煤微生物甲烷化的石墨烯強(qiáng)化機(jī)制

周藝璇 ， 蘇現(xiàn)波,2,3,4 ， 趙偉仲 ， 王 乾,2 ， 于世耀 ， 汪露飛

(1.河南理工大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院, 河南 焦作 454000；2.河南理工大學(xué) 非常規(guī)天然氣研究院, 河南 焦作 454000；3.中國(guó)地質(zhì)大學(xué) 資源學(xué)院, 湖北 武漢 430074；4.中原經(jīng)濟(jì)區(qū)煤層(頁巖) 氣協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南 焦作 454000)

在綠色高效煤層氣增產(chǎn)技術(shù)研發(fā)領(lǐng)域，相繼提出了微生物增產(chǎn)煤層氣(Microbially Enhanced Coalbed Methane, MECBM)[1]和煤層氣生物工程(Coalbed Gas Bioengineering, CGB)的理念[2]。其中，煤層氣生物工程是將營(yíng)養(yǎng)液或經(jīng)過選育、馴化、改良的菌種注入地下煤層，通過厭氧發(fā)酵(Anaerobic Digestion, AD)把煤的部分有機(jī)組分轉(zhuǎn)化為甲烷，從而實(shí)現(xiàn)微生物強(qiáng)化煤層氣產(chǎn)出的一種特殊發(fā)酵工程[3-5]。煤層氣生物工程作為一種新的煤層氣增產(chǎn)與碳減排技術(shù)，有著潛在的生命力。由于煤的分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷需要不同代謝功能微生物的協(xié)同作用[6-7]。近年來關(guān)于強(qiáng)化煤制生物甲烷產(chǎn)出的研究主要集中在3 個(gè)方面：煤層(水)本源微生物的多樣性研究[8-9]；通過發(fā)酵系統(tǒng)參數(shù)優(yōu)化、生物馴化、生物刺激和生物強(qiáng)化等方法來提高生物甲烷的產(chǎn)出[10-14]；通過生物化學(xué)手段提高煤在厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中的生物可利用度[15-16]?？梢姶龠M(jìn)發(fā)酵系統(tǒng)中微生物的代謝活性是提高生物甲烷產(chǎn)氣量的有效途徑。

向發(fā)酵系統(tǒng)中添加導(dǎo)電材料不僅可以減少溫度、pH 等環(huán)境條件的變化對(duì)微生物活性的影響，還可以有效促進(jìn)直接種間電子傳遞(Direct Interspecies Electron Transfer, DIET)提高甲烷產(chǎn)率，在強(qiáng)化有機(jī)物厭氧降解方面潛力巨大。2012 年，KATO 等[17]在稻田土壤富集的菌種的厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中添加導(dǎo)電材料磁鐵礦后，發(fā)現(xiàn)Geobacter和Methanosaeta被富集，并且甲烷產(chǎn)氣量也得到了顯著的提升，證明了添加導(dǎo)電材料可以刺激DIET 過程產(chǎn)生CH4。導(dǎo)電性能優(yōu)秀的碳材料，如生物炭、石墨、石墨烯、碳纖維布、碳納米管等已經(jīng)被廣泛用于促進(jìn)DIET 機(jī)制以增強(qiáng)厭氧發(fā)酵過程中甲烷產(chǎn)氣量[18-22]。人們通過向有機(jī)廢物、動(dòng)物糞便和餐廚垃圾等厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中添加不同性質(zhì)的導(dǎo)電碳材料，發(fā)現(xiàn)可有效縮短厭氧發(fā)酵的延滯期，強(qiáng)化厭氧發(fā)酵效率，使得甲烷產(chǎn)氣量得到了明顯的提升[23-26]。將生物炭加入以污泥和餐廚垃圾為底物的厭氧發(fā)酵體系中，不僅會(huì)使整個(gè)系統(tǒng)的pH 緩沖能力顯著上升，還能夠減緩厭氧消化過程中的氨抑制作用，促進(jìn)產(chǎn)甲烷過程，提升甲烷產(chǎn)率[27-28]。石墨烯作為一種由單層碳原子緊密排列形成的2D 蜂巢晶格結(jié)構(gòu)的平面薄膜，具有優(yōu)良的電子、熱力學(xué)導(dǎo)電性能和較強(qiáng)的吸附性能，這種新興材料因其獨(dú)特的物理及電化學(xué)性質(zhì)引起了世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注[29]。在添加石墨烯的條件下，以污泥為底物的厭氧發(fā)酵體系的產(chǎn)甲烷效率顯著增強(qiáng)，并且增強(qiáng)了乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷微生物的活性[30]。在連續(xù)流污泥厭氧消化系統(tǒng)中添加石墨烯能夠在提高甲烷產(chǎn)氣量的同時(shí)原位去除CO2，最終可使沼氣中甲烷體積分?jǐn)?shù)提高到95%，顯著提升了厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)氣效果[31]。

