深州蜜桃果實腐爛病病原菌鑒定及拮抗菌株的篩選

劉君盈，孫新康，崔鐘池，王海燕

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000）

桃（Prunus persica（L.）Batsch），薔薇科、李屬植物。桃在中國已有4 000 年以上的栽培歷史［1］，據(jù)統(tǒng)計2021 年中國桃種植面積和產(chǎn)量分別為89.0 萬hm2和1 599.3 萬t，均居世界第一位［2］。中國傳統(tǒng)“四大蜜桃產(chǎn)區(qū)”，分別是河北深州、浙江奉化、江蘇陽山和山東肥城，其中，河北深州蜜桃已有2 000 多年的栽培歷史［3］。近年來，隨著深州市蜜桃栽培面積不斷擴大，桃果實在生長發(fā)育過程中，易受到各種病蟲為害。8—9 月份正值蜜桃成熟期，采收季節(jié)常遇高溫濕熱天氣，儲運過程中易受到各種損傷，更容易受到多種病原菌的侵染引起果實腐爛。

目前，我國已報道引起桃腐爛的病害有10 種，如桃褐腐病、炭疽病、灰霉病和軟腐病等，自幼果期至成熟期均可受到危害，造成蜜桃果實變軟和腐爛，嚴重影響蜜桃產(chǎn)量和質(zhì)量［1,4］。據(jù)國內(nèi)外報道，目前造成桃褐腐病（Peach brown rot）的病原菌分別為美澳型核果鏈核盤菌（Monilinia fructicola）、果產(chǎn)鏈核盤菌（M.fructigena）、梅生鏈核盤菌（M.mumecol）、多子座鏈核盤菌（M.polystroma）和松散鏈核盤菌（M.laxa）與云南鏈核盤菌（M.yunnanensis）［5］；桃炭疽?。≒each anthracnose）病原菌分別由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioide）和尖孢炭疽菌（C.acutatum）侵染造成，且2 種病原為復(fù)合小種［6］。目前膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）被細分為果生炭疽菌（C.fructicola）和暹羅炭疽菌（C.siamense）［7］。近年來，存在2 種病害同時發(fā)生的現(xiàn)象，其初期癥狀難以分辨，后期造成桃果實嚴重腐爛，使蜜桃喪失商品價值［8］，嚴重影響了深州蜜桃的產(chǎn)量和質(zhì)量，減少了果農(nóng)的經(jīng)濟收益。

化學(xué)防治是防治桃褐腐病和炭疽病的主要方法，化學(xué)藥劑雖能有效、快速地達到防治目的，但長期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會污染環(huán)境，造成農(nóng)藥殘留，而且對一些非靶標的植物、微生物，甚至人類的安全造成了潛在的威脅［9-10］。生物防治可以減少對環(huán)境的干擾，具有綠色安全等特點，目前已成為研究的熱點［11］。本研究擬通過利用傳統(tǒng)病原鑒定結(jié)合多基因分子鑒定對患病蜜桃病原菌進行鑒定，并以鑒定出的病原菌為靶標，進行拮抗細菌的篩選，以期為深州蜜桃腐爛病的生物防治提供依據(jù)，為蜜桃腐爛病的綜合防治提供思路。

1 材料與方法

1.1 病果采集與病原菌分離培養(yǎng)

2021 年9 月調(diào)查河北省深州市深州鎮(zhèn)10 處蜜桃果園。在果實近成熟期對腐爛果實進地觀察，每個桃園采集發(fā)病的蜜桃樣本10 份。采用組織分離法對發(fā)病果實進行病原菌分離純化，選取具有典型發(fā)病癥狀的蜜桃，用滅菌刀片在果實病健交界處切取0.5 cm×0.5 cm 若干小方塊，將其放入70%的酒精浸泡15 s，10%次氯酸鈉溶液進行表面消毒30 s，最后用無菌水清洗3～4 次，用滅菌濾紙吸去多余水分后，置于PDA 平板上，26 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)5 d，待菌絲長出后，用無菌接種環(huán)接種到新培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。待菌落長出后分別置于4 ℃和-80 ℃保存。

1.2 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

將分離獲得的純培養(yǎng)物置于PDA 培養(yǎng)基，26 ℃暗培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長變化、形態(tài)和顏色，待產(chǎn)孢后在顯微鏡下觀察分生孢子的類型、形狀、顏色，并測量孢子大小。

