A 型塞內(nèi)卡病毒膠體金免疫層析抗原檢測試紙的研制

安滿鑫，魏子宇，陳玉瀟，呂 蘭，吳文璇，袁萬哲,2，馬 明，李麗敏,2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000；3.瑞普生物藥業(yè)有限公司，河北 保定 071000）

A 型塞內(nèi)卡病毒（Senecavirus A，SVA）是一種于2002 年在細胞培養(yǎng)物中首次發(fā)現(xiàn)的無包膜小核糖核酸病毒［1］。2008 年和2012 年分別在加拿大和美國報道了SVA 引起豬水皰病的病例，之后人們逐漸開始關(guān)注塞內(nèi)卡病毒病［2］。近年來，巴西、美國、越南、哥倫比亞、中國等陸續(xù)出現(xiàn)豬SVA 水皰病，我國于2015 年3 月份在廣東省報道了首例SVA 水皰病疫情［3］。隨后，SVA 疫情陸續(xù)在我國湖北，黑龍江，福建，河南，甘肅，廣西等省份出現(xiàn)［4］，這表明SVA 在我國豬場內(nèi)普遍存在。自然感染SVA的豬會出現(xiàn)與口蹄疫、水泡性口炎等水皰性病毒病相似的癥狀［5］，但感染母豬在10～15 d 后可很快恢復(fù)，死亡率約為0.2%［6］。該病毒對仔豬危害較大，新生仔豬感染后死亡率最高可達70%［7］，仔豬感染SVA 后臨床癥狀主要表現(xiàn)為嗜睡、腹瀉、皮膚充血、神經(jīng)癥狀和猝死［8］，因此需要快速且準確的檢測方法對該病進行檢測以減少養(yǎng)豬業(yè)的損失。

免疫層析技術(shù)由于其快速、簡單、經(jīng)濟和非技術(shù)人員可使用的優(yōu)點被廣泛接受，使其成為迄今為止最成功的現(xiàn)場檢測方法之一［9］。近年來，雖有關(guān)于以VP1 蛋白為標靶檢測SVA 的免疫層析試紙的報道［10］，但有研究表明SVA VP2 蛋白具有比VP1和VP3 蛋白更高的抗體親和力和更高的免疫原性，且VP2 蛋白比VP1 和VP3 蛋白更保守［11］。因此，本研究認為VP2 蛋白比VP1 和VP3 蛋白更適合作為檢測的靶蛋白。綜上所述，本研究基于本實驗室保存的重組pET32a(+)-SVA VP2 蛋白制備的SVA VP2 蛋白單克隆抗體為基礎(chǔ)，研制了膠體金免疫層析試紙，以期提供一種在臨床上更加快速準確的檢測SVA 的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

6 周齡的BALB/c 小鼠購買自河北伊維沃生物科技有限公司（No.20220713）；SP2/0 細胞、BHK-21 細胞、重組pET32a(+)-SVA VP2 蛋白、豬瘟活疫苗、豬口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗均由本實驗室保存；SVA 感染性克隆毒株由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品衛(wèi)生與檢驗實驗室提供。

MONTANIDE ISA 201 VG 佐劑為SEPPIC 公司產(chǎn)品；HRP-羊抗鼠IgG 購于北京博奧龍生物科技有限公司；羊抗鼠IgG、TMB 顯色液購于北京索萊寶科技有限公司；DAB 顯色液、FITC-羊抗鼠IgG 購于中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RMPI 1640 培養(yǎng)基購于Gibco 公司、DMEM 培養(yǎng)基購于韋森特生物技術(shù)有限公司、胎牛血清購于Dogesce 公司；HAT 選擇培養(yǎng)基、HT 培養(yǎng)基、氯金酸為Sigma 公司產(chǎn)品；檸檬酸三鈉、無水碳酸鉀購于天津福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 單克隆抗體的制備

用純化的重組SVA VP2 蛋白［12］與MONTANIDE ISA 201 VG 佐劑按照4 ∶1 混合乳化，頸背部皮下多點免疫6 周齡BALB/c 小鼠（50 μg/只，200 μL），首次免疫后14 d 和28 d 進行第2 次免疫和第3 次免疫，第2 次和第3 次免疫劑量與途徑同首次免疫相同。融合前3 d 腹腔免疫100 μg VP2 蛋白。將免疫脾細胞與SP2/0 細胞進行融合，利用HAT 進行培養(yǎng)，用間接ELISA 和間接免疫熒光篩選陽性細胞，進行多次亞克隆直至篩選出穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株，采用小鼠體內(nèi)誘生腹水法大量制備VP2 單抗，并進行相關(guān)特性鑒定。

