3 種石榴果皮褐變與酚類代謝及能量代謝的關(guān)系

劉倩婷，杜佳銘，郭曉宏，候德華，王彩蓮，郭曉成，寇莉萍,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西 西安 710061）

石榴（Punica granatumL.）是石榴科石榴屬重要的經(jīng)濟(jì)水果作物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，經(jīng)過不斷的推廣與培養(yǎng)，現(xiàn)今世界石榴種質(zhì)資源已達(dá)上千種[1]。中國是世界上石榴種質(zhì)資源最多、產(chǎn)量最高的地區(qū)之一，石榴主產(chǎn)區(qū)分布在陜西臨潼、云南蒙自、安徽懷遠(yuǎn)、河南滎陽、四川會(huì)理、山東棗莊、新疆葉城和河北石家莊8 處，種植面積與產(chǎn)量覆蓋全國80%以上[2]。陜西作為主產(chǎn)區(qū)之一，擁有傳統(tǒng)石榴品種30余種，其中‘凈皮甜’石榴是最為傳統(tǒng)的種質(zhì)資源，具有果大皮薄、酸甜可口等優(yōu)點(diǎn)[3]?！荒崴管涀选褡?986年引入我國，在陜西潼關(guān)已形成一定的種植規(guī)模，此類果具有皮薄籽軟、汁多果甜等優(yōu)點(diǎn)[4]?！P山紅’石榴經(jīng)凈皮甜石榴雜交選育而來，其果面呈粉紅色、果實(shí)大、果萼脆、籽粒酸甜適度、汁水充盈。

低溫貯存（（4.0±0.5）℃）是應(yīng)用最廣泛且有效的石榴果實(shí)貯藏手段之一，通過抑制呼吸速率、降低新陳代謝速率、減緩貯藏過程中營養(yǎng)物質(zhì)流失來延長石榴的貯藏時(shí)間[5]。石榴的低溫貯藏通常伴隨著低溫?fù)p傷，其具體表現(xiàn)為果皮凹陷、顏色異常、果皮或果肉褐變、果肉木質(zhì)化等形式[6]。石榴果皮的褐變直觀影響果實(shí)的感官品質(zhì)，且影響果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)。

果皮褐變是引起石榴果實(shí)貯藏品質(zhì)劣變的主要原因之一。褐變的發(fā)生一般受溫度、濕度、病蟲霉菌、逆境脅迫等外在因素與失水、酶作用、能量盈虧等內(nèi)在因素的影響[7]。石榴果皮褐變通常由酶促褐變引起，其含有的酚類物質(zhì)在過氧化物酶（peroxidase，POD）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的催化作用下被氧化為醌類物質(zhì)，此類物質(zhì)進(jìn)一步聚合形成深褐色物質(zhì)，進(jìn)而使果實(shí)組織產(chǎn)生褐變[8]。此外，果皮能量代謝與其代謝酶活性的變化也與果皮褐變存在一定關(guān)系，在龍眼、荔枝等果實(shí)上已有研究[9-10]，但其與石榴果皮褐變的關(guān)系尚鮮有研究。因此，本實(shí)驗(yàn)以陜西引進(jìn)品種‘突尼斯軟籽’、傳統(tǒng)品種‘凈皮甜’和選育品種‘驪山紅’3 種石榴為實(shí)驗(yàn)材料，研究冷藏過程中石榴果皮褐變與酚類物質(zhì)代謝和能量代謝之間可能存在的關(guān)系，并比較3 個(gè)品種石榴的優(yōu)勢差異，旨在為石榴果皮褐變機(jī)理的闡明和不同品種石榴貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘突尼斯軟籽’石榴采自陜西省渭南市潼關(guān)縣金橋牧業(yè)有限公司，單果質(zhì)量在330～380 g之間；‘凈皮甜’‘驪山紅’石榴采自陜西省西安市臨潼區(qū)華瑞果業(yè)專業(yè)合作社，單果質(zhì)量分別在380～430 g和420～480 g之間。采收時(shí)選擇無病蟲病菌侵害、果面完好、色澤明亮、無裂紋和其他明顯機(jī)械損傷的石榴作原料。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline 6-sulfonic acid，ABTS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、抗壞血酸（VC）、鉬酸、福林-酚（均為分析純）上海源葉生物科技有限公司；高氯酸、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鋁、乙酸鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JX5001電子天平 上海浦春計(jì)量儀器有限公司；ZONKIA高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；UV-1990紫外分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；Spark酶標(biāo)儀 奧地利Tecan Austria GmbH公司；LC-2030 PLUS高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

采收后的石榴原料用0.015 mm厚聚乙烯薄膜袋和發(fā)泡網(wǎng)包裝，運(yùn)往西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院果蔬貯藏與加工實(shí)驗(yàn)室，于（4.0±0.5）℃、85%～90%相對(duì)濕度冷庫中低溫貯藏。貯藏過程中每15 d取樣，每組實(shí)驗(yàn)3 次重復(fù)，每次重復(fù)5 個(gè)石榴果實(shí)。實(shí)驗(yàn)過程中剝離石榴皮保存于封口袋，于－80 ℃冷凍備用。