1.3 致病性測定

按照柯赫氏法則將分離得到的病原菌進行離體回接。選取健康、外觀整齊、成熟度以及大小相似的蜜桃果實，75%酒精浸泡消毒后，無菌水沖洗3 次。在果實表面用無菌接種針輕微刺傷，同時用打孔器從新鮮菌落的邊緣打取菌餅，倒置菌餅貼于果面刺傷處，并置于塑料箱中，以不接菌處理為對照。將塑料箱置于26 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，定期觀察果實發(fā)病情況，待果實發(fā)病具有明顯特征時，對病組織重新分離和鑒定，與接種前病原菌形態(tài)相同即可確定為致病菌。

1.4 病原菌的分子鑒定

采用CTAB 法分別提取2 種病原菌的DNA。以提取的DNA 作為PCR 擴增模板，利用引物ITS、GAPDH、TUB2 對菌株H-1、H-2、H-3 進行檢測，利用引 物ITS、ACT、CAL、CHS-1、GAPDH、TUB2 對菌株T-1、T-2、T-3 進行 檢測［12-13］。PCR反應(yīng)總 體系為25 μL，含 有Master Mix12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、上下游引物和模板DNA 各1 μL，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR 產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。利用MAFFT version7 進行序列比對，利用Bio Edit 軟件進行序列串聯(lián)，利用MAGE11 軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 拮抗細菌的篩選

以蜜桃腐爛病原菌H-1、H-2、H-3 和T-1、T-2、T-3 為靶標菌，采用平板對峙法篩選有效的拮抗細菌。在PDA 培養(yǎng)基平板背面中心點處接種生長5 d 的致病菌菌餅（直徑5 mm），距中心點左右兩側(cè)2.5 cm處接5 mm 拮抗細菌菌餅，每個處理3 次重復(fù)，對照組不接細菌，只接真菌菌餅。置于26 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察是否出現(xiàn)污染狀況，根據(jù)抑菌帶寬度計算抑制率，抑菌率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 深州蜜桃果實腐爛病發(fā)生情況

通過對深州蜜桃果實腐爛病田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，桃果實主要病害有桃褐腐病、炭疽病、軟腐病等。溫暖高濕、枝葉蔭蔽的環(huán)境有利于病原菌的發(fā)生和傳播，嚴重時整棵桃樹大部分果實都會出現(xiàn)腐爛的現(xiàn)象。桃腐爛病發(fā)生分為幾種類型：蜜桃果實摘袋后，有些果實病斑逐漸結(jié)合，導(dǎo)致整個果實腐爛，病部果肉變?yōu)楹稚“弑砻娈a(chǎn)生灰褐色絨球狀霉簇（圖1-A）；有些果實底部或腰部出現(xiàn)褐色圓形或橢圓形病斑，病斑處果肉變軟（圖1-B）；有些果實病斑表面凹陷，產(chǎn)生橘紅色小粒點（圖1-C）。這些導(dǎo)致蜜桃腐爛的癥狀肉眼難以區(qū)分，且發(fā)病率在50%～75%，直接影響蜜桃品質(zhì)和產(chǎn)量。

圖1 桃果實田間腐爛的癥狀Fig. 1 The symptoms of peach fruit rot in the field

2.2 深州市蜜桃果實腐爛病病原菌的分離與形態(tài)學(xué)鑒定

采用組織分離法對癥狀相似的病果進行病原菌分離，分離純化獲得6 株病原菌，根據(jù)病原菌在PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，挑選6 株代表性菌株進行后續(xù)試驗，編號分別為H-1、H-2、H-3 和T-1、T-2、T-3（圖2-A,B）。將菌株H-1、H-2、H-3 分別接種于PDA 培養(yǎng)基上，菌株H-1、H-2、H-3 在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)完全一致，初期菌絲生長速度較慢，大部分菌落邊緣完整，部分菌落邊緣有缺陷，呈花瓣狀，菌落顏色為偏灰黃色或灰褐色，中間顏色深邊緣顏色淺（圖2-A 正面、A1 背面），呈輪紋狀排列。在顯微鏡下觀察，H-1 分生孢子透明，呈橢圓形或檸檬形，鏈狀，有分枝（圖2-A2），孢子平均大小為15.3 μm×10.5 μm，根據(jù)菌落形態(tài)和孢子形態(tài)初步鑒定病原菌為子囊菌鏈核盤菌（Moniliniaspp.）的病菌。

圖2 代表性菌株H-1 和T-1 形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of the representative isolate H-1 and T-1