1.3 抗原檢測試紙條的制備

1.3.1 膠體金顆粒的制備與鑒定 參考文獻［13］中的方法制備膠體金溶液，將制備好的溶液冷卻至室溫后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒛z體金顆粒經(jīng)磷鎢酸負染后通過透射電子顯微鏡觀察粒徑以及均一度。

1.3.2 最佳標記pH 及標記抗體量的確定 用K2CO3溶液將1 mL 膠體金溶液調(diào)節(jié)成不同pH，加入1D6 抗體靜置15 min 后加入10%氯化鈉溶液，混勻靜置2 h，觀察顏色變化。同時參考文獻［14］中的方法，離心后檢測OD520nm的值，吸光度最高的溶液的pH 作為最佳標記pH。用K2CO3溶液將膠體金溶液調(diào)節(jié)至最佳標記pH，向1 mL 膠體金溶液中加入不同量的1D6 抗體，靜置15 min 后加入10%氯化鈉溶液，混勻靜置2 h，觀察顏色變化，顏色最先與對照管保持一致的管的抗體量為穩(wěn)定膠體金溶液的最低抗體量，在此基礎(chǔ)上增加20%作為最佳抗體標記量。

1.3.3 金標抗體及金標墊的制備 將膠體金溶液調(diào)節(jié)至最佳pH，加入最佳標記量的1D6 抗體，攪拌60 min 后加入終濃度4%的BSA 繼續(xù)攪拌40 min，將制備好的膠體金溶液10 000 r/min 離心40 min，棄上清，重懸沉淀，0.45 μm 濾膜過濾后4 ℃?zhèn)溆?。金標墊經(jīng)處理后浸泡于金標抗體懸液中吸附1 h，烘干后裁剪備用。

1.3.4 檢測線和質(zhì)控線抗體工作濃度的確定 將2C2 抗體稀釋不同濃度印記于NC 膜作為檢測線（T線），將羊抗鼠IgG 稀釋為2 mg/mL 作為質(zhì)控線（C線）印記于NC 膜，組裝試紙條粗品，向樣品墊滴加50 μL 500 μg/mL 的SVA VP2 蛋白進行檢測，根據(jù)顏色變化確定檢測線抗體最佳工作濃度，以同樣的方法確定質(zhì)控線抗體最佳工作濃度。

1.3.5 試紙條的組裝及結(jié)果判定 將裁剪好的試紙條的各個部分按照如圖1 所示進行組裝，各個部分重疊2 mm。滴加樣品后，若只有C 線出現(xiàn)顏色反應(yīng)，則判為陰性；若T 線、C 線均出現(xiàn)顏色反應(yīng)則判為陽性；若只有T 線出現(xiàn)顏色或T 線、C 線均無顏色則判為檢測無效。

圖1 試紙條組裝示意圖Fig. 1 Diagram of test strip assembling

1.4 試紙條性能檢測

1.4.1 敏感性與特異性試驗 將103.588TCID50/mL的SVA 病毒液做2 倍比稀釋，使用制備的試紙條進行檢測，確定試紙條的檢測限。使用試紙條檢測SVA 病毒液和豬瘟活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗、豬口蹄疫O 型、A 型二價滅活苗，判斷試紙條是否與其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.4.2 重復(fù)性實驗 制備不同批次的試紙條，分別檢測5 份不接毒的BHK-21 細胞培養(yǎng)上清（陰性）和5 份接毒后培養(yǎng)24 h 的BHK-21 細胞培養(yǎng)上清（陽性），每個樣品重復(fù)3 次，計算變異系數(shù)。

1.4.3 臨床樣品檢測 PCR 方法常被認為是病毒檢測的金標準［15］，因此用本研究研制的膠體金免疫層析試紙檢測本實驗室保存的27 份疑似感染SVA的經(jīng)研磨處理的組織研磨液樣品（淋巴結(jié)7 份、脾7 份、肺10 份、腎2 份、肝1 份），同時用RTPCR 方法進行檢測，對比觀察兩者的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單克隆抗體的鑒定

2.1.1 效價及飽和稀釋度檢測 使用間接ELISA 方法檢測了1D6 和2C2 抗體的效價及飽和稀釋度，經(jīng)檢測，1D6 和2C2 抗體的細胞培養(yǎng)上清效價分別為1 ∶2 560 和1 ∶5 120，腹水效價均為1 ∶1.56×106，兩者飽和稀釋度分別為1 ∶160 和1 ∶2 560。1D6和2C2 均具有較高的抗體效價，說明這2 株雜交瘤細胞株具有較強的抗體分泌能力。

