雅致小克銀漢霉與芽孢桿菌聯(lián)合降解義馬煤產(chǎn)腐植酸

陳林勇 ， 劉建民 ， 崔宇翔 ， 任恒星 ， 趙 晗 ， 趙 娜 ， 宋燕莉 ， 關嘉棟 ， 牛江露 ，李國富 ， 王保玉 ， 何 環(huán)

(1.河南理工大學 資源環(huán)境學院, 河南 焦作 454000；2.煤與煤層氣共采國家重點實驗室, 山西 晉城 048000；3.易安藍焰煤與煤層氣共采技術有限責任公司, 山西 晉城 048000；4.中國礦業(yè)大學 化工學院, 江蘇 徐州 221116；5.中國礦業(yè)大學 煤炭加工與高效潔凈利用教育部重點實驗室, 江蘇徐州 221116)

自20 世紀80 年代COHEN 等[1]發(fā)現(xiàn)微生物可將褐煤降解為黑色液滴以來，微生物溶煤作為煤的清潔高效利用的技術手段之一引起了國內外學者的廣泛關注，基于微生物溶煤的地下煤炭原位生物開采技術被認為是煤炭化學開采關鍵技術之一[2]。經(jīng)過近40 a的發(fā)展，已經(jīng)有上百種與煤降解相關的微生物被分離出來，研究涵蓋了褐煤[3]、亞煙煤[4]、硬煤[5]、風化煤[6]等各種煤，降解的機理可概括為堿性物質[7]、生物氧化酶[8-9]、螯合劑[10]、表面活性劑[11]、酯酶[12]作用。煤的生物降解液可被酸沉淀，沉淀的主要成分為腐植酸(HA)[4,13]。腐植酸的產(chǎn)率通常有3 種計算方法：第1種是通過實驗前后煤的質量差來計算[14-15]，當煤因顆粒較小或被菌絲包裹等原因不易收集時該方法引起的誤差較大；第2 種方式是通過降解液的酸沉淀產(chǎn)物即腐植酸的質量來衡量[16]；第3 種途徑是以降解液在450 nm 處的吸光度來表征[17]，相對于前2 種方法，測量吸光度僅需少量發(fā)酵液，因此更適用于實驗過程的監(jiān)測，用于反映實驗所處的階段。

微生物與煤的作用方式可分為單一菌降解、真菌細菌聯(lián)合培養(yǎng)和菌群發(fā)酵[18]。然而對于真菌細菌聯(lián)合培養(yǎng)對煤的降解作用尚無定論。盧麗麗[12]的研究表明混合菌種對煤的降解率大于單一菌種對煤的降解率，王龍貴等[19]、張明旭等[20-21]的研究具有類似的結論。李非楊[16]的研究則顯示相對單一菌種來說，混合菌對預處理風化煤的液化并未達到很好的效果。MAKA 等[22]報道了一種真菌細菌組合對煤的降解作用，但未做混菌與純菌的對比。

武俐等[23]發(fā)現(xiàn)As、Ba、Co、Ni 和Pb 等微量元素在煤生物氣化過程中從煤中轉移到了降解液，導致降解液微量元素的質量濃度升高。接種嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobaillus ferroxridans)的煤矸石，其錳鉻等金屬元素的釋放明顯增加[24]。這些研究表明在煤的微生物降解過程中金屬元素會發(fā)生遷移轉化，而目前對煤的好氧降解過程中金屬元素在煤與降解液之間的轉移研究較少。

筆者利用從腐木中分離得到的一株真菌和一株細菌開展了聯(lián)合降解義馬煤研究，對降解液及其酸沉淀產(chǎn)物腐植酸進行了分析，為深入分析煤的真菌細菌聯(lián)合降解過程提供參考。

1 材料與方法

1.1 煤樣與菌源

(1)硝酸氧化煤。河南義馬煤，破碎篩分至80～120 目(0.125～0.200 mm)，80 ℃烘干48 h。在500 mL 燒杯中加入煤樣100 g、7.6 mol/L 硝酸150 mL，反應過程中將燒杯放入室溫水中避免反應物溢出，同時不斷攪拌至黃煙消失后靜置反應24 h，用純水清洗煤至上清液pH > 6 后將煤樣在80 ℃下烘干72 h 備用。