導(dǎo)電碳材料介導(dǎo)的厭氧微生物種間互營(yíng)關(guān)系的強(qiáng)化為進(jìn)一步提高厭氧發(fā)酵效果開辟了一條新的思路，目前的研究大多運(yùn)用導(dǎo)電材料強(qiáng)化一些簡(jiǎn)單底物的降解，然而對(duì)于煤這種復(fù)雜的有機(jī)物降解過程中的機(jī)制尚不清楚，對(duì)發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)功能菌群的分析以及相關(guān)群落結(jié)構(gòu)和機(jī)理分析的研究鮮有報(bào)道。筆者以長(zhǎng)焰煤為研究對(duì)象，石墨烯作為導(dǎo)電材料，通過對(duì)比分析添加導(dǎo)電材料的發(fā)酵系統(tǒng)和傳統(tǒng)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)在產(chǎn)甲烷過程中氣相、固相、液相、菌群群落結(jié)構(gòu)和產(chǎn)甲烷代謝路徑的差異性，揭示導(dǎo)電材料石墨烯對(duì)煤層生物甲烷產(chǎn)出的強(qiáng)化機(jī)制，為煤層氣增產(chǎn)提供新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取河南省義馬千秋礦長(zhǎng)焰煤(CYM)作為實(shí)驗(yàn)樣品(表1)。實(shí)驗(yàn)所用石墨烯購(gòu)于中科雷鳴(北京)科技有限公司，相關(guān)參數(shù)見表2。煤樣在105 ℃的烘箱中放置12 h，隨后對(duì)煤塊進(jìn)行研磨和篩分，獲得0.15～0.18 mm 煤樣。厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣菌源來源于實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期馴化的菌群。

表1 煤樣的工業(yè)分析和元素分析Table 1 Proximate analysis and ultimate analysis of coal samples %

表2 石墨烯基本特性參數(shù)Table 2 Characteristic parameters of graphene

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)石墨烯最佳添加量篩選：在5 個(gè)250 mL 發(fā)酵瓶中分別加入25 g 長(zhǎng)焰煤，其中4 個(gè)分別加入0.2、0.4、0.6、0.8 g/L 的石墨烯作為實(shí)驗(yàn)組，剩余1 個(gè)不加石墨烯的作為對(duì)照組；同時(shí)倒入富集好的產(chǎn)甲烷菌液250 mL，充入氬氣形成無氧環(huán)境，密封后放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱，每隔4 d 記錄產(chǎn)氣數(shù)據(jù)，以甲烷累計(jì)產(chǎn)氣量作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，確定石墨烯的最優(yōu)添加量。

(2)確定石墨烯最佳添加量后，以此進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。采用2 個(gè)1 000 mL 錐形瓶作為厭氧發(fā)酵容器，分別加入100 g 長(zhǎng)焰煤，其中1 個(gè)加入石墨烯作為實(shí)驗(yàn)組，另一個(gè)作為對(duì)照組，接種富集6 d 的菌液，充入氬氣形成厭氧環(huán)境，密封后放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱，每隔4 d 記錄產(chǎn)氣數(shù)據(jù)。

