高代自交系茄子CR 耐低溫生理特性及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

宋 雪，李 冰，張敬敬，高秀瑞，潘秀清，武彥榮

（河北省農(nóng)林科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，河北 石家莊 050051）

茄子（Solanum melongenaL.）是起源于亞洲熱帶地區(qū)的喜溫茄科植物，在蔬菜消費(fèi)中占重要地位。我國地緣廣闊，南北溫差較大，茄子種植過程中往往面臨低溫災(zāi)害。低溫脅迫條件嚴(yán)重影響茄子植物的生長發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)量嚴(yán)重降低［1］。低溫脅迫對茄子種子萌發(fā)有抑制作用，謝順贊等的研究發(fā)現(xiàn)5 ℃低溫處理茄子發(fā)芽勢和發(fā)芽率顯著下降［2］。低溫使茄子幼苗光合系統(tǒng)反應(yīng)中心受到損傷，光合電子傳遞過程受到抑制，隨著低溫脅迫時間的延長，幼苗葉片的凈光合速率下降，胞間CO2濃度先升高后降低，蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度則先下降后增加［3］。低溫脅迫條件下，茄子葉片中可溶性糖、脯氨酸、丙二醛（MDA）含量，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）的活性以及電解質(zhì)滲透率等都明顯增加，可作為茄子植物的耐寒特性的參考指標(biāo)［4-6］。外源施用多胺、CaC12、褪黑素、植物激素及稀土元素鈰可以提高茄子植物的耐低溫能力［7］。通過嫁接技術(shù)提高茄子抗寒能力在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用［8］，為克服低溫脅迫提供了可靠的技術(shù)保障。除了通過栽培管理措施提高茄子耐低溫能力，篩選耐低溫優(yōu)質(zhì)品種是解決生產(chǎn)問題的一個重要途徑。我國茄子種質(zhì)資源豐富，由于其自身遺傳特性和長期自然選擇，耐低溫能力普遍較差。因此，篩選高抗或高耐低溫的茄子品種，并發(fā)掘抗寒的關(guān)鍵基因，可為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)茄子新品種提供基因資源。

隨著植物抗逆育種研究的深入，耐低溫種質(zhì)篩選和抗低溫相關(guān)基因的鑒定成為研究熱點(diǎn)［9］。提高茄子種植品種的耐低溫特性，需要遺傳物質(zhì)上解析耐低溫脅迫的機(jī)理，發(fā)掘耐低溫關(guān)鍵基因。本研究以耐低溫自交系茄子材料CR 為對象，研究低溫脅迫下的生理特性變化。以不耐低溫茄子品種NCR 為對照，通過轉(zhuǎn)錄學(xué)研究篩選差異表達(dá)基因（DEGs），為進(jìn)一步挖掘茄子耐低溫相關(guān)基因提供線索，以期為茄子耐低溫基因工程提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究使用的茄子植物是河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所瓜類課題組保存的自交系CR 和NCR。CR 是早熟品種，果實(shí)圓形，表皮為黑紫色。NCR 是中晚熟茄子新品種，果實(shí)圓形，果肉緊實(shí)，口感好，抗病性強(qiáng)。

1.2 冷害指數(shù)分析

茄子幼苗在園區(qū)溫室培養(yǎng)長至3～4 片真葉時，挑選長勢和葉數(shù)相對一致的幼苗放置于人工氣候箱內(nèi)，設(shè)置3 個平行組，每組每個品種6 棵，分別放置于3 個條件一致的人工氣候箱內(nèi)，設(shè)置溫度25～28 ℃，相對濕度60%～70%，14 h/10 h 的光照/黑暗周期。在人工氣候箱內(nèi)預(yù)處理1 d 后，將溫度設(shè)為3 ℃進(jìn)行低溫脅迫處理，其他條件不變。處理時間分別為0（預(yù)處理）、1、3、6 d，對處理后的幼苗表型進(jìn)行冷害程度統(tǒng)計(jì)分析。冷害指數(shù)參照王孝宣等［10］的標(biāo)準(zhǔn)對每株幼苗冷害狀況進(jìn)行分級，0 級：植株生長正常，無冷害癥狀；1 級：僅有少數(shù)葉片的邊緣發(fā)生輕度皺縮萎焉；2 級：半數(shù)以下的葉片萎焉死亡；3 級：半數(shù)以上的葉片發(fā)生萎蔫死亡；4 級：植株全部死亡。冷害指數(shù)（CI）=（1×S1+2×S2+3×S3+4×S4）/（低溫脅迫總株數(shù)×4），S為相應(yīng)冷害級的苗數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)了3 次。