將T-1、T-2、T-3 菌株分別接種于PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌株T-1、T-2、T-3 在PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)完全一致，菌絲生長致密呈白色，菌絲生長速度較快，菌落平整，邊緣整齊（圖2-B），后期菌落背面呈黑褐色（圖2-B1）。通過在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)T-1、T-2、T-3 分生孢子為單細胞，透明，圓柱形至紡錘形（圖2-B2），孢子平均大小為（9.7～12.1）μm×（3.1～4.5）μm，根據(jù)菌 落形態(tài)和孢子形態(tài)初步鑒定病原菌為膠孢炭疽復(fù)合種（Colletotrichumloeosporioidesspecies complex）。

2.3 深州蜜桃果實腐爛病病原菌的致病性驗證

根據(jù)柯赫氏法則進行回接試驗，將菌株H-1、H-2、H-3 接種于蜜桃果實7 d 后，蜜桃果實出現(xiàn)了淡褐色近圓形病斑（圖3-A），病斑部位出現(xiàn)灰色或淡黃色絨球狀霉簇，病部果肉褐變；將菌株T-1、T-2、T-3 接種于蜜桃果實，7 d 后蜜桃果實出現(xiàn)了淡褐色近圓形水漬狀病斑（圖3-B），而對照組果實均無發(fā)病癥狀（圖3-A1,B1）。分別對人工接種發(fā)病的果實再次進行病菌分離，成功分離獲得與原病原菌一致的菌株，證明分離到的病原菌為致病菌。

圖3 致病性檢測Fig. 3 Pathogenicity assay

2.4 深州蜜桃果實腐爛病病原菌的分子生物學(xué)鑒定

將病原菌H-1、H-2、H-3 基因組中的ITS、GAPDH、TUB2 序列在與GenBank 中進行BLAST比 對，發(fā) 現(xiàn)H-1、H-2、H-3 基因組中的ITS、GAPDH、TUB2 序列與M.fructicolastrain 等菌株相似性為100%。進一步利用MAGE 11 軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類結(jié)果顯示，菌株H-1、H-2、H-3 與模式菌株M.fructicolastrain M15.4A_Nc_Ch 和M.fructicolastrain shhf15 聚集于同一分支上，自展值為100%（圖4-A）。菌株序列上傳NCBI，基因編號分別為ITS: ON26211、GAPDH:ON303282、TUB2: ON303279。結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)鑒定，證明患病蜜桃果實中分離到的真菌為美澳型核果鏈核盤菌（M.fructicola）。

圖4 M. fructicola A 和C. siamense B 序列比對構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of M. fructicola A and C. siamense B trains constructed with the sequence alignment results

將病原 菌T-1、T-2、T-3 基因組中的ITS、ACT、CAL、CHS-1、GAPDH、TUB2 序列在 與GenBank 中進行BLAST 比對，發(fā)現(xiàn)T-1、T-2、T-3基因組中的ITS、ACT、CAL、CHS-1、GAPDH、TUB2 序列與C.siamensestrain 等菌株相似性為100%，進一步利用MAGE 11 軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類結(jié)果顯示，菌株T-1、T-2、T-3 與模式菌株C.siamenseSDQD5 聚集于同一分支上，自展值為98.4%（圖4-B）。菌株序列上傳至NCBI，基因編號分別為ITS：ON063324、ACT：ON099443、CAL：ON099446、CHS-1：ON099449、GAPDH：ON099452、TUB2：ON099455。結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)鑒定，證明患病蜜桃果實中分離到的真菌為暹羅炭疽菌（C.siamense）。

2.5 深州蜜桃果實腐爛病病菌室內(nèi)拮抗細菌的篩選

為篩選出對桃褐腐病和桃炭疽病病原菌具有抑制效果的拮抗細菌，對實驗室保存的102 株拮抗細菌（編號為JK-1 至JK-102）進行抑菌篩選試驗，結(jié)果獲得6 株拮抗細菌對M.fructicola抑菌率達到50% 以上；9 株拮抗細菌對C.siamense抑菌率達到50%以上。平板對峙試驗結(jié)果表明，拮抗菌株JK-21 和JK-47 對桃褐腐病原菌和桃炭疽病病原菌均具有明顯的抑制效果（圖5）。

圖5 拮抗細菌JK-21 和JK-47 在PDA 平板上對M. fructicola 和C. siamense 的抑制效果Fig. 5 Antagonistic effect of bacteria JK-21 and JK-47 against M. fructicola and C. siamense on PDA plate