(2)菌源。實驗室分離的真菌雅致小克銀漢霉(Cunninghamella elegans)，簡稱F11；細菌芽孢桿菌(Bacillussp.)，簡稱B1。

1.2 培養(yǎng)基

(1) PDA 培養(yǎng)基。市售PDB(環(huán)凱生物)培養(yǎng)基干粉24 g、瓊脂粉25 g、純水定容至1 L。

(2) LB 培養(yǎng)基。蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母粉5 g、純水定容至1 L。LB 固體培養(yǎng)基另加入瓊脂粉12 g。

1.3 實驗方法

1.3.1 真菌細菌混合物聯(lián)合降解

用接種環(huán)從保存的F11 斜面上刮取適量菌絲轉入含有5 mL 無菌水的離心管中，充分震蕩離心管使菌液均勻，取200 μL 菌液滴加于PDA 培養(yǎng)基，用涂布棒均勻涂布，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)5 d，菌絲鋪滿平板。

用接種環(huán)從保存的B1 斜面上蘸取少量菌體轉入含有5 mL 無菌水的離心管中，充分震蕩離心管使菌液均勻，取200 μL 菌液滴加于LB 固體培養(yǎng)基，用涂布棒均勻涂布，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)2 d，菌落鋪滿平板。

在250 mL 三角瓶中加入150 mL LB 培養(yǎng)基，濕熱滅菌后，用打孔器分別接入4 孔真菌(4F)、3 孔真菌+1 孔細菌(3F1B)、2 孔真菌+2 孔細菌(2F2B)、1 孔真菌+3 孔細菌(1F3B)、4 孔細菌(4B)、50 孔真菌+1孔細菌(50F1B)，放入恒溫振蕩器在30 ℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)4 d，加入2 g 滅菌的硝酸氧化煤振蕩均勻，靜置4 h 后取上清液測pH、吸光度A450作為第0 天的數(shù)據(jù)。放入恒溫振蕩器在30 ℃、150 r/min 條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每4 d 取降解液測pH、吸光度A450(尤尼柯，UV-4802)。對照組(CK)的培養(yǎng)基中不接種。每組實驗做3 個平行樣。

1.3.2 降解液中金屬元素質量濃度測定

待A450穩(wěn)定后(A450為降解液在450 nm 處的吸光度)，將降解液在10 000 r/min 下離心10 min，收集上清液，按照HJ 700—2014《水質 65 種元素的測定 電感耦合等離子體質譜法》測上清液中Cr、As、Mn、Pb、Co、Ni、Cu、Zn、Mo 的質量濃度。

1.3.3 腐植酸收集與分析

待A450穩(wěn)定后，將降解液在10 000 r/min 下離心10 min，收集上清液，用鹽酸將上清液pH 調至2 以下[15]，靜置沉淀24 h，10 000 r/min 下離心10 min，收集沉淀(腐植酸)，在80 ℃下烘干48 h 后稱重，根據(jù)腐植酸的質量計算產(chǎn)率。

腐植酸產(chǎn)率計算公式為

式中，ηi為實驗組i的 腐植酸產(chǎn)率，i取1F3B、2F2B、3F1B、50F1B、4B、4F；Mi為實驗組i的腐植酸質量，g；MCK為對照組CK 的腐植酸質量，g；M0為實驗啟動時加煤的質量，g。

取烘干后的腐植酸1 g 加入5 mL 甲醇， 50 ℃浸泡萃取72 h[25]。萃取完成后，將上清液用氮吹儀在45 ℃濃縮至1 mL，采用氣質聯(lián)用儀(Agilent 7890A-5795C)進行組分分析。色譜柱采用Agilent VFWAXms(30 m×250 μm×0.25 μm)，載氣為高純度的氦氣，進樣量0.8 μL，柱流速1.0 mL/min，柱子初始溫度60 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 的速率升溫至250 ℃，保持20 min。分析完成后用NIST08 數(shù)據(jù)庫進行有機物鑒定。