1.3 電解質(zhì)滲透率測定

茄子植物在人工氣候箱內(nèi)3 ℃條件下處理1、3、6 d 后，隨機(jī)采集3 片成熟葉，用去離子水沖洗干凈，從葉片表面去除無機(jī)鹽離子和各種雜質(zhì)。室溫風(fēng)干后剪碎混勻，稱取0.3 g 置于20 mL 試管，加入去離子水15 mL 輕輕振蕩充分混勻，靜置24 h 后，對葉片的電解質(zhì)滲透率進(jìn)行測定，所得值為電解質(zhì)滲透率E1。所用水的電解質(zhì)滲透率定義為E0。最后將樣品在100 ℃沸水浴中煮浴10 min，待溫度降至室溫25 ℃后測得電解質(zhì)滲透率E2［11-13］。

電解質(zhì)滲透率=（E1-E0）/（E2-E0）× 100%，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 丙二醛含量測定

茄子葉片丙二醛含量用丙二醛（微量法）試劑盒法測定（蘇州科銘）。茄子植物在人工氣候箱內(nèi)3 ℃條件下處理1、3、6 d 后，每個時間點(diǎn)隨機(jī)采集3 片成熟葉，剪碎混勻后取0.1 g 葉片，迅速加入1 mL 提取液冰浴勻漿。10 000 g 4 ℃離心10 min 后置于冰上待測。吸取 0.3 mL 試劑放置于1.5 mL 離心管，再加入0.1 mL 提取物樣本，充分混勻。于95 ℃水浴30 min 后冰浴冷卻，10 000 g25 ℃離心10 min，取200 μL 上清液于微量石英比色皿中測定532 和600 nm 處的吸光度，記為A532和A600，根據(jù)532 與600 nm 吸光度的差值計(jì)算MDA 含量。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 轉(zhuǎn)錄組分析

1.5.1 測序葉片樣品的準(zhǔn)備 在常溫預(yù)處理對照條件和低溫處理1 d 后分別收取CR 和NCR 植株葉片，迅速用錫箔紙包裹并放入液氮進(jìn)行快速冷凍，冷凍后的葉片樣品于-80 ℃冰箱保存。試驗(yàn)共設(shè)4 個處理：常溫CR（CR_CK），低溫處理1 d 的CR，常溫NCR（NCR_CK），低溫處理1 d 的NCR。每個處理重復(fù)取樣3 次進(jìn)行樣轉(zhuǎn)錄組測序。

1.5.2 RNA 提取和cDNA 文庫的構(gòu)建 轉(zhuǎn)錄組分析委托北京諾禾生物科技有限公司完成。用Trizol提取總RNA，在Agilent 2100 bioanalyzer 中對RNA的完整性和總量進(jìn)行檢測。用Oligo（dT）磁珠富集帶有polyA 尾的mRNA，在Fragmentation Buffer中用二價陽離子將得到的mRNA 隨機(jī)打斷。將片段化的mRNA 作為模版，用隨機(jī)寡核苷酸引物在M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA 第1 條鏈。隨后用RNaseH 降解RNA 鏈，并在DNA 聚合酶I 體系下，以dNTPs 為原料合成cDNA 第2 條鏈。純化后的雙鏈cDNA 經(jīng)過末端修復(fù)、加A 尾并連接測序接頭，用AMPure XP beads 篩選20～370 bp 左右的cDNA。經(jīng)PCR 擴(kuò)增純化后獲得文庫。

1.5.3 數(shù)據(jù)分析 利用Illumina HiSeqTM 測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。剔除原始數(shù)據(jù)中含有接頭、不確定堿基或低質(zhì)量測序片段。基因表達(dá)水平用FPKM（指每百萬堿基對測序的轉(zhuǎn)錄本序列片段的每千堿基片段的預(yù)期數(shù)量）值來表示。用DESeq2軟件（1.20.0）進(jìn)行2 個比較組合之間的差異表達(dá)分析。用Benjamini 和Hochberg 的方法來調(diào)整所得P值以控制錯誤發(fā)現(xiàn)率。參考茄子基因組信息數(shù)據(jù)對測序所得基因信息進(jìn)行注釋（http：//eggplant-hq.cn/Eggplant/）。通過clusterProfiler 3.8.1 軟件對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析，并對差異表達(dá)基因涉及的KEGG 通路進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高代自交系CR 的冷害指數(shù)分析