1.3.2 褐變指數(shù)測定

果皮褐變指數(shù)測定參考寇莉萍等[11]的方法。按石榴果皮表面褐變面積分為以下6 級(jí)。0級(jí)：無褐變；1級(jí)：0＜褐變面積比例≤1/20；2級(jí)：1/20＜褐變面積比例≤1/10；3級(jí)：1/10＜褐變面積比例≤3/10；4級(jí)：3/10＜褐變面積比例≤3/5；5級(jí)：褐變面積比例＞3/5。

1.3.3 自由基清除能力測定

稱取石榴皮樣品0.5 g，加入10 mL 75%乙醇溶液研磨提取2 min，于8 000×g、4 ℃低溫離心10 min，取上清液（提取液）備用。

1.3.3.1 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基清除率測定參考徐冉冉等[12]的方法。實(shí)驗(yàn)前10 倍稀釋樣品提取液，反應(yīng)體系：25 μL稀釋液、2 mL 80%乙醇溶液、4 mL 0.045 mg/mL DPPH溶液。渦旋混勻后，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定樣品吸光度（A1）。蒸餾水調(diào)零，以相同體系不加DPPH溶液為對(duì)照，測定吸光度（A0）。按式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.3.2 ABTS陽離子自由基清除率測定

ABTS陽離子自由基清除率參考徐冉冉等[12]的方法測定。反應(yīng)體系：20 μL稀釋液、1.5 mL 7 mmol/L ABTS溶液（溶于20 mmol/L pH 4.5乙酸緩沖液，含2.45 mmol/L過硫酸鉀，黑暗靜置16 h后，調(diào)節(jié)734 nm波長處吸光度至7左右）反應(yīng)6 min后，加入2 mL 80%乙醇溶液再反應(yīng)6 min，于734 nm波長處測定樣品吸光度（Aj）。蒸餾水調(diào)零，以相同體系不加ABTS溶液為對(duì)照，測定734 nm波長處吸光度（Ai）。ABTS陽離子自由基清除率按式（2）計(jì)算。

1.3.4 酚類物質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)測定

1.3.4.1 總酚、總黃酮、花色苷含量

總酚、總黃酮、花色苷含量測定參考徐冉冉[12]及周鶴[13]等的方法，并作適當(dāng)調(diào)整。稱取1 g石榴皮，用10 mL 75%乙醇溶液研磨提取后室溫浸提24 h，于4 ℃、8 000×g離心10 min，取上清液冷藏備用，實(shí)驗(yàn)測定前適當(dāng)稀釋。

總酚含量采用福林-酚比色法測定，提取液20 倍稀釋，反應(yīng)體系：1 mL提取液、5 mL蒸餾水、0.5 mL福林-酚試劑、1.5 mL 20 g/100 mL Na2CO3溶液，避光反應(yīng)30 min，于765 nm波長處測定OD值。以蒸餾水作對(duì)照，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總酚含量，結(jié)果以每克樣品所含沒食子酸質(zhì)量表示，單位為mg/g。

總黃酮含量采用氯化鋁比色法測定，提取液10 倍稀釋，反應(yīng)體系：1 mL提取液、4 mL 75%乙醇溶液、0.5 mL 5 g/100 mL NaNO2溶液，靜置6 min后再加入0.5 mL 10 g/100 mL AlCl3溶液，再靜置6 min，加入5 mL 1 mol/L NaOH溶液和1.5 mL蒸餾水。以蒸餾水作對(duì)照，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果以每克樣品所含蘆丁質(zhì)量表示，單位為mg/g。

花色苷含量采用pH示差法測定，反應(yīng)體系：取0.5 mL提取液兩份，分別加入4.5 mL KCl緩沖液（0.025 mol/L，pH 1.0）和醋酸鈉緩沖液（0.4 mol/L，pH 4.5），室溫下平衡20 min，分別在510、700 nm波長處測定OD值。按公式（3）測定花色苷含量。

式中：A＝（A510nm－A700nm）pH1.0－（A510nm－A700nm）pH4.5；m為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量（449.2 g/mol）；DF為稀釋因子（20）；ε為花色苷的摩爾吸光系數(shù)（26 900 L/（mol·cm））；1表示比色皿光程（1 cm）；m樣表示制備提取液時(shí)樣品的質(zhì)量/g；V表示測定時(shí)所取提取液體積/mL。

1.3.4.2 多酚氧化酶、過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活力測定

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參考寇莉萍等[11]的方法，并稍作修改。稱取0.5 g石榴皮用5 mL乙酸-乙酸鈉緩沖提取液（內(nèi)含1 mmol/L聚乙二醇-6000、10 mmol/L VC、4 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮）研磨提取，于4 ℃、8 000×g離心10 min，取上清液待測。