采用島津IRAffinity-1S 對腐植酸進行紅外光譜掃描，樣品與溴化鉀質量比為1∶200，掃描范圍為400～4 000 cm-1，掃描24 次，分辨率0.5 cm-1。

2 結果與討論

2.1 產(chǎn)物元素分析

研究表明，煤的硝酸氧化反應可以將煤中的脂肪結構、酚羥基和醌結構氧化破裂生成腐植酸、草酸和小分子脂肪酸[26]，煤的微生物好氧降解產(chǎn)物是腐殖酸[27]。因此經(jīng)過鹽酸沉淀后對照組的產(chǎn)物是化學提取的腐植酸(chemically extracted humic acid, cHA)，實驗組是生物提取的腐植酸(bio-extracted humic acid,bHA)。由表1 可知，原煤經(jīng)過硝酸氧化后氮、氧質量分數(shù)升高，這是因為煤硝酸氧化反應過程中存在著硝化反應[26]。DONG 等[28]的研究說明褐煤好氧降解過程中腐植酸(bHA)結合了培養(yǎng)基中的氮，VERHEYEN 等[29]研究發(fā)現(xiàn)原煤氧化過程中40%的氫生成了脂肪化合物，其中乙酸、丁二酸和丙二酸是主要產(chǎn)物。本文所用LB 培養(yǎng)基中的蛋白胨和酵母粉都是富含氮元素的試劑，由表1 可知氮、氫質量分數(shù)呈現(xiàn)出bHA >cHA > 氧化煤的趨勢，說明bHA 和cHA 均可結合培養(yǎng)基中的氮且在微生物的作用下bHA 結合氮能力大于cHA，腐植酸生成的過程中還富集了煤中的氫元素，這一現(xiàn)象與文獻[30-31]一致。

表1 樣品元素分析Table 1 Ultimate analysis of samples %

2.2 降解機理分析

以實驗結束時的吸光度及腐植酸質量作圖，結果如圖1 所示，2 組數(shù)據(jù)變化趨勢一致。經(jīng)相關性分析可知其相關系數(shù)為0.998，說明2 者間存在強相關性。將吸光度與產(chǎn)物質量進行線性擬合，如圖2 所示，判定系數(shù)R2=0.997，說明吸光度可以指示煤的降解程度[32]。

圖1 不同組降解液吸光度與腐植酸質量變化趨勢Fig.1 Trend of absorbance of degradation solution and humic acid quality in different groups

圖2 不同組降解液吸光度與腐植酸質量擬合Fig.2 Fitting of absorbance of degradation solution and humic acid quality in different groups

實驗組(1F3B、2F2B、3F1B、50F1B、4B、4F)及對照組(CK)的產(chǎn)物質量分別為1.23、1.38、1.34、1.31、1.25、1.20、0.03 g，根據(jù)式(1)計算得混合菌(1F3B、2F2B、3F1B、50F1B)降解的產(chǎn)物產(chǎn)率分別為60.00%、67.17%、65.17%、63.67%，真菌(4F)、細菌(4B)分別為58.17%、61.00%，降解率整體上呈現(xiàn)出混合菌大于純菌、細菌大于真菌的規(guī)律。

實驗過程中各組的pH 變化規(guī)律如圖3 所示，對照組(CK)的pH 從5.33 緩慢降低到4.46 后穩(wěn)定，與文獻報道的現(xiàn)象一致[31,33]，而實驗組的pH 從第4 天至實驗結束在7.86～8.72 的堿性范圍內波動，說明真菌、細菌及其混合物在實驗過程中產(chǎn)生了堿性物質。純菌作用下的pH 始終略低于混合菌，結合吸光度變化規(guī)律(圖4)可知相應的混合菌的降解率高于純菌，說明真菌細菌聯(lián)合降解煤時具有相互促進的作用，混合菌產(chǎn)生的堿性物質比純菌多，堿性物質在煤降解過程中發(fā)揮了重要作用。實驗啟動時，真菌實驗組的pH 與其他實驗組相差約1，而吸光度則約為其他實驗組的1/3，也說明了堿性物質對煤降解產(chǎn)生了重要影響。