高代自交系CR 在處理后1 和3 d，都沒有出現(xiàn)萎焉，處理后6 d，少數(shù)植株的葉片出現(xiàn)萎焉，冷害指數(shù)為0.04。高代自交系NCR 處理后1 d，就出現(xiàn)明顯的萎焉，3 和6 d 后萎焉程度逐漸增加，在觀察的3 個時間點(diǎn)，冷害指數(shù)分別是0.22、0.36 和0.47（圖1-A）。高代自交系CR 在低溫處理6 d 后雖然也出現(xiàn)萎焉，但冷害指數(shù)僅為自交系NCR 的1/10。低溫處理后CR 的冷害指數(shù)顯著低于NCR（P＜0.01），比NCR 表現(xiàn)出更高的耐低溫能力。

圖1 低溫脅迫對茄子自交系CR 冷害指數(shù)、電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量的影響Fig. 1 Effects of low temperature stress on chilling injury index，electrolyte permeability and MDA content in eggplants

2.2 低溫脅迫對高代自交系CR 電解質(zhì)滲透的影響

高代自交系CR 低溫處理后1、3 和6 d 的電解質(zhì)滲透率分別為21.05%、22.66%、23.59%，隨著低溫處理時間的增加，電解質(zhì)滲透率雖然也呈逐步增加大的趨勢，但不同時間點(diǎn)之間的數(shù)值差異很小。低溫處理6 d 的電解質(zhì)滲透率與1 d 相比增加了12.07%。高代自交系NCR 電解質(zhì)滲透率1、3 和6 d 分別為25.33%、29.36%和43.75%,從1～6 d 的增幅為72.72%，高于CR 品種12.07%。低溫造成CR 葉片的電解質(zhì)滲透率顯著低于NCR（P＜0.01）（圖1-B）。

2.3 低溫脅迫高代自交系CR 中丙二醛含量分析

2 個自交系品種未經(jīng)低溫脅迫處理，葉片中檢測出來的丙二醛含量沒有區(qū)別（圖1-C）。低溫處理后1、3 和6 d，2 個自交系品種的丙二醛含量都隨著處理時間增加而增加。自交系CR 中丙二醛含量增加的量顯著低于NCR 品種（P＜0.05）。自交系CR 的丙二醛含量在低溫處理后第6 天比第1 天增加11.77%。相比之下，自交系NCR 在低溫處理后第6 天比第1 天增加了20.33%（圖1-C）。由此可以看出，CR 的耐低溫生理特性比NCR 優(yōu)異，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒能力。

2.4 轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量控制

轉(zhuǎn)錄組測序研究4 種處理12 個樣品中總共得到556 367 312 條原始序列（Raw reads），去除含有接頭的、低質(zhì)量的Raw reads，得到濾后序列（Clean reads）541 986 614 條，用于后續(xù)分析。Q20 和Q30分別表示堿基識別出錯的概率為1%和0.1%。在得到的濾后序列中，Q20 值均大于97%，而Q30 值均達(dá)到91%以上。此外，GC 百分率都大于42%（表1）。由表2 結(jié)果可知，從Clean reads 中得到的序列與茄子參考基因組比較分析，完全比對到參考基因組的reads 占總reads 數(shù)量的94%以上，唯一比對位置序列的比對率在89%以上，多個比對位置序列比對率在4.91%以下，外顯子比對率81%以上。轉(zhuǎn)錄組測序的質(zhì)量可靠，能夠保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表1 12 個樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測序質(zhì)量Table 1 The quality of 12 samples for transcriptome sequencing

表2 與參考基因組比對結(jié)果Table 2 Summary of sequence comparison with reference genome

2.5 基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析

為明確低溫處理?xiàng)l件下2 個自交系茄子的差異表達(dá)基因的情況，利用FPKM 法計(jì)算編碼基因 的表達(dá) 量（篩選條件為padj＜0.05 且|log2FoldChange|＞1）。選擇表達(dá)量差異大于2 倍（P≤0.05）的差異表達(dá)基因，繪制差異基因表達(dá)火山圖（圖2）。自交系CR 低溫與常溫對照（CR_CK）相比，總共有6 113 個基因的表達(dá)水平發(fā)生變化，其中3 378 個上調(diào)，2 735 個下調(diào)。而NCR 低溫與常溫對照（NCR_CK）相比，有7 670 個基因的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，其中4 030 個基因表達(dá)水平上調(diào)，3 640 個基因表達(dá)水平下調(diào)。2 個不同品種間低溫處理后產(chǎn)生了754 個差異基因，其中429 個上調(diào)，325 個下調(diào)。結(jié)果表明，2 個茄子品種經(jīng)過低溫處理后，存在一定的基因表達(dá)差異，從而為篩選相關(guān)基因進(jìn)行耐低溫的鑒定提供了基礎(chǔ)。

