1 株產(chǎn)單寧酶戊糖片球菌的篩選及功能評價

池耀卿，盧海強(qiáng)，王衛(wèi)正，毛若雨，田洪濤，谷新晰

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北斐默特生物科技有限公司，河北石家莊 052460；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 飼料所，北京 10081)

單寧是一類天然多酚物質(zhì)，廣泛存在柿子、葡萄及山楂等水果中。單寧具有較強(qiáng)的生理活性，如抗氧化性、抗炎癥活性和預(yù)防動脈粥樣硬化的作用等，但食用過多的單寧往往會對身體造成不同程度的損傷，如單寧可與其他消化酶、淀粉和蛋白質(zhì)形成復(fù)雜的反應(yīng)，形成“柿結(jié)石”［1］。Sharma 等［2］人報(bào)道，攝入高濃度單寧可引起氨基酸和蛋白質(zhì)大量排泄，消化道黏膜受損。此外，這些單寧也會對食品風(fēng)味及口感造成極大影響。目前，物理法、化學(xué)法及生物酶法在單寧的消減中均取得了較好的效果。但是，食品除了基本的安全及營養(yǎng)訴求外，色、香、味、體等也是重要品質(zhì)特征，這使得物理法和化學(xué)法在食品中單寧的消減中的應(yīng)用受到限制，而生物酶解法因零污染、效率高、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)已成為食品單寧物質(zhì)消減的主要策略，其中單寧酶的挖掘是生物酶法的關(guān)鍵技術(shù)。

單寧酶(Tannase，EC 3.1.1.20) 是一類可水解單寧中的沒食子酯鍵，釋放葡萄糖和沒食子酸的酶類［3］，其廣泛的分布在動物、植物和微生物中［4］。目前，微生物來源的單寧酶具有較高的酶活力、較好的穩(wěn)定性及生產(chǎn)的便利等特征，是目前單寧酶的主要來源［5］。在過去150 多年來，許多研究小組對真菌單寧酶進(jìn)行了深入分析，如青霉屬和曲霉屬［6］，但乳酸菌單寧酶卻鮮有報(bào)道，僅限于乳桿菌、酒球菌等。如Kanpiengjai 等［7］人從傳統(tǒng)發(fā)酵茶葉分離出的戊酸乳桿菌BA-7 不僅可以降解單寧，還可以提高茶葉抗氧化能力。到目前為止，并未有其他乳酸菌產(chǎn)單寧酶的相關(guān)報(bào)道。乳酸菌是一類產(chǎn)乳酸細(xì)菌的總稱，是一類重要的發(fā)酵食品生產(chǎn)用菌，并往往賦予產(chǎn)品特殊的生理功能，如抗氧化性、抑菌性能及腸道的免疫活性等。因此，挖掘具有單寧酶活性的乳酸菌具有重要的理論和應(yīng)用價值。

本研究以篩選產(chǎn)單寧酶的乳酸菌為目標(biāo)，開展菌株生物學(xué)特征、酶學(xué)性質(zhì)表征及功能特征等研究，并進(jìn)行菌株的基因組測定分析，進(jìn)一步全面解析菌株的應(yīng)用潛力，為菌株的開發(fā)利用提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

微生態(tài)制劑、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190、大腸埃希菌ATCC 25922、單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC 19115 和弗氏志賀氏菌CGMCC1.1868 由本課題保存。

羅丹寧、沒食子酸正丙酯 上海源葉生物科技有限公司；甲醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛膽鹽 北京索萊寶科技有限公司；DPPH 梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

MRS 培養(yǎng)基：牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、葡萄糖20 g、無水乙酸鈉5 g、檸檬酸銨2 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.2 g、1 mL吐溫80，蒸餾水1 000 mL，115 ℃滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：單寧酸1 g、蔗糖10 g、NaNO33 g、磷酸氫二鉀1 g、KCL 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g，121 ℃滅菌20 min。單寧酶篩選培養(yǎng)基：100 mL MRS 培養(yǎng)基中加入溴甲酚紫0.04 g、單寧酸1 g，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 將0.1 g 微生態(tài)制劑加入至無菌水中震蕩活化2 h，隨后將菌液梯度稀釋，涂布至單寧酶篩選培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3～5 d，菌落周圍出現(xiàn)黃色圈的菌株為陽性菌株，于4 ℃保存?zhèn)溆?。將陽性菌株涂布于乳酸菌篩選培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)24 h，挑取有透明圈的菌落并進(jìn)行純化，于4 ℃保存。參考Sharma 等［8］人的方法進(jìn)行單寧酶活性測定，以每分鐘生成1 μmol 沒食子酸所需的酶量為1 個酶活力單位(U)。