圖3 不同組降解液pH 變化趨勢Fig.3 Trend of pH in different degradation solutions

圖4 不同組降解液吸光度變化趨勢Fig.4 Trend of absorbance in different degradation solutions

2.3 降解液金屬元素變化規(guī)律

如圖5 所示，Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Mo、Pb 等9 種金屬元素在對照組(CK)中均檢出，說明即使無微生物的降解作用也會有一定量的金屬元素從煤中遷移到降解液中，這是因為強酸氧化處理過的煤即使無生物或化學試劑的作用也可在水中部分溶解[34]。

圖5 降解液中金屬元素質量濃度分布Fig.5 Distribution of metal element content in degradation solution

Cr、Co、Ni、Cu、Zn、As、Mo、Pb 等8 種金屬元素在實驗組降解液中質量濃度高于對照組(CK)，說明真菌、細菌及其混合物在降解煤的同時具有促進金屬元素從煤中向降解液中遷移的作用，這與武俐等[23]在煤的生物氣化過程中發(fā)現(xiàn)的As、Ba、Co、Ni 和Pb 等金屬元素元素從煤中轉移到了降解液的現(xiàn)象類似。

將金屬元素質量濃度與吸光度進行線性擬合，結果如圖6 和表2 所示，Cr、As、Pb、Ni、Cu、Mo 等6種金屬元素與A450擬合的判定系數(shù)(R2)大于0.6 且模型檢驗結果為顯著，即Cr、Ni、Cu、As、Mo、Pb 與A450正相關，也即煤降解液中的金屬元素Cr、Ni、Cu、As、Mo、Pb 質量濃度越高，相應的煤降解率也越高。

圖6 金屬元素質量濃度與吸光度擬合Fig.6 Fitting of metal element content and absorbance

表2 金屬元素與吸光度擬合參數(shù)Table 2 Fitting parameters of metal elements and absorbance

如圖6(d)所示，Mn 元素在對照組(CK)中質量濃度高于細菌實驗組(4B)，與吸光度間無顯著的相關關系。對照組中含有錳元素說明煤中含有該元素。一方面由上文分析可知細菌(4B)實驗組的煤發(fā)生了降解，因此煤中的Mn 元素會轉移至降解液中導致Mn元素質量濃度升高。另一方面，微生物分離過程中發(fā)現(xiàn)真菌F11 和細菌B1 均可使苯胺藍平板褪色而苯胺藍可以指示錳過氧化物酶的存在，說明兩株菌均可產(chǎn)生錳過氧化物酶。研究表明錳過氧化物酶的反應需要Mn 的參與[35-36]，因此降解液中的錳因參與反應而導致質量濃度降低。綜上所述，在煤的降解過程中Mn 元素存在著釋放與利用平衡?；旌暇鷮嶒灲M的Mn 元素質量濃度高于對照組(CK)且與之存在顯著差異(P< 0.05)，說明真菌與細菌混合具有協(xié)同作用，錳元素的釋放大于利用，因此在降解液中的質量濃度升高，這與pH 分析的結果一致。Co、Zn 的質量濃度與吸光度間無顯著的相關關系，具體原因還有待進一步研究。

2.4 腐植酸甲醇萃取物GCMS 分析

由圖7 及表3 可知，2、3、9、11、13、14、18、19號峰為對照組及實驗組共有的峰，對應的化合物為乙二酸、十六烷酸、十八烷酸、吡咯、4 種吡咯衍生物。

圖7 不同組腐植酸甲醇萃取物GCMSFig.7 GCMS of methanol extracts of humic acid in different groups

表3 腐植酸甲醇萃取物GCMS 定性結果Table 3 GCMS qualitative results of methanol extracts of humic acid

