黃褐色或白色病斑，影響植物光合作用，一般造成水稻減產(chǎn)10%~30%，重則減產(chǎn)50%以上，甚至絕收[2]。20 世紀(jì)70—90年代，我國除了新疆、西藏等地未見報道，白葉枯病在全國其余各水稻產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生和流行，成為危害我國水稻生產(chǎn)的三大流行性病害之一[3]。

菠蘿泛菌屬于泛菌屬（Pantoea ananatis），早期研究認(rèn)為，菠蘿泛菌是一種植物內(nèi)生菌或者腐生細(xì)菌，但近些年的研究表明，菠蘿泛菌是一種非常重要的植物病原細(xì)菌，可以侵染菠蘿、洋蔥、哈密瓜、杏鮑菇、桉樹、小麥、玉米和水稻等多種單子葉和雙子葉植物，造成葉片和莖稈產(chǎn)生病斑、枯萎、果實腐爛等多種病癥，引發(fā)新型病害的流行[4-14]。特別在水稻上，是一種新上升的可引起水稻嚴(yán)重病癥的病原菌，在中國、日本、韓國、印度、泰國、馬來西亞、俄羅斯、意大利、土耳其、澳大利亞、貝寧、多哥都有菠蘿泛菌侵染水稻造成危害的報道，其主要使水稻葉片產(chǎn)生病斑、枯萎、莖壞死、鞘腐爛、內(nèi)稃褐變和谷粒變色等癥狀[15-16]。

阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）屬于腸桿菌屬，廣泛分布于水、土壤和食物上，可以與茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）一起引發(fā)生姜青枯?。贿€可侵染桑樹，使其葉片失水凋萎枯焦，直至脫落，剝開主干層可見木質(zhì)部褐色條狀斑[17-18]。最近XUE 等[19]報道，阿氏腸桿菌和菠蘿泛菌也會侵染水稻，造成水稻葉片產(chǎn)生白葉枯病類似癥狀。

3 種病原細(xì)菌都可引起水稻葉部病害，稻黃單胞桿菌致病變種引起的白葉枯病老病新發(fā)。據(jù)統(tǒng)計，位于長江中下游的寧波市自2018 年起白葉枯病發(fā)生面積逐年增加，2021 年達(dá)到4 334.7 hm2次，感病品種包括甬秈15、中早39、甬優(yōu)1540、甬優(yōu)15、甬優(yōu)538、寧84和寧88 等當(dāng)?shù)刂髟云贩N[20]，原有抗病品種對新流行菌株抗性喪失，化學(xué)藥劑防治仍是當(dāng)前防治的首要措施。由菠蘿泛菌和阿氏腸桿菌引起的新發(fā)病害，沒有抗性品種資源基礎(chǔ)，篩選適宜的化學(xué)防治藥劑成當(dāng)務(wù)之急。目前登記的防治白葉枯病的常規(guī)藥劑主要有銅制劑、有機磷、有機氮、苯基酰胺磷，及噻唑類等雜環(huán)化合物和農(nóng)用抗生素等，但這些藥劑對白葉枯病的新流行株以及新發(fā)的病原菌是否有效還未可知。為了有效防治水稻葉部的細(xì)菌性病害，作者收集了16 種市售的防治細(xì)菌性病害殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)抑菌活性測定和評價，以期篩選出同時針對上述3 種病原細(xì)菌的高效殺菌劑，為水稻新發(fā)的細(xì)菌性病害精準(zhǔn)防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥劑

40%鏈霉素可濕性粉劑，華北制藥集團(tuán)愛諾有限公司；80%乙蒜素乳油，河南比賽爾農(nóng)業(yè)科技有限公司；3%中生菌素可濕性粉劑，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司；35%喹啉銅四霉素懸浮劑，青島奧迪斯生物科技有限公司；6%春雷霉素可濕性粉劑，江門市植保有限公司；40%春雷噻唑鋅懸浮劑，浙江新農(nóng)化工股份有限公司；20%噻唑鋅懸浮劑，浙江新農(nóng)化工股份有限公司；20%噻菌銅懸浮劑，浙江龍灣化工有限公司；20%噻森銅懸浮劑，浙江東風(fēng)化工有限公司；23%松脂酸銅乳油，山東禾宜生物科技有限公司；70%丙森鋅可濕性粉劑，拜耳集團(tuán)；50%氯溴異氰尿酸可溶性粉劑，江蘇東寶農(nóng)化股份有限公司；20%葉枯唑可濕性粉劑，陜西上格之路生物科技有限公司；8%寧南霉素水劑，德強生物股份有限公司；50%咯菌腈可濕性粉劑，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；16%多抗霉素可溶性粒劑，乳山韓威生物科技有限公司。