圖2 2 個茄子品種處于低溫與對照間差異基因表達(dá)Volcano-plot 分布圖Fig. 2 Volcano-plot of DEGs between two eggplant varieties in response to low temperature

2.6 自交系CR 低溫脅迫條件下特有的表達(dá)基因

通過常溫和低溫脅迫下的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，從2 個自交系CR 和NCR 中分別得到了各自應(yīng)對低溫脅迫的差異表達(dá)基因（圖3）。將這些差異表達(dá)基因進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)2 個自交系在常溫下NCR_CK 和CR_CK 相比差異表達(dá)基因數(shù)為726 個，說明常溫條件下2個品種在基因表達(dá)譜上存在差異。受低溫脅迫條件下，自交系CR 與NCR 相比差異表達(dá)基因是754 個。除去2 個品種在常溫對照下本身就存在差異表達(dá)基因181 個基因外，由低溫處理造成2 個品種間的差異表達(dá)基因?yàn)?73 個。為了篩選CR 特有的表達(dá)基因，將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，得到了80 個僅在低溫處理CR 品種中特異性表達(dá)的基因。

圖3 差異表達(dá)基因韋恩圖Fig. 3 Venn diagram of differentially expressed genes

2.7 自交系CR 低溫特有表達(dá)基因的GO 和KEGG富集分析

對上述分析得到的80 個差異基因進(jìn)行GO 富集分析（圖4），這些基因涉及生物學(xué)過程（Biological process，BP）、細(xì)胞組 分（Cellular component，CC）及分子功能（Molecular function，MF）3 個GO 大類。生物學(xué)過程大類中差異表達(dá)基因涉及無機(jī)物響應(yīng)（GO：0010035）、非生物刺激響應(yīng)（GO：0009628）、金屬離子輸運(yùn)（GO：0030001）、核小體裝配（GO：0006334）、染色質(zhì)組裝（GO：0031497）、核小體組織（GO：0034728）、DNA 包裝（GO：0006323）、染色質(zhì)的組成或分解（GO：0006333）、蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物組裝（GO：0065004）、蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合亞基組織（GO：0071824）。細(xì)胞組分GO 類中含有核小體（GO：0000786）、核染色質(zhì)（GO：0000785）、蛋白質(zhì)復(fù)合體（GO：0032993）。

圖4 80 個差異基因的前30 條目GO 的功能分類Fig. 4 Enriched GO analysis for 80 DEGs

DNA 包裝復(fù)合物（GO：0044815）、染色體單位（GO：0044427）、染色體（GO：0005694）、無膜細(xì)胞器（GO：0043228）、細(xì)胞內(nèi)無膜細(xì)胞器（GO：0043232）、核糖體（GO：0005840）、細(xì)胞器單位（GO：0044422）。金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（GO：0046873）、吡哆醛磷鹽結(jié)合（GO：0030170）、維生素B6 結(jié)合（GO：0070279）、維生素結(jié)合（GO：0019842）、蛋白質(zhì)異源二聚活性（GO：0046982）、核糖核酸酶Ⅲ活性（GO：0004525）、雙鏈RNA 特異性核糖核酸酶活性（GO：0032296）、無機(jī)陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（GO：0022890）、陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（GO：0008324）和染色質(zhì)結(jié)合（GO：0003682）分子功能通路。

自交系CR 低溫脅迫下特異性表達(dá)的80 個基因經(jīng)KEGG 分析，富集到8 個代謝通路（圖5）。差異基因主要集中在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（sly04075），植物與病原物互作（sly04626），半胱氨酸和蛋氨酸代謝（sly00270），苯丙氨酸代謝（sly00360），MAPK 植物信號通路（sly04016），糖胺聚糖降解（sly00531），類固醇生物合成（sly00100），二萜生物合成（sly00904）等8 個代謝通路。其中二萜生物合成、類固醇生物合成通路顯著性富集（P＜0.05）。說明二萜生物合（gene ID：Smechr1200036/Smechr0702775）和類固醇生物合成（gene ID：Smechr0600296/Smechr0602729）代謝物在茄子耐冷性差異方面存在重要作用。