由對照組、4F、4B 組的色譜圖(圖7)可知，7、17號峰僅出現(xiàn)在4F 實驗組，因此對應的化合物十八甲基環(huán)九硅氧烷、順-13-二十二碳烯酸為真菌特征性產(chǎn)物。1、6、16 號峰僅出現(xiàn)在4B 實驗組，對應的N-乙基吡咯、苯乙酸、4-羥基苯乙酸為細菌的特征性產(chǎn)物。結合混合菌實驗組的色譜圖可知，細菌的特征性產(chǎn)物在混合菌實驗組中檢出而真菌的特征性產(chǎn)物則未檢出，說明混合后細菌占主導作用。由圖3 可以看出，在整個實驗周期內尤其是第4 天之前混合菌降解液的pH 始終與細菌降解液接近，也從側面說明混合后細菌占主導作用。

4、5、8、10、12 號峰在對照組未檢出，其中4、5號峰定性為丁二酸，8、10 號峰為長鏈脂肪酸(C13、C14、C15)、揮發(fā)性脂肪酸(C3、C4、C5)，12 號峰為2種吡咯衍生物。與對照組的cHA 相比，除了共有的十六烷酸(C16)、十八烷酸(C18)、4 種吡咯衍生物之外，實驗組的bHA 中含有更多脂肪鏈較短、分子量較小的脂肪酸和種類更豐富的吡咯衍生物。GHANI M J等[13]的研究表明相對于cHA，bHA 的分子量和芳香性降低，與本文的研究結果類似。

15 號峰在實驗組及對照組均可定性為芳香族化合物，在對照組為含氧稠雜環(huán)化合物，在實驗組中為含氮稠雜環(huán)化合物或有含氮官能團的化合物，說明bHA 的含氮化合物更多，與元素分析的結果一致。

2.5 腐植酸紅外光譜分析

如圖8 所示，各組產(chǎn)物的紅外光譜圖相似，3 500～2 000 cm-1有一個彌散的強吸收譜帶，對應羧基COOH 的O—H 和NH+伸縮振動[37]。2 362 cm-1處為羧基的氫鍵締合伸縮振動[38-39]。1 720、1 666 cm-1處為羰基C=O 的伸縮振動[37,40-41]。1 543、1 407 cm-1處苯環(huán)骨架振動[37]。說明腐植酸大分子的基本結構含有芳香環(huán)并富含羧基、羥基、羰基等活性官能團。如前文所述，實驗組含有更多的含氮稠雜環(huán)化合物或含氮官能團，其中吡咯、呋喃和噻吩的結構是與苯環(huán)類似封閉的芳香共軛體系[42]。雜環(huán)的骨架吸收峰與苯環(huán)相似[43]，因此在1 407 cm-1處吸收峰比對照組強。

圖8 不同組腐植酸紅外光譜Fig.8 FTIR of humic acid in different groups

3 結 論

(1)雅致小克銀漢霉(C.elegans)和芽孢桿菌(Bacillussp.)均可通過堿性物質作用機理實現(xiàn)硝酸氧化煤的降解，腐植酸產(chǎn)率分別為58.17%、61.00%。兩株菌混合具有協(xié)同作用，腐植酸產(chǎn)率可提高到67.17%。

(2)芽孢桿菌(Bacillussp.)的特征性產(chǎn)物在混合菌實驗組中檢出而雅致小克銀漢霉(C.elegans)的特征性產(chǎn)物則未檢出，混合菌降解液的pH 始終與芽孢桿菌(Bacillussp.)降解液接近，說明混合后芽孢桿菌(Bacillussp.)占主導作用。

(3)在煤的生物降解過程中Cr、As、Mn、Pb、Co、Ni、Cu、Zn、Mo 等9 種金屬元素從煤遷移到了降解液中，其中Cr、Ni、Cu、As、Mo、Pb 等6 種與吸光度A450具有顯著的正相關性，可以表征煤降解率的相對大小。Mn 在煤的生物降解過程中存在釋放與利用平衡。

(4) cHA 與bHA 均富含羧基、羥基、羰基等活性官能團、含有長鏈脂肪酸、4 種吡咯衍生物。同時，bHA 還含有分子量較小的脂肪酸(C3、C4、C5、C13、C14、C15)及含氮化合物，bHA 結合氮、富集氫的能力大于cHA。