(3)每隔4 d 對(duì)各個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵液分別取液100 mL，對(duì)所取菌液進(jìn)行液相產(chǎn)物分析與高通量測(cè)序。

1.3 分析檢測(cè)方法

1.3.1 發(fā)酵系統(tǒng)氣體分析

本研究厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的氣體用GC-4000A 氣相色譜儀進(jìn)行分析檢測(cè)，手動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 mL，用注射器抽取氣袋中收集的氣體測(cè)定產(chǎn)氣量。

1.3.2 關(guān)鍵液相產(chǎn)物定量分析

標(biāo)品甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、甲醇、乙醇、十五烷、十六烷、十八烷購(gòu)于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司。配置不同質(zhì)量濃度(mg/L)標(biāo)品混合溶液，按照液液萃取方法用二氯甲烷萃取濃縮后進(jìn)行GC-MS(氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀7890-5977A)測(cè)定，并建立標(biāo)準(zhǔn)變化曲線，然后再次運(yùn)用同樣方法對(duì)發(fā)酵液處理測(cè)定并求出各物質(zhì)的質(zhì)量濃度。

1.3.3 發(fā)酵系統(tǒng)煤樣XPS 分析

將發(fā)酵結(jié)束后剩余發(fā)酵液倒出，用篩子過濾出煤樣，用蒸餾水反復(fù)沖洗煤樣去除煤樣上的發(fā)酵液，將處理好的煤樣放入80 ℃的烘干箱干燥24 h，取適量樣品用X 射線光電子能譜儀(Thermo Scientific Escalab 250Xi 型)進(jìn)行XPS 測(cè)試。

1.3.4 高通量測(cè)序

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的高通量測(cè)序均交付上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，具體方法見文獻(xiàn)[32]。取液時(shí)將厭氧發(fā)酵瓶放在厭氧工作站內(nèi)，搖勻菌液，抽取50 mL 菌液于離心管中，用封口膜密封、編號(hào)，放入干冰箱中，進(jìn)行低溫冷凍郵寄。微生物功能通過PICRUSt 軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，基于KEGG 甲烷代謝通路(Map: 00680)，挑選出預(yù)測(cè)豐度大于100 的相關(guān)物質(zhì)的代謝基因，對(duì)其降解及甲烷生成途徑進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 石墨烯添加量?jī)?yōu)選

添加不同質(zhì)量石墨烯的發(fā)酵系統(tǒng)中甲烷的階段產(chǎn)氣量與累計(jì)產(chǎn)氣量(圖1、表3)表明當(dāng)添加0.4 g/L石墨烯時(shí)累計(jì)甲烷產(chǎn)氣量最高，為4.72 mL/g，比對(duì)照組的3.89 mL/g 提高了21.3%，并且煤的階段產(chǎn)氣量峰值時(shí)間(16 d)相比于對(duì)照組(20 d)提前了4 d；當(dāng)石墨烯添加量增加到0.6 g/L 時(shí)，相比于對(duì)照組甲烷累計(jì)產(chǎn)氣量提高但和添加0.4 g/L 石墨烯的發(fā)酵系統(tǒng)相比甲烷累計(jì)產(chǎn)氣量開始下降，當(dāng)石墨烯添加量繼續(xù)增加到0.8 g/L 時(shí)，甲烷累計(jì)產(chǎn)氣量為3.63 mL/g相比于對(duì)照組下降，這可能是高質(zhì)量濃度的石墨烯會(huì)沉降到微生物表面抑制了微生物的生長(zhǎng)及繁殖并且石墨烯鋒利邊緣可將細(xì)菌的細(xì)胞膜刺破，導(dǎo)致細(xì)胞失活[33-34]。因此，選取0.4 g/L 石墨烯作為后續(xù)導(dǎo)電材料促進(jìn)煤厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的添加量。