1.2.2 菌株的鑒定 ①形態(tài)觀察。將菌株STS-6 涂布于MRS 培養(yǎng)基平板，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落的形狀、大小、顏色、及生長狀況等情況，并進(jìn)行革蘭氏染色。

②16S rDNA 分子鑒定。菌株STS-6 接種至100 mL 液體MRS，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，離心收集菌體。采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(天根生物，DP302)提取基因組，并使用PCR 擴(kuò)增引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 和1 492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')進(jìn)行PCR 反應(yīng)。采用瓊脂糖回收試劑盒(天根生物，DP209)進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，并送至北京金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。采用軟件BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性分析，采用軟件MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株STS-6 的生長及產(chǎn)酶特性分析。菌株STS-6 接種于50 mL 產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)，每隔4 h 取1 次樣，OD600測定吸光值及酶活力，繪制菌株的生長曲線及產(chǎn)酶曲線。將菌株STS-6 接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h 后，離心(12 000 r/min，10 min)收集菌體及發(fā)酵上清，收集備用。采用超聲波破碎儀裂解菌體并溶解于緩沖液中，制備細(xì)胞內(nèi)酶液。將細(xì)胞重懸于緩沖液中，制備菌體細(xì)胞溶液。分別測定細(xì)胞內(nèi)酶液、菌體細(xì)胞及發(fā)酵上清的酶活力，探究產(chǎn)菌株的單寧酶分布特性。

1.2.4 單寧酶的酶學(xué)特性表征 ①溫度對單寧酶活性的影響。參照1.2.1 中單寧酶測定方法，酶液與底物在20～90 ℃的溫度條件下反應(yīng)測定單寧酶的最適反應(yīng)溫度，以最高酶活力為100%。將酶液分別在50 ℃和70 ℃處理0、5、10、20、30 和60 min，在最適溫度和pH 條件下測定單寧酶活性，分析其溫度穩(wěn)定性。以未經(jīng)處理的酶液做對照，其酶活力定為100%。

②pH 對單寧酶活性的影響。在最適溫度條件下，酶液與不同pH(2.0～12.0)的底物進(jìn)行反應(yīng)，測定單寧酶最適pH，以最高酶活力為100%。將酶液置于不同pH(2.0～12.0)緩沖液中，冰浴1 h 后，在最適溫度和pH 條件下測定單寧酶活性，分析其pH 穩(wěn)定性，以未經(jīng)處理的酶液做對照，其酶活力定為100%。

③金屬離子和化學(xué)試劑對單寧酶活性的影響。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中分別加入金屬離子、表面活性劑SDS、吐溫80、CTAB、金屬離子螯合劑EDTA 及甲醇、乙醇和異丙醇等有機(jī)試劑，使其終摩爾濃度分別為1 和5 mmol/L，按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行酶活力的測定，以未處理的酶液為對照組，其酶活力定為100%。

1.2.5 菌株STS-6 的益生功能特性分析 ①菌株胃腸液耐受性測定。參考Jeon 等［9］人方法對菌株STS-6 和商業(yè)菌株植物乳桿菌ST-Ⅲ（Lactobacillus plantarumST-Ⅲ）分別進(jìn)行胃腸液耐受性分析。

②菌株自聚和共聚能力測定。參考Huang 等［10］人方法分別對菌株STS-6 和植物乳桿菌ST-Ⅲ進(jìn)行自聚能力和共聚能力分析。

③抗氧化能力的測定。將菌株STS-6 接種至MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，離心(12 000 r/min，10 min)，收集上清液，并通過冷凍干燥機(jī)凍干成粉末。稱取1、2、3、4、5、6 mg 粉末分別溶于1 mL蒸餾水中，配制成濃度為1～6 mg/mL 的待測樣品。參考Ilavenil 等［11］人的方法進(jìn)行清除DPPH 自由基能力測定；參考Wang 等人［12］的方法進(jìn)行總還原能力的測定；參考Ines 等人［13］的方法進(jìn)行DNA 損傷保護(hù)測定。