1.1.2 供試菌株

2021 年分別于浙江富陽、紹興和杭州種植的水稻品種甬優(yōu)1540 上具有褐色病斑、萎蔫、卷縮等癥狀的病葉中分離鑒定的稻黃單胞桿菌致病變種FY517、菠蘿泛菌SX1 和阿氏腸桿菌HZ27。經(jīng)柯赫氏法則驗證，F(xiàn)Y517 室內(nèi)剪葉接種、SX1 和HZ27 室內(nèi)刮擦后噴霧接種甬優(yōu)1540，14 d 后均能產(chǎn)生不同程度的褐色病斑。

1.2 試驗方法

1.2.1 制備含有病原菌的PSA 平板

取-80 ℃貯存的FY517、SX1 和HZ27 菌液，分別在NA 平板上（聚蛋白胨5 g，酵母粉1 g，牛肉浸膏3 g，蔗糖15 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0）劃線，28 ℃培養(yǎng)48~72 h；挑取單克隆至100 mL M210 液體培養(yǎng)基（酵母提取物4 g，酵水解干酪素8 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0）于28 ℃、200 rpm 條件下培養(yǎng)至OD600值約到1.0。準(zhǔn)備60 mL PSA 液體培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，L-谷氨酸1 g，蔗糖10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0），加入1%瓊脂糖高溫高壓滅菌，冷至50 ℃，加入6 mL 上述制備的病原菌菌液（OD600=1.0），快速均勻混合后倒于平板，每板約15 mL。

1.2.2 制備不同濃度的藥劑

將各殺菌劑配制成有效濃度為10 000 mg/L，作為原液，分別在無菌1.5 mL 離心管中用水稀釋成10X、100X 和1 000X 液。

1.2.3 測試抑菌活性

分別取5 μL 殺菌劑的系列稀釋液，在超凈工作臺中慢慢點到高溫高壓滅菌過濾紙圓片上，吹干，轉(zhuǎn)移至含有病原菌的PSA 平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察病原菌在PSA 平板中的生長和測量抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 16 種殺菌劑對3 種病原細(xì)菌的抑菌活性測定

本研究采用抑菌圈法測定16 種殺菌劑對水稻上的3 種病原細(xì)菌稻黃單胞桿菌致病變種FY517、菠蘿泛菌SX1 和阿氏腸桿菌HZ27 的敏感性。結(jié)果（表1）表明，除了8%寧南霉素、50%咯菌腈和16%多抗霉素，其余13 種農(nóng)藥對FY517 都有不同程度的抑菌作用，抑菌圈直徑在6.1~22.2 mm 之間，抑菌效果最好的是80%乙蒜素，其次是3%中生菌素，最差的是50%氯溴異氰尿酸和20%葉枯唑；常用的白葉枯防治藥劑40%春雷噻唑鋅、20%噻唑鋅、20%噻菌銅和20%噻森銅等在離體條件下的抑菌效果不佳，抑菌圈小于10.0 mm。40%鏈霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素、6%春雷霉素、50%氯溴異氰尿酸和70%丙森鋅這7 種殺菌劑對SX1 有不同程度的抑菌效果，抑菌圈直徑在6.8~27.8 mm 之間，抑菌效果最好的是40%鏈霉素，其次是80%乙蒜素，最差的是70%丙森鋅。40%鏈霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素這5 種殺菌劑對HZ27 有抑菌作用，且效果依次降低，最高為40%鏈霉素，抑菌圈直徑為24.2 mm，最差為35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素，抑菌圈直徑只有6.2 mm。

表1 16 種殺菌劑對水稻上3 種病原細(xì)菌的室內(nèi)抑菌效果

所有殺菌劑隨著藥劑的稀釋抑菌效果降低，40%鏈霉素有效作用濃度最低，在原液稀釋100 倍后仍對SX1 和HZ27 有抑菌效果；其次是80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素，原液稀釋10倍后對3 菌均有抑制作用；清水對照抑菌圈直徑為0，沒有抑菌作用（表1）。

2.2 對3 病原細(xì)菌均起抑制作用的5 種殺菌劑抑菌效果比較

從16 種殺菌劑對3 菌的抑菌試驗數(shù)據(jù)來看，只有40%鏈霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素等5 種殺菌劑對3 細(xì)菌菌株都有抑菌作用，且抑制作用隨著藥劑的稀釋逐漸降低（圖1）。當(dāng)殺菌劑濃度為原液（10 000 mg/L）時，40%鏈霉素對SX1 的抑制作用最強，HZ27 次之，F(xiàn)Y517 相對較差；80%乙蒜素對SX1 的抑制作用最強，F(xiàn)Y517 次之，HZ27相對較差；3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素對FY517 的抑制作用最強，SX1 次之，HZ27 相對較差（圖2A）；當(dāng)殺菌劑在原液的基礎(chǔ)上稀釋10 倍時，40%鏈霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素4 種殺菌劑對3 種菌株同時均有抑制作用，且作用趨勢與相應(yīng)原液基本一致（圖2B）。