圖1 不同添加量石墨烯發(fā)酵系統(tǒng)中甲烷和二氧化碳階段產(chǎn)氣量和累計(jì)產(chǎn)氣量Fig.1 Stage gas production and cumulative gas production of methane and carbon dioxide in graphene digestion system with different additive levels

表3 不同石墨烯添加量發(fā)酵系統(tǒng)中甲烷階段產(chǎn)氣量和累計(jì)產(chǎn)氣量Table 3 Stage gas production and cumulative gas production of methane in digestion systems with different graphene additions

2.1.2 石墨烯對(duì)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)甲烷產(chǎn)氣量的影響

確定石墨烯最佳添加量為0.4 g/L 后，據(jù)此構(gòu)建一個(gè)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)作為實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)不加入石墨烯的作為對(duì)照組。在整個(gè)發(fā)酵過程中，對(duì)照組的階段產(chǎn)氣量在第20 天時(shí)達(dá)到峰值，為1.50 mL/g；而添加石墨烯的系統(tǒng)在第16 天達(dá)到產(chǎn)氣峰值，為1.81 mL/g，比對(duì)照組提前了4 d，而且峰值產(chǎn)氣量也提高了20.67%(圖2(a))。對(duì)照組和添加石墨烯組中甲烷累計(jì)產(chǎn)氣量分別為4.48 mL/g 和5.35 mL/g(圖2(b))，添加石墨烯使得發(fā)酵系統(tǒng)甲烷產(chǎn)氣量提升19.42%(表4)。產(chǎn)甲烷動(dòng)力學(xué)分析(修正的Gompertz 模型)表明添加石墨烯的系統(tǒng)中模擬最高甲烷日產(chǎn)氣量為0.35 mL/g，比對(duì)照組(0.31 mL/g)提高了12.9%(表5、圖3)。同時(shí)，添加石墨烯和對(duì)照組中的產(chǎn)甲烷遲滯期(λ)分別為7.18 d和8.20 d，說明石墨烯的添加增強(qiáng)了菌群對(duì)底物的適應(yīng)能力調(diào)高了產(chǎn)甲烷效能。

圖2 添加石墨烯和對(duì)照組厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中甲烷和二氧化碳階段產(chǎn)氣量和累計(jì)產(chǎn)氣量Fig.2 Stage gas production and cumulative gas production of methane and carbon dioxide in the anaerobic digestion system with graphene and the control group

圖3 添加石墨烯和對(duì)照組厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中累積產(chǎn)甲烷曲線擬合Fig.3 Curves fitting of cumulative methane production in the graphene and control anaerobic digestion systems

表4 添加石墨烯和對(duì)照組厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中甲烷階段產(chǎn)氣量和累計(jì)產(chǎn)氣量Table 4 Stage gas production and cumulative gas production of methane in the anaerobic digestion system with graphene and the control group

表5 添加石墨烯和對(duì)照組厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中累積產(chǎn)甲烷曲線的擬合結(jié)果Table 5 Fitting results of cumulative methane production curves in the anaerobic digestion system with graphene and the control group

2.1.3 厭氧發(fā)酵前后煤表面碳元素含量及化學(xué)賦存狀態(tài)變化特征

微生物通常以附著方式對(duì)煤固體進(jìn)行厭氧降解，這一過程必定會(huì)使得煤表面結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變化。由原煤、對(duì)照組與添加石墨烯的系統(tǒng)經(jīng)過厭氧發(fā)酵殘余煤的C1s 譜圖及其分峰擬合(圖4)可以看出，芳香單元及其取代烷烴(C—C、C—H)在煤樣表面都占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，不同條件下經(jīng)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣殘煤表面的芳香單元及其取代烷烴(C—C、C—H)相對(duì)于原煤均增加，相對(duì)含量為原煤 < 對(duì)照組 < 石墨烯(表6)。煤厭氧發(fā)酵過程中，鍵能相對(duì)較低的非規(guī)則部分從煤結(jié)構(gòu)中脫落進(jìn)入發(fā)酵液，從而使含氧有機(jī)碳(C—O、C=O、COO—)的總相對(duì)含量下降，導(dǎo)致產(chǎn)氣殘煤表面芳香單元及其取代烷烴(C—C、C—H)相對(duì)含量增加。其中添加石墨烯的厭氧發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)氣殘煤表面的羰基碳(C=O)和羧基碳(COO—)相對(duì)于對(duì)照組明顯減少，分別下降了42.8%和49.5%。