1.2.6 菌株STS-6 的基因組測序及數(shù)據(jù)分析 采用Illumina Hiseq 和PacBio 的測序方式對菌株STS-6進(jìn)行全基因組測序，利用Glimmer，GeneMarkS，Prodigal 軟件對基因組中的編碼基因(CDS)進(jìn)行預(yù)測，并對預(yù)測得到的編碼基因進(jìn)行功能注釋，探究益生基因的分布研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選及鑒定

從微生態(tài)制劑中篩選出1 株高產(chǎn)單寧酶的乳酸菌STS-6(圖1 A)，菌株STS-6 在MRS 培養(yǎng)基中菌落呈圓形，乳白色，光滑，凸起，邊緣整齊，不透明(圖1 B)，為革蘭氏陽性菌，菌體形態(tài)為球狀，符合乳酸菌外觀特征(圖1 C)。經(jīng)序列比對及進(jìn)化樹分析，菌株STS-6 與P.pentosaceus親緣性最高，序列一致性99%以上(圖1 D)。

圖1 菌株STS-6 的鑒定Fig. 1 Identification of strain STS-6

2.2 菌株STS-6 的生長及產(chǎn)酶特性分析

菌株STS-6 生長變化情況如圖2 A 所示，該菌以體積分?jǐn)?shù)1%接菌培養(yǎng)8 h 進(jìn)入穩(wěn)定期。通過對單寧酶活力測定分析，單寧酶的產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時間的增加，表現(xiàn)出先增加再減少的趨勢。該菌隨著菌株的生長，單寧酶的產(chǎn)量也在逐漸增加，直至培養(yǎng)36 h，單寧酶的產(chǎn)量達(dá)到最大值，為1.6 U/mL，隨后單寧酶的產(chǎn)量則逐漸降低。

圖2 菌株STS-6 的生長及產(chǎn)酶特性Fig. 2 Growth and enzyme-producing characteristics of strain STS-6

經(jīng)測定，菌株STS-6 的多個部位均檢測到單寧酶活性(圖2 B)，其中發(fā)酵上清酶活力最高（約55 %），除此以外，在細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)具有一定的酶活力，上述結(jié)果表明菌株STS-6 產(chǎn)生的單寧酶主要以胞外酶為主。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 溫度對單寧酶活力的影響 研究發(fā)現(xiàn)該單寧酶在20～90 ℃溫度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出一定的酶活力，最適溫度為60 ℃，在40～80 ℃之間表現(xiàn)出60%以上的酶活力（圖3 A），即使反應(yīng)溫度為90 ℃時，也可表現(xiàn)出20%的酶活力。如圖3 B 所示，該單寧酶表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，在50 ℃溫度條件下處理60 min 后，酶活力維持在87%以上，而在70 ℃溫度條件下處理60 min 后，仍保持70%以上的酶活力。

圖3 菌株STS-6 單寧酶的酶學(xué)性質(zhì)Fig. 3 Enzymatic properties of tannase in STS-6 strain

2.3.2 pH 對STS-6 單寧酶活力的影響 在60 ℃溫度條件下，測定了該單寧酶在pH 2.0～12.0 的單寧酶活性，結(jié)果如圖3 C 所示。該單寧酶最適pH 為6.0，在pH 5.0～7.0 內(nèi)酶活力可維持在60.0%以上。將該單寧酶酶液置于不同pH 條件下，0 ℃保溫1 h 后，測定該單寧酶殘余酶活力，由圖3 D 可知，該酶在pH 3.0～9.0 之間殘余酶活力均保持在50%以上。