圖5 80 個差異基因的KEGG 分析Fig. 5 The KEGG analysis for 80 DEGs

3 討論與結(jié)論

低溫處理后電解質(zhì)滲透率大小是衡量植物抗寒性強(qiáng)弱的指標(biāo)之一，電解質(zhì)滲透率增加幅度越大，細(xì)胞膜受傷害的程度越高，植物的抗寒性越弱［14-15］。對自交系CR 電解質(zhì)滲透率檢測后發(fā)現(xiàn)低溫處理第6天比第1 天增加12.07%，而NCR 增加了72.72%，這與CR 材料中冷害指數(shù)和丙二醛含量變化一致，均說明CR 是耐寒生理指標(biāo)優(yōu)異的一個自交系。

低溫是典型的環(huán)境脅迫因素之一，影響植物的生長發(fā)育［1,9］。植物對低溫脅迫的響應(yīng)并非是完全被動的反應(yīng)，而是一種積極主動的應(yīng)激過程。低溫誘導(dǎo)了相關(guān)基因的表達(dá)，通過積累小分子抗性物質(zhì)及抗氧化系統(tǒng)的活化來緩解低溫脅迫造成的機(jī)械傷害和生理傷害，從而提高植物的抗性［16］。通過對自交系品種CR 和NCR 低溫處理后的轉(zhuǎn)錄組測序分析，篩選出80 個CR 特有的差異基因，上調(diào)表達(dá)的基因中主要參與染色體或染色質(zhì)復(fù)制和重塑、脫水反應(yīng)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白泛素降解等相關(guān)途徑。下調(diào)表達(dá)的基因主要參與細(xì)胞色素P450、麥角甾醇生物合成等相關(guān)路徑。

脫水蛋白與植物抗逆性密切相關(guān)，耐旱耐凍性強(qiáng)的品系在脅迫條件下積累的脫水蛋白水平高于耐受性弱的品系［17］。冬季和春季小麥和燕麥抗凍性與脫水蛋白基因表達(dá)的時序性和水平相關(guān)，耐旱耐凍性強(qiáng)的品系在脅迫條件下積累的脫水蛋白水平高于耐受性弱的品系［18］。本研究篩選到的差異表達(dá)基因中與脫水相關(guān)的2 個基因Smechr0800088 和Smechr0200704 都在CR 品種中增強(qiáng)表達(dá)，這與其他植物中的研究結(jié)果一致：脫水蛋白的高水平表達(dá)與耐冷能力相關(guān)。

At1g61340（Smechr0201805）基因?yàn)镕-box 基因家族成員，是植物中最大的蛋白質(zhì)家族之一。F-box 蛋白作為SCF 復(fù)合體中泛素連接酶E3 的關(guān)鍵組分而在植物生長發(fā)育、激素信號傳導(dǎo)、花器官發(fā)育和自交不親和反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［19］。F-box 蛋白介導(dǎo)的泛素降解途徑還參與了植物應(yīng)對非生物及生物脅迫的響應(yīng)過程［20］。低溫誘導(dǎo)下，具有F-box 結(jié)構(gòu)的水稻CDM7（cold-inducing differential methylation）特異性表達(dá)［21］。水 稻miR393 靶定編碼E3 的F-box 蛋白中TIR1，低溫脅迫下miR393 表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致TIR1 mRNA 的降解，并抑制其翻譯過程，降低生長素效應(yīng)并抑制植物生長，提高植物的低溫適應(yīng)性［22］。

編碼細(xì)胞色素P450 的Smechr1200036 和麥角甾醇的編碼基因Smechr0602729 在CR 品種中表達(dá)量下調(diào)。植物細(xì)胞色素P450 響應(yīng)生物或非生物脅迫因子，參與生物體內(nèi)許多物質(zhì)的生物合成與分解代謝［23-25］。麥角甾醇主要存在于酵母菌、霉菌和某些植物中，不僅參與細(xì)胞膜的功能維持，而且是細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)過程的重要調(diào)控因子。酵母細(xì)胞膜上麥角甾醇含量的高低與細(xì)胞對外界不良環(huán)境的抵抗力有重要關(guān)系［26］。這2 個基因與茄子耐低溫能力的相關(guān)性有待進(jìn)一步探索。