圖4 煤樣C1s 窄掃譜圖分峰擬合Fig.4 Peak fitting of coal sample C1s narrow sweep spectrum

表6 煤樣C1s 擬合結(jié)果Table 6 Peak fitting results of C1s spectrogram from coals

2.1.4 石墨烯對(duì)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中關(guān)鍵液相物質(zhì)的影響

由厭氧發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)氣過程中酸類(圖5(a))、醇類(圖5(b))和烷烴類(圖5(c))的變化可知，在對(duì)照組中，丁酸大量生成的時(shí)間在第12 天左右，呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，直至產(chǎn)氣結(jié)束；而添加石墨烯的系統(tǒng)大量生成的時(shí)間提前了6 d，從前期大量生成至產(chǎn)氣結(jié)束一直在降低，且下降速率高于對(duì)照組。對(duì)于甲酸、乙酸和丙酸，在對(duì)照組中呈先升高后降低又升高的變化趨勢(shì)；添加石墨烯的系統(tǒng)則先降低后升高(圖5(a))。在整個(gè)產(chǎn)氣過程中兩組發(fā)酵系統(tǒng)中的烷烴類物質(zhì)均呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，第6 天左右烷烴類大量生成且石墨烯組高于對(duì)照組(圖5(c))。兩組發(fā)酵系統(tǒng)中的醇類在整個(gè)產(chǎn)氣過程中一直降低，在產(chǎn)氣高峰期之前下降速率較快，高峰期之后下降速率減緩(圖5(b)、表7)。石墨烯的添加使得甲醇和乙醇在整個(gè)產(chǎn)氣過程中利用率均高于對(duì)照組。

圖5 添加石墨烯和對(duì)照組發(fā)酵系統(tǒng)中液相產(chǎn)物的定量變化趨勢(shì)Fig.5 Trends of liquid phase products in the digestion system with graphene and the control group

表7 添加石墨烯和對(duì)照組發(fā)酵系統(tǒng)中液相產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)定量(質(zhì)量濃度)Table 7 Standard quantifications of liquid phase products in the digestion system with graphene addition and control mg/L

2.1.5 石墨烯對(duì)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

整個(gè)厭氧發(fā)酵過程中，分別對(duì)對(duì)照組和添加石墨烯的系統(tǒng)發(fā)酵前期(對(duì)照組-1，石墨烯-1)、產(chǎn)氣高峰期(對(duì)照組-2，石墨烯-2)和產(chǎn)氣末期(對(duì)照組-3，石墨烯-3)的菌群進(jìn)行分析可知，在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中，添加石墨烯后各個(gè)時(shí)期功能菌屬的豐度和多樣性明顯高于對(duì)照組(圖6(a))，石墨烯的添加有效刺激了各個(gè)時(shí)期菌群的活性。對(duì)照組和添加石墨烯的系統(tǒng)各個(gè)時(shí)期均主要以Paraclostridium為主，添加石墨烯的系統(tǒng)發(fā)酵前期、產(chǎn)氣高峰期和產(chǎn)氣末期Geobacter的豐度均高于對(duì)照組，并且該菌屬在石墨烯-2(15.6%)豐度最高，比對(duì)照組-2(7.0%)提高了122.9%；Anaerovorax和Sedimentibacter均在兩組產(chǎn)氣高峰期豐度最高，且添加石墨烯組高于對(duì)照組。Sphaerochaeta作為煤大分子降解中的主要功能菌屬在對(duì)照組和添加石墨烯的系統(tǒng)中產(chǎn)氣初期豐度最高，添加石墨烯組仍高于對(duì)照組(圖7(a))。在古菌群落結(jié)構(gòu)中，對(duì)照組和添加石墨烯的系統(tǒng)各個(gè)時(shí)期均主要以參與多種代謝途徑的Methanosarcina和氫營(yíng)養(yǎng)型的Methanoculleus為主，添加石墨烯后Methanosarcina豐度提高，且各個(gè)時(shí)期該菌屬豐度均高于對(duì)照組(圖7(b))。添加石墨烯后，各個(gè)時(shí)期菌屬的豐度高于對(duì)照組，但在產(chǎn)氣高峰期(石墨烯-2，21.5%)發(fā)酵系統(tǒng)菌群多樣性低于對(duì)照組(對(duì)照組-2，22.6%)(圖6(b))。