2.1.2 抗體亞型鑒定 經(jīng)小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定，2 株單抗輕鏈均為Kappa 型，重鏈均為IgG1 型。

2.1.3 免疫活性鑒定 Western blot 鑒定結(jié)果如圖2A 所示，2 株單抗均能與SVA VP2 蛋白發(fā)生特異性結(jié)合；間接免疫熒光檢測結(jié)果如圖2B 所示，2 株單抗均能與SVA 病毒結(jié)合出現(xiàn)特異性熒光，陰性對照未出現(xiàn)熒光。以上結(jié)果表明，2 株單抗均具有良好的免疫活性。

圖2 單克隆抗體免疫活性鑒定Fig. 2 Identification of immunological activity of monoclonal antibodies

2.1.4 單抗識別表位分析 參考文獻［16］的方法分析單抗識別的表位，結(jié)果如表1 所示，2 株單抗互相疊加的AI 值均大于10%，說明1D6 和2C2 這2 株單克隆抗體識別不同的表位。

表1 抗原識別位點分析Table 1 Analysis of antigen recognition site

2.1.5 單克隆抗體的純化 使用飽和硫酸銨粗提IgG，SDS-PAGE 檢測抗體的純化效果，結(jié)果如圖3所示，2 株單抗均在50 kD 附近和25 kD 附近出現(xiàn)了清晰、單一的重鏈和輕鏈，表明純化效果較好。

圖3 單抗腹水純化結(jié)果Fig. 3 Purification of monoclonal antibody ascites

2.1.6 親和常數(shù)檢測 參考文獻［17］中的ELISA方法計算親和常數(shù)，親和常數(shù)≈150 000×A/抗體濃度，式中150 000 為IgG 抗體分子量，A 代表曲線達到平臺期時的1/2OD 值所對應(yīng)的抗體稀釋倍數(shù)，抗體濃度以mg/mL 表示。經(jīng)計算，單抗1D6 和2C2的親和常數(shù)分別為5.4×109和4.2×109，均具有較高的親和力。

2.2 試紙條的制備

2.2.1 膠體金顆粒的鑒定 膠體金溶液物理外觀如圖4A 所示，顏色酒紅，通體透亮，無沉淀。膠體金顆粒在透射電鏡下的觀察結(jié)果如圖4B 所示，金顆粒形態(tài)較均一，平均粒徑約為20 nm，多為圓形或橢圓形，無不規(guī)則形狀顆粒，說明制備的膠體金溶液質(zhì)量較好。

圖4 膠體金溶液質(zhì)量鑒定Fig. 4 Quality identification of colloidal gold solution

2.2.2 抗體最佳標記pH 及最佳標記量的確定 當每毫升膠體金溶液添加2、4、6、8、10 μL K2CO3溶液時其顏色與對照管接近，因此將其離心后檢測上清中OD520nm的值，結(jié)果如圖5A 所示，當每毫升膠體金溶液添加8 μL K2CO3溶液時OD 值最高，說明抗體與金顆粒結(jié)合較好，因此以每毫升膠體金溶液添加8 μL K2CO3溶液時的pH 作為最佳標記pH，試紙檢測pH 約為8.0；最佳抗體標記量的優(yōu)化結(jié)果如圖5B 所示，8 號管膠體金溶液顏色最先與對照管保持一致且不在發(fā)生明顯變化，因此8 號管所對應(yīng)的抗體量30 μg 被認為是穩(wěn)定1 mL 膠體金溶液所需的最低抗體量，在此基礎(chǔ)上增加20%作為最佳抗體標記量，即單克隆抗體1D6 的最佳標記量為36 μg/mL。

圖5 抗體標記條件的優(yōu)化Fig. 5 Optimization of antibody labeling conditions

2.2.3 檢測抗體與質(zhì)控抗體工作濃度的確定 如圖6A 所示，當檢測抗體2C2 濃度為2、1.5 和1 mg/mL時，檢測線顏色清楚且彼此之間差別不大，將檢測抗體2C2 濃度降為0.5 mg/mL 時檢測線顏色明顯變淡且不易觀察，因此以1 mg/mL 的濃度作為單克隆抗體2C2 的最適工作濃度。同理如圖6B 所示，當羊抗鼠IgG 濃度為以1.5 mg/mL 時，C 線顏色清晰易于觀察，因此以1.5 mg/mL 的濃度作為羊抗鼠IgG 抗體的最適工作濃度。