JK-21 對桃褐腐病和桃炭疽病病原菌抑菌平均直徑分別為1.833 和1.967 cm；JK-47 對桃褐腐病和桃炭疽病病原菌抑菌平均直徑分別為1.633 和2.667 cm，拮抗菌株JK-21 對桃褐腐和桃炭疽病病原菌抑菌率最高，分別為75.1%和70%；拮抗菌株JK-47對桃褐腐和桃炭疽病病原菌抑菌率次之，分別為77.8%和59.7%。因此，后續(xù)可選用這2 株拮抗細菌為桃褐腐和桃炭疽病病原菌的生防菌，進一步展開相關(guān)研究。

3 結(jié)論與討論

本研究通過對深州桃園進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)深州蜜桃腐爛發(fā)生情況，對河北省深州蜜桃腐爛病樣品進行組織分離、純化、柯赫氏法則實驗驗證病原菌菌株種類。根據(jù)培養(yǎng)病原菌菌株、孢子形態(tài)觀察、多基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析和致病性檢測，結(jié)合已報道的關(guān)于褐腐病菌和炭疽病菌的描述［14-15］，鑒定引起蜜桃腐爛病的兩種病原菌分別為美澳型核果鏈核盤菌（M.fructicola）和暹羅炭疽菌（C.siamense）。本研究為探究河北深州蜜桃腐爛病的田間防控提供了依據(jù)。

褐腐病菌和炭疽病菌寄主范圍廣泛，具有豐富的遺傳多樣性，其形態(tài)特征、致病力和近似種等之間差異微小，有時會存在多種病菌同時侵染同一種寄主上的現(xiàn)象，對病害診斷造成影響［16-19］。病原菌的鑒定通常采用形態(tài)觀察、分子生物學(xué)鑒定和多基因序列分析，多基因序列分析可以鑒定不同屬之間的親緣關(guān)系，也有人利用多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析的綜合方法，用于鑒定病原菌種類［17］；李河等［18］利用ITS、CAL 和GAPDH 基因進行綜合分析，根據(jù)形態(tài)特征及多基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析，對采集自我國6 個省市油茶產(chǎn)區(qū)的炭疽病樣進行了鑒定，其中23 株病原菌被鑒定為果生刺盤孢菌C.fructicola。張麗瓊［19］通過構(gòu)建G3PDH 和TUB2系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，明確了引起上海地區(qū)桃褐腐病病原菌主要為M.fructicola。參考以上研究方法，本研究依據(jù)ITS、GAPDH、TUB2 多基因序列分析構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹和形態(tài)學(xué)分析，明確了深州地區(qū)引起蜜桃褐腐病病原菌為美澳型鏈核盤菌（M.fructicola），基于ITS、GAPDH、TUB2、ACT、CAL、CHS-1 等多基 因序列分析構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹和形態(tài)學(xué)分析，明確了深州地區(qū)引起桃炭疽病病原菌為暹羅炭疽菌（C.siamense）。

在桃果實生長期間，噴施殺菌劑仍是桃果實病害防治的主要手段，常用藥劑有多菌靈、百菌清、吡唑醚菌酯等，為了增加桃產(chǎn)量及減少各種病害，長期使用化學(xué)藥劑會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，增加藥劑殘留量以及污染環(huán)境等問題。近年來，生物防治因其安全、高效、無殘留等特點在病害防控領(lǐng)域逐漸成為研究的熱點，目前已有報道從高產(chǎn)桃園土壤中分離、篩選具有防治作用的細菌菌株，對不同病原菌引起的桃褐腐病均具有良好的抑制效果,袁雪等［21］篩選到特基拉芽孢桿菌Bacillus tequilensis對桃褐腐病病原菌的抑菌率為74.48%，拮抗細菌可能降解致病因子，導(dǎo)致致病因子不能正常的發(fā)揮作用，減少了病原菌對桃的侵染。潘朝勃等［22］篩選到對杧果炭疽有防治效果的枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis，抑菌率在88.83%。本研究通過篩選獲得拮抗細菌JK-21 對美澳型核果褐腐病菌（M.fructicola）和暹羅 炭疽菌（C.siamense）的抑菌率分別為75.1% 和70%；JK-47 對美澳型核果褐腐病菌（M.fructicola）和暹羅炭疽菌（C.siamense）的抑菌率分別為77.8%和59.7%，對預(yù)防深州蜜桃果實病害發(fā)生具有重要的應(yīng)用價值，后續(xù)關(guān)于2 種生防菌的作用生防機制及田間的應(yīng)用防效有待進一步研究。