圖6 添加石墨烯和對(duì)照組發(fā)酵系統(tǒng)中細(xì)菌和古菌多樣性與豐度Fig.6 Diversity and abundance of bacteria and archaea in the digestion system with graphene and the control group

圖7 添加石墨烯和對(duì)照組發(fā)酵系統(tǒng)中細(xì)菌和古菌群落結(jié)構(gòu)Fig.7 Community structure of bacteria and archaea in the digestion system with graphene and the control group

2.1.6 產(chǎn)甲烷代謝路徑分析

煤中有機(jī)質(zhì)被微生物降解利用需經(jīng)過多種菌群協(xié)同作用，煤中的大分子物質(zhì)向小分子的轉(zhuǎn)化的水解階段尤為重要。產(chǎn)酸菌的酸化途徑主要包括糖酵解、單糖代謝、氨基酸代謝和丙酮酸代謝。添加石墨烯后參與糖酵解(Ko00010)、氨基酸代謝(Ko01230)和丙酮酸代謝(Ko00620)的基因豐度分別增加了42.1%、24.9%和27.1%；參與糖酵解的2-脫氫-3-脫氧葡萄糖酸醛縮酶，與氨基酸代謝有關(guān)的氨基酸還原酶和轉(zhuǎn)氨酶，以及丙酮酸代謝相關(guān)的鐵氧還蛋白氧化還原酶、乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶與對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)，使得代謝酸類等物質(zhì)的菌群(Geobacter、Anaerovorax)豐度顯著升高。

在產(chǎn)甲烷階段，依據(jù)底物類型的不同可以將該過程分為氫營(yíng)養(yǎng)型、乙酸營(yíng)養(yǎng)型和甲基營(yíng)養(yǎng)型3 類。在乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷路徑中，添加石墨烯的系統(tǒng)中參與乙酸轉(zhuǎn)化的乙酸激酶(K00925, EC: 2.7.2.1)、乙酸輔酶A 連接酶(K00193, EC: 6.2.1.1)、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(K00625, EC: 2.3.1.8)、乙酰輔酶A 脫羰基酶/合成酶β 亞 基(K14138, EC: 2.3.1.169)和γδ 亞 基(K00194,EC: 2.1.1.245)相對(duì)豐度都顯著高于對(duì)照組(表8)，其中乙酰輔酶A 脫羰基酶/合成酶β 亞基和γδ 亞基作為乙酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，添加石墨烯后分別增加了233.54%和3.32%(圖8)。

圖8 添加石墨烯和對(duì)照組厭氧發(fā)酵系統(tǒng)甲烷代謝路徑Fig.8 Methane metabolism pathway in the anaerobic digestion system with graphene and control group

表8 三種甲烷生成途徑相關(guān)酶基因及其相對(duì)豐度Table 8 Genes of enzymes associated with three methanogenesis pathways and their relative abundance