2.3.3 金屬離子及化學(xué)試劑對單寧酶活力的影響在低離子濃度（1 mmol/L）條件下，Na+、Ag+、Ca2+均對單寧酶的酶活性有促進(jìn)作用，其中Na+可使單寧酶活力提高約11%。而其它金屬離子則對單寧酶活力表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中Zn2+、Cu2+和Fe3+抑制作用較強(qiáng)，使單寧酶活力均小于25%。在高離子濃度下（5 mmol/L）的金屬離子均使單寧酶活性受到抑制，其中Zn2+可使單寧酶失活（見表 1）。

11 種化學(xué)試劑對單寧酶活力均有不同程度的抑制作用，EDTA、SDS、吐溫80、尿素、甲醇、丙三醇、異丙醇及丙酮對單寧酶的抑制作用隨著添加量的增大而增強(qiáng)。在5 mmol/L EDTA 條件下，單寧酶活性顯著下降至(25.32±0.26)%。吐溫 80、CTAB 和丙酮均表現(xiàn)出非常強(qiáng)抑制作用，5 mmol/L 的吐溫80幾乎完全抑制了單寧酶活力，甲醇、乙醇、異丙醇及丙酮（極性溶劑）會抑制酶的活性（見表 1）。

表1 金屬離子和化學(xué)試劑對菌株STS-6 單寧酶的影響Table 1 Effects of metal ions and chemical reagents on tannase of strain STS-6

2.4 菌株STS-6 的益生功能特性分析

2.4.1 胃腸液耐受性分析 菌株STS-6 在模擬人工胃腸液條件下的存活率較高（表 2），菌株STS-6 在經(jīng)過0.3% 胃蛋白酶處理3 h 后活菌數(shù)能達(dá)到(7.57±0.43)×108CFU/mL，存活率高達(dá)94.17%。在人工腸液中，菌株STS-6 活菌數(shù)達(dá)到(5.17±0.57)×108CFU/mL，存活率達(dá)到92.36%。菌株STS-6 在人工胃腸液中的耐受性均高于菌株ST-Ⅲ。結(jié)果表明，菌株STS-6 具有較好的胃腸道環(huán)境耐受能力。

表2 菌株STS-6 和ST-Ⅲ在人工模擬腸液和胃液條件下的耐受性Table 2 Tolerance of strains STS-6 and ST-III under artificial simulated gastric fluid and intestinal fluid conditions

2.4.2 自聚和共聚能力分析 菌株STS-6 和ST-Ⅲ在4 h 后的自聚集分別為(65.34±2.80)% 和(51.58±2.17)%。24 h 后，分別為(82.78±3.39)%和(69.74±2.31)%(表 3)。STS-6 在4 和24 h 后 與單核細(xì)胞增生李斯特菌的共聚集性均低于ST-Ⅲ，STS-6 與其它指示菌的共聚性均高于ST-Ⅲ(表 3)，STS-6 和ST-Ⅲ在24 h 后與鼠傷寒沙門氏菌共聚集性最高分別為(75.14±1.05)% 和(67.00±1.61)%。結(jié)果表明，菌株STS-6 表現(xiàn)出較好的自聚和共聚能力。

表3 菌株STS-6 和ST-Ⅲ的自聚、共聚能力Table 3 Autoaggregation and copolymerization ability of strain STS-6 and ST-III

2.4.3 抗氧化活性分析 菌株STS-6 發(fā)酵上清液對DPPH 具有高抗氧化活性（圖4 A），最高可達(dá)到71.15%，清除活性隨著濃度的增加而增加。發(fā)酵上清液具有一定的還原能力(圖4 A)，表現(xiàn)出隨濃度增加而增強(qiáng)的趨勢，當(dāng)菌液上清濃度為1 mg/mL 時，A700nm為0.17，濃度為6 mg/mL 時，A700nm為0.83。

圖4 戊糖片球菌STS-6 的抗氧化能力分析Fig. 4 Analysis of antioxidant capacity of P.pentosaceus STS-6

菌株STS-6 發(fā)酵上清液對質(zhì)粒DNA 損傷表現(xiàn)出較好的保護(hù)作用(圖4 B)。用Fenton 試劑孵育質(zhì)粒DNA，導(dǎo)致DNA 帶完全降解，通過Gel-Pro Analyzer 對條帶進(jìn)行灰度值分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵上清液加入量為20 和30 μL 時，DNA 損傷程度逐漸減小，條帶亮度損傷保護(hù)力分別為20.77%和59.54%。表明發(fā)酵上清液對DNA 損傷有較強(qiáng)的抑制作用。