圖6 檢測線與質(zhì)控線工作濃度的篩選Fig. 6 Selection of working concentration for detection and quality control lines

2.3 試紙條性能鑒定

2.3.1 敏感性與特異性試驗 將SVA 病毒液稀釋4個梯度用試紙條進行檢測，結(jié)果如圖7A 所示，當病毒滴度為4.8×102TCID50/mL 時出現(xiàn)微弱條帶，進一步稀釋則沒有條帶，表明試紙條的檢測限為4.8×102TCID50/mL。特異性檢測結(jié)果如圖7B 所示，試紙條僅能檢測SVA，與其他病毒在T 線處沒有顏色反應(yīng)，說明制備的試紙條具有良好的特異性。

圖7 試紙條的敏感性與特異性試驗Fig. 7 The sensitivity and specificity assay of the strip

2.3.2 重復(fù)性試驗 重復(fù)性結(jié)果如表2 所示。

表2 重復(fù)性試驗Table 2 Results of repetitive experiments

表3 臨床樣品檢測Table 3 Test results of clinical samples

使用3 個不同批次的試紙條檢測5 份陰性樣品（編號1～5）和5 份陽性樣品（編號6～10），每個樣品重復(fù)3 次，結(jié)果均一致，批間批內(nèi)變異系數(shù)均為0，說明制備的試紙條具有良好的重復(fù)性。

2.3.3 初步臨床應(yīng)用 27 份疑似感染SVA 的臨床樣品用RT-PCR 方法進行過鑒定，結(jié)果皆為陰性；用本研究的膠體金免疫層析試紙檢測27 份臨床樣品結(jié)果同樣均為陰性，結(jié)果與RT-PCR 檢測方法結(jié)果一致，2 種方法對樣品檢測結(jié)果的一致率為100%。

3 結(jié)論與討論

目前國內(nèi)外已報道了多種SVA 抗原的檢測方法，主要是各種PCR 技術(shù)，如王晨［18］等人建立的熒光定量PCR 方法，可檢測10 copies/μL 的樣品；Feronato［19］等建立了SVA 首個高敏感、高特異的巢式PCR 檢測方法，檢測限可達0.0181 ng/μL，但檢測結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性；Zhang［20］等建立了隔熱等溫PCR 用來現(xiàn)場檢測SVA 抗原，具有良好的敏感性和特異性，但敏感性并不及熒光熒光定量PCR方法。這些檢測方法雖然各有各的優(yōu)點，但是其對檢測人員技術(shù)要求較高，且檢測時間相對較長、成本較高且需要依賴昂貴的儀器設(shè)備，導(dǎo)致這些方法雖有不錯的檢測性能，但是并不適合在基層豬場大范圍普及與推廣?，F(xiàn)有的SVA 的檢測技術(shù)從實驗室到臨床實際應(yīng)用存在一定的局限，仍需解決技術(shù)和成本問題，研發(fā)一種更加靈活、經(jīng)濟的檢測工具以用于SVA 的檢測［21］。膠體金免疫層析技術(shù)作為一種免疫學(xué)檢測方法，有著檢測速度快，操作便捷，便于攜帶，經(jīng)濟實惠等特點，在豬病檢測領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景［22］。張濤［10］等人基于VP1蛋白單克隆抗體所制備的試紙的靈敏度為5×101.13TCID50/mL，檢測時間為10～15 min，本研究所制備試紙的靈敏度（4.8×102TCID50/mL）與其相比雖然較低，但本研究所制備試紙的檢測時間更快，5 min 即可判讀結(jié)果。VP2 蛋白的保守性比VP1 蛋白更高［11］，意味著該基因在不同毒株中的變異情況較少，這使得該檢測方法更具特異性、對病毒檢測的準確性更高。

目前在檢測疑似感染SVA 的臨床樣品時僅檢測到了陰性，并未檢出陽性，后續(xù)若能收集到陽性樣品則會對其進行補充。另外，試紙的制備為純手工制作，金標墊采用浸泡的方式制備，對比機器噴涂的方式金標墊烘干后可能會出現(xiàn)金標抗體分布不均勻的情況從而影響檢測性能，若能使用儀器設(shè)備大規(guī)模生產(chǎn)或者繼續(xù)篩選出親和力更高的單克隆抗體，則可能會進一步降低檢測限，提高檢測性能。

綜上所述，本研究基于SVA VP2 蛋白單克隆抗體制備了膠體金免疫層析試紙，具備良好的敏感性、特異性及重復(fù)性，且操作簡單、方便，為臨床上SVA 疾病診斷和防控提供了新的選擇。