2.2 分析與討論

2.2.1 厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中生物甲烷的生成機(jī)制

在厭氧發(fā)酵的4 d 內(nèi)開始有生物甲烷生成，此時(shí)優(yōu)勢(shì)菌屬為Paraclostridium、Alcaligenes和Sphaerochaeta，有研究表明Paraclostridium主要存在于厭氧發(fā)酵的水解階段，具有很強(qiáng)的降解能力，通過代謝短鏈、長(zhǎng)鏈烷烴生成乙酸等物質(zhì)[35]。Alcaligenes和Sphaerochaeta可代謝氨基酸產(chǎn)生乙醇、乙酸、乳酸、氫氣和二氧化碳，屬于產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌[36]。此時(shí)液相小分子物質(zhì)烷烴(十五烷、十六烷、十八烷)、揮發(fā)性脂肪酸(甲酸、乙酸、丙酸和丁酸)和醇類(甲醇、乙醇)均有一定的積累，產(chǎn)氣殘煤表面的羰基碳(C=O)、羧基碳(COO—)也表明煤表面的官能團(tuán)被微生物降解作為小分子有機(jī)酸類等物質(zhì)的組成部分。與此同時(shí)，古菌群落中的優(yōu)勢(shì)菌屬為Methansarcina能夠進(jìn)行多種產(chǎn)甲烷途徑代謝。由于在初期階段能夠?yàn)槲⑸锢玫臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，因此甲烷產(chǎn)氣量較低。在第5～20 天內(nèi)是甲烷產(chǎn)氣量進(jìn)行快速增長(zhǎng)的階段，在此階段，活躍的細(xì)菌(Sedimentibacter、Paraclostridium)通過降解煤提供了充足的底物，同時(shí)烷烴、揮發(fā)性脂肪酸和醇類的快速消耗也說明了此時(shí)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌(Anaerovorax)起到了良好的承上啟下作用，既消耗了水解階段的產(chǎn)物，同時(shí)為產(chǎn)甲烷菌提供了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，Methanosarcina豐度的增加也表明了此時(shí)生物甲烷主要以乙酸營(yíng)養(yǎng)為主，該階段主要進(jìn)行的反應(yīng)見式(1)～(6)。在產(chǎn)氣末期的20～32 d 內(nèi)，細(xì)菌群落變化較大的是Alcaligenes與Anaerovorax；古菌群落此時(shí)主要以Methanosarcina為主，同時(shí)液相小分子物質(zhì)中的揮發(fā)性脂肪酸和醇類物質(zhì)下降緩慢，而烷烴類物質(zhì)呈小幅度上升，這表明隨著厭氧發(fā)酵的進(jìn)行發(fā)酵液中可被微生物利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)越來越少，處于核心生態(tài)位的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌受環(huán)境因素的改變難以為下階段的產(chǎn)甲烷菌提供底物，且烷烴類物質(zhì)的小幅上漲也說明了在整個(gè)厭氧發(fā)酵過程中時(shí)刻在進(jìn)行煤的水解，但因參與每個(gè)階段的核心菌群很難保持代謝的連貫性，使得發(fā)酵系統(tǒng)中微生物活性受到抑制，產(chǎn)甲烷隨之停止。