2.5 戊糖片球菌STS-6 的全基因組概況

P.pentosaceusSTS-6 的基因組由1 個1 744 964 bp 的環(huán)狀染色體和3 個質(zhì)粒構(gòu)成，其質(zhì)粒片段總長度分別為9 808、57 772 和12 238 bp。GC 含量為37.28%，包含1 767 個編碼基因，占整個基因組的87.86%。其中，NR、Swiss-Prot、Pfam、COG 分別注釋了1 761、1 384、1 539、1 486 個基因。

2.6 益生特性相關(guān)基因分析

菌株P(guān).pentosaceusSTS-6 的潛在益生特性在全基因組分析數(shù)據(jù)中得到了有力支撐(表 4)。本研究中從基因組測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了8 個與酸耐受性相關(guān)的基因（F0F1 ATP 合成酶）和1 個膽鹽抗性相關(guān)的膽鹽水解酶(bsh)基因。此外，菌株P(guān).pentosaceusSTS-6 全基因組中還檢測出5 個熱應(yīng)激基因及5 個氧應(yīng)激的相關(guān)基因，這些酶可以有效防止不利環(huán)境對菌株造成的損傷［14］。

表4 戊糖片球菌STS-6 的益生基因分布Table 4 Prebiotic gene distribution of P. pentosaceus STS-6

2.7 單寧酶基因預(yù)測

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，戊糖片球菌STS-6 中g(shù)ene0906 基因與植物乳桿菌JDM1 單寧酶基因（ACT61979.1）氨基酸序列一致性為42.9%。gene0906 基因共編碼259 個氨基酸，無信號肽，含有單寧酶的五肽活性位點(diǎn)基序（Gly103-Ser104-Se105r-Ala106-Gly107）。除此以外，該蛋白包含2 個保守結(jié)構(gòu)域，分別為Aes 結(jié)構(gòu)域（乙酰酯酶/脂肪酶）和Abhydrolase-3 結(jié)構(gòu)域（α/β 水解酶折疊）。De 等［15］人報(bào)道非“CS-D-HC”單寧酶基因包含上述2 個結(jié)構(gòu)域。gene0906 基因與非“CS-D-HC”單寧酶基因特征相似，但存在差異，可能是由于gene0906 基因自身特異性造成，但還需進(jìn)一步對該基因進(jìn)行性質(zhì)表征研究。

3 結(jié)論與討論

本研究成功篩選獲得1 株產(chǎn)單寧酶的戊糖片球菌STS-6。菌株STS-6 所產(chǎn)單寧酶在40～80℃的溫度范圍內(nèi)具有較高的活性，在60℃時具有最大酶活性。大多數(shù)單寧酶的最佳溫度在30～40℃之間［16］，也有嗜熱單寧酶報(bào)道，但它們往往來自真菌，如Shao 等人［17］報(bào)道黑曲霉FJ0118 的單寧酶最適反應(yīng)溫度為80 ℃。到目前為止，菌株STS-6 是為數(shù)不多的細(xì)菌來源的嗜熱單寧酶生產(chǎn)菌。除此以外，該菌單寧酶表現(xiàn)出極好的溫度穩(wěn)定性。較好的熱穩(wěn)定性能有利于的單寧酶的生產(chǎn)、儲存及運(yùn)輸，在實(shí)際應(yīng)用中往往表現(xiàn)出更好的應(yīng)用前景。菌株STS-6雖單寧酶活力較低，但接下來的研究可通過發(fā)酵條件優(yōu)化或構(gòu)建單寧酶高效表達(dá)重組菌株等手段，提高單寧酶活性。通過全基因組進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該菌株中存在1 個疑似單寧酶基因gene0906。之前報(bào)道的單寧酶多為亞型A 和亞型B 單寧酶，這2 種單寧酶基因大約有470～600 個氨基酸，本研究中單寧酶基因僅有259 個氨基酸，但通過預(yù)測gene0906基因可能為新單寧酶基因，此單寧酶的發(fā)現(xiàn)可能進(jìn)一步豐富單寧酶類別。