圖1 5 種抗生素類藥劑對3 種病原細(xì)菌形成的抑菌圈

圖2 5 種抗生素類藥劑對3 種病原細(xì)菌的抑菌活性比較

從數(shù)據(jù)分析結(jié)果來看，在離體平板上單獨抑制稻黃單胞桿菌致病變種FY517，首推80%乙蒜素，其次是40%鏈霉素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素，20%噻唑鋅和20%噻菌銅等金屬類制劑有一定抑制作用，但效果沒有前二者強；單獨抑制SX1 和HZ27，首推40%鏈霉素，其次是80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素。

對于這3 種新出現(xiàn)的水稻細(xì)菌性病害的流行株，室內(nèi)的16 種殺菌抑菌活性試驗表明，抗生素類藥劑的離體平板抑菌效果較好，且對3 種菌株同時有抑菌作用，鑒于40%鏈霉素已在大田防治中禁用，作者建議在大田同時防治3 種新發(fā)病害時可以使用80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素。

3 討論

近年由于氣候環(huán)境和耕作制度的變化以及病原菌生理小種的不斷變異，水稻白葉枯病在浙江等省份又開始大面積流行，菠蘿泛菌和阿氏腸桿菌引起的新病害也突現(xiàn)，這3 種病原細(xì)菌都能致水稻葉部產(chǎn)生病斑、萎縮、枯萎，影響光合作用，降低水稻產(chǎn)量。本研究針對這一突現(xiàn)緊急生產(chǎn)問題，進(jìn)行了市售16 種殺菌劑對3種病原細(xì)菌菌株的離體抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)40%鏈霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素這5 種抗生素類殺菌劑同時對3 種病原細(xì)菌菌株具有顯著抑菌作用，80%乙蒜素對稻黃單胞桿菌致病變種FY517 的抑菌效果最佳，40%鏈霉素對SX1 和HZ27 抑菌效果最佳。

40%春雷噻唑鋅、20%噻唑鋅和20%噻菌銅等金屬類制劑對稻黃單胞桿菌致病變種引起的白葉枯病田間防效好，防治效果可以達(dá)到69.6%~90.7%[21-22]。但在我們的室內(nèi)試驗中，以上3 種殺菌劑對稻黃單胞桿菌致病變種新流行株FY517 有一定程度的抑制作用，能形成抑菌圈，但抑菌圈直徑顯著小于40%鏈霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素等5 種抗生素類殺菌劑形成的抑菌圈。余山紅等[23]也證實，噻唑鋅、噻森銅和噻菌銅對近期從浙江臨海分離的白葉枯病新流行菌株室內(nèi)抑菌效果不佳，丙硫唑和中生菌素等的室內(nèi)抑菌效果好。這兩項研究中使用的供試菌株均為新分離的流行菌株，噻唑鋅等對其室內(nèi)抑菌效果不佳，可能是由于噻唑鋅等的大量使用，新流行菌株產(chǎn)生部分抗性；亦或是新流行菌株的變異導(dǎo)致原有金屬類制劑的抑菌活性正在逐步降低。

在我們的試驗中篩選到3%中生菌素、80%乙蒜素等5 種抗生素對菠蘿泛菌有顯著的抑菌作用。王大會等[24]報道，1.6%噻霉酮、3%中生菌素和80%乙蒜素對煙草葉枯病的致病菌成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）有較好的抑菌效果，抑制中濃度值分別4.0、13.5 和117.6 μg/mL，綜合來看，3%中生菌素和80%乙蒜素對泛菌有顯著抑菌效果，可以作為防治藥劑。另外也有報道，Bacillus licheniformis產(chǎn)生的抗菌肽A 通過阻礙菠蘿泛菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜合成來抑制其生長[25]。這表明我們可以進(jìn)一步篩選生防菌來精準(zhǔn)綠色防治菠蘿泛菌引起的病害。

蒙姣榮等[26]測定了包括中生菌素在內(nèi)的10 種藥劑對引起桑樹細(xì)菌性枯萎病的阿氏腸桿菌的藥效，發(fā)現(xiàn)中生菌素抑菌效果最好，最低有效抑制濃度為11.3~15.0 μg/mL；農(nóng)用鏈霉素次之，最低有效抑制濃度為7.5~113.0 μg/mL。而在我們的試驗結(jié)果中對阿氏腸桿菌抑菌效果最好的是40%鏈霉素，其次是80%乙蒜素和3%中生菌素，導(dǎo)致這個抑菌效果的差異可能是由于供試菌株來源于不同寄主的不同株系。

后續(xù)作者將以同時對3 種病原細(xì)菌具有顯著抑菌作用的40%鏈霉素、80%乙蒜素、3%中生菌素、35%喹啉銅四霉素和6%春雷霉素為供試藥劑，進(jìn)行溫室盆栽和田間小區(qū)試驗，以明確這幾種藥劑的田間實際防治效果，為精準(zhǔn)防治水稻細(xì)菌性葉部病害提供參考和指導(dǎo)。