2.2.2 石墨烯對(duì)生物甲烷產(chǎn)出的促進(jìn)機(jī)制

整體來看，石墨烯的添加(0.4 g/L)有效增強(qiáng)了整個(gè)厭氧發(fā)酵的進(jìn)行。不僅提高了產(chǎn)氣初期的甲烷產(chǎn)氣量，同時(shí)也提前了產(chǎn)甲烷的產(chǎn)氣高峰期。在發(fā)酵初期，細(xì)菌群落中添加石墨烯后Sedimentibacter豐度上升，將發(fā)酵液中烷烴類降解為乙酸。水解菌群和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群的活性增強(qiáng)，前期積累的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更充足，使得甲烷產(chǎn)氣量高于對(duì)照組。在產(chǎn)甲烷高峰期，添加石墨烯后Methanoculleus豐度降低而Methanosarcina豐度顯著提高，一方面參與乙酸轉(zhuǎn)化的乙酸激酶、乙酸輔酶A 連接酶、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酰輔酶A 脫羰基酶/合成酶β 亞基和γδ 亞基相對(duì)豐度都顯著高于對(duì)照組，這些酶主要與Methanosarcina有關(guān)[37]，其中乙酰輔酶A 脫羰基酶/合成酶β 亞基和γδ 亞基作為乙酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，分別增加了233.54%和3.32%，這使得Methanosarcina豐度明顯上升且主要進(jìn)行乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷，已有研究發(fā)現(xiàn)石墨烯具有較大的比表面積和較強(qiáng)的吸附性能，通過吸附固定或促進(jìn)功能微生物富集等作用達(dá)到減緩或消除厭氧消化過程中抑制性物質(zhì)(如NH3、NH4+-N、VFAs、酚類以及重金屬等)對(duì)厭氧消化效果的影響[38-40]，這為發(fā)酵系統(tǒng)中的微生物提供了良好的生長(zhǎng)環(huán)境，提高了各類功能菌群的活性，加快了厭氧發(fā)酵進(jìn)程，為產(chǎn)甲烷菌群提供了豐富的底物；另一方面，細(xì)菌群落中Geobacter和Methanosarcina豐度增高，研究表明這2 種菌屬能夠在厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中進(jìn)行直接種間電子傳遞(DIET)[41]，石墨烯的導(dǎo)電性比菌毛更高，可以替代c型細(xì)胞色素和導(dǎo)電菌毛成為電子傳遞媒介，為細(xì)胞節(jié)省能量[42]，同時(shí)實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離的電子傳輸，Geobacter氧化有機(jī)物產(chǎn)生的電子通過石墨烯轉(zhuǎn)移到充當(dāng)電子受體的Methanosarcina中用于消耗乙酸/CO2產(chǎn)生CH4，進(jìn)一步促進(jìn)了生物甲烷的生成(圖9)，這也與實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)甲烷高峰期早于對(duì)照組相一致。產(chǎn)氣殘煤表面的羰基碳(C=O)、羧基碳(COO—)在添加石墨烯后分別下降了42.8%和49.5%，說明石墨烯有效促進(jìn)了微生物對(duì)煤的降解。

圖9 石墨烯對(duì)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)強(qiáng)化機(jī)制Fig.9 Enhancement mechanism of graphene to anaerobic digestion system

3 結(jié) 論

(1)在以煤為底物的厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中添加0.4 g/L的石墨烯能夠有效促進(jìn)生物甲烷的產(chǎn)出，添加石墨烯的發(fā)酵系統(tǒng)中累計(jì)甲烷產(chǎn)氣量為5.35 mL/g，比對(duì)照組(4.48 mL/g)高出19.42%。

(2)在發(fā)酵初期，水解菌群(Paraclostridium)和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群(Alcaligenes、Sphaerochaeta)的活性增強(qiáng)，前期積累了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在產(chǎn)甲烷高峰期，添加石墨烯后Methanoculleus豐度降低而Methanosarcina豐度顯著提高，一方面乙酰輔酶A 脫羰基酶/合成酶β 亞基和γδ 亞基作為乙酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，分別增加了233.54%和3.32%，這使得Methanosarcina豐度明顯上升且主要進(jìn)行乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷，說明添加石墨烯的系統(tǒng)對(duì)于發(fā)酵液中各類物質(zhì)的降解速率明顯高于對(duì)照組，說明石墨烯的添加提高了菌群的活性和降解效率，加快了厭氧發(fā)酵進(jìn)程，為產(chǎn)甲烷菌群提供了豐富的底物；

(3)細(xì)菌群落中能夠利用乙酸乙醇類物質(zhì)的Geobacter和Anaerovorax豐度增高，其中豐度升高較明顯的Geobacter可能通過與石墨烯輔助的生物電連接與Methanosarcina進(jìn)行DIET，這種電子傳遞方式在一定程度上加速了生物甲烷的生成。

(4)產(chǎn)氣殘煤表面的羰基碳(C=O)、羧基碳(COO—)在添加石墨烯后分別下降了42.8%和49.5%，說明石墨烯有效促進(jìn)了微生物對(duì)煤的降解。