戊糖片球菌在乳酸菌應(yīng)用中發(fā)揮著越來越重要的作用。近年來從發(fā)酵食品、水產(chǎn)品、動物、植物和糞便中分離出的許多戊糖片球菌可用作動物生長生物促進(jìn)劑，食品的生物防腐劑，或者作為新興的益生菌候選物應(yīng)用于發(fā)酵中［18］。然而，迄今為止，與戊糖片球菌作為益生菌的相關(guān)的問題仍未解決，如缺乏益生特性相關(guān)機(jī)制探究。乳酸菌菌株要獲得潛在的益生菌狀態(tài)，對胃腸道環(huán)境的耐受性至關(guān)重要。有研究表明，在模擬胃腸液中菌體發(fā)揮功能特性的活菌數(shù)臨界值為107CFU/mL［19］。本研究中戊糖片球菌STS-6 菌株胃腸液中活菌數(shù)均高于108CFU/mL，可達(dá)到菌體發(fā)揮功能特性活菌數(shù)臨界值，并且存活率分別高達(dá)94.17%、92.36%，表現(xiàn)出較好的人工胃腸液耐受性。夏勒合特·巴克爾拜等人［20］從傳統(tǒng)泡菜中篩選出的5 株乳酸菌在腸液中3 h 存活率均達(dá)到85%以上。本研究通過全基因組測序檢測到菌株STS-6 含有Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因nhaK和膽酰甘氨酸水解酶基因bsh，這很可能是該菌株具有較強(qiáng)的腸胃耐受性的關(guān)鍵。Qureshi 等［21］人的研究證明Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膽酰甘氨酸水解酶與胃腸道耐受性有關(guān)。

自聚集作用使菌株能夠與腸上皮細(xì)胞有效結(jié)合，從而提高微生物在胃腸道中的滯留能力，共聚集作用可以阻止病原體在胃腸道定植。Zarali 等人［22］從發(fā)酵發(fā)芽三葉草種子分離的戊糖片球菌自聚集能力為35.51%，與大腸桿菌共聚集能力為48.71%。Padmavathi 等人［23］篩選的7 株乳酸菌自聚集能力為51.02%～78.95%。本研究中戊糖片球菌STS-6的自聚集能力在24 h 后可達(dá)到(82.78±3.39)%，同時與指示菌均有較高的共聚集能力，最高可達(dá)到(73.27±0.38)%，結(jié)果表明戊糖片球菌STS-6 可以在宿主腸道內(nèi)很好的定殖，并通過阻止病原微生物的附著形成良好的屏障。

乳酸菌作為功能性發(fā)酵劑和潛在的益生菌，其抗氧化活性是極其重要的。本研究發(fā)現(xiàn)菌株STS-6的發(fā)酵上清表現(xiàn)出較好抗氧化活性。通過全基因組測序進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該菌株存在多個抗氧化基因。例如，該菌株含有硫氧還蛋白arsC 基因，可為硫醇依賴性過氧化物酶提供電子，并參與ROS 和RNS的清除［14］。此外，與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的蛋白酶基因也被檢測到，如atp 依賴性細(xì)胞內(nèi)蛋白酶clpP 和hslV 基因，在防止蛋白質(zhì)異常損傷方面具有重要作用［24］。另外還發(fā)現(xiàn)了過氧化氫酶基因cotJC。

在本研究中成功篩選獲得1 株產(chǎn)單寧酶的戊糖片球菌（P.pentosaceusSTS-6），該菌株單寧酶以胞外分泌為主，最高酶活力為1.6 U/mL。該菌具有較好的胃腸液耐受性，具有較高的自聚集和共聚集能力，發(fā)酵上清液表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。除此以外，該菌株基因組中含有多個益生特性相關(guān)基因和1 個疑似單寧酶基因。綜上所述，P.pentosaceusSTS-6 是1 株優(yōu)良的產(chǎn)單寧酶且具有良好益生特性的菌株，在食品發(fā)酵中具有廣闊的應(yīng)用前景。