PPO活力測定反應(yīng)體系：75 μL提取液、3 mL 0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）、0.75 mL 50 mmol/L鄰苯二酚溶液，于420 nm波長處測定吸光度，以每克石榴果皮每分鐘吸光度變化0.1為1 個(gè)PPO活力單位（U）。

POD活力測定反應(yīng)體系：40 μL提取液、2.4 mL 0.05 mol/L 愈創(chuàng)木酚溶液和160 μL 0.5 mol/L H2O2溶液，于470 nm波長處測定吸光度，以每克石榴果皮每分鐘吸光度變化0.1為1 個(gè)POD活力單位（U）。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活力測定參考周鶴[13]的方法，并適當(dāng)改動(dòng)。稱取0.5 g石榴果皮，加入5 mL 0.1 mol/L硼酸-硼砂緩沖液（含2 mmol/L EDTA、5 mmol/L巰基乙醇），冰浴研磨1 min，于4 ℃、8 000×g離心10 min，取上清液（酶提取液）0.5 mL，加入3 mL 50 mmol/L pH 8.8硼酸緩沖液，于37 ℃保溫5 min，加入0.5 mL 20 mmol/LL-苯丙氨酸溶液，再次于37 ℃保溫1 h。保溫結(jié)束后立即加入0.1 mL 6 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，于290 nm波長處測定OD值，以每小時(shí)酶促反應(yīng)體系吸光度變化0.01為1 個(gè)PAL活力單位（U）。以蒸餾水參比調(diào)零，以煮沸15 min滅活酶提取液為對(duì)照。

1.3.5 能量代謝相關(guān)指標(biāo)測定

1.3.5.1 ATP、ADP、AMP含量及能荷測定

參考周鶴[13]的方法進(jìn)行測定。稱取0.5 g石榴果皮，用5 mL高氯酸溶液（0.6 mol/L）冰浴研磨，勻漿于4 ℃、8 000×g離心10 min。取上清液2 mL，用1 mol/L KOH溶液調(diào)pH值至6.5～6.8，加超純水定容至3 mL，冰浴30 min后再次離心，上清液過0.22 μm水系膜，保存?zhèn)溆谩?/p>

采用高效液相色譜法測定三磷酸腺苷（triphosadenine，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphatase，ADP）、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）含量。測定條件：C18反向色譜柱（4.6 mm×250 nm，5 μm），進(jìn)樣體積20 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，采用梯度洗脫方式，流動(dòng)相為甲醇（A）和磷酸鉀鹽緩沖液（B）：0～5 min，100% A；5～7 min，80% A＋20% B；7～9 min，75% A＋25% B；10～20 min，100% A。按公式（4）計(jì)算能荷。

式中：cATP、cADP、cAMP分別表示ATP、ADP、AMP含量/（mg/g）。

1.3.5.2 ATPase活力測定

ATPase活力測定參考周鶴[13]的方法，具體包括線粒體膜相關(guān)的H＋-ATPase、Mg2＋-ATPase、Ca2＋-ATPase活力。

稱取0.5 g石榴皮，加入5 mL提取液（內(nèi)含5 mmol/L EDTA、5 mmol/L DTT、80 mmol/L Tris、1 mmol/L PMSF、10 mmol/L VC、250 mmol/L蔗糖、5 g/100 mL甘油），冰浴研磨1 min，于4 ℃、8 000×g離心10 min，取上清液冷藏備用。取0.2 mL酶提取液于35 ℃保溫3 min，加入0.5 mL ATPase反應(yīng)液、100 μL鉬酸銨溶液（1 mmol/L）、100 μL KNO3溶液（0.5 mol/L）和100 μL Na3VO4溶液（0.5 mol/L），再加入200 μL ATP溶液（5 mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)后于35 ℃保溫20 min，最后加入0.5 mL 20 g/100 mL 三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。4 ℃、8 000×g離心10 min，取上清液0.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和2 mL硫酸亞鐵-鉬酸銨溶液（5 g 硫酸亞鐵中加入10 mL硫酸鉬銨酸，再加100 mL蒸餾水溶解），靜置反應(yīng)2 min，在660 nm波長處測定OD值，結(jié)果以果皮組織中每小時(shí)每毫克蛋白中ATPase分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量為1 個(gè)ATPase活力單位，單位為μmol/（mg·h）。以蒸餾水作對(duì)照。

其中ATPase反應(yīng)液如下：H＋-ATPase反應(yīng)液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、20 mmol/L MgSO4、0.5 mol/L KCl；Mg2＋-ATPase反應(yīng)液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2、2 mmol/L EDTA、5 mmol/L DTT；Ca2＋-ATPase反應(yīng)液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L CaCl2、2 mmol/L EDTA、5 mmol/L DTT。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算，利用Origin 2022軟件進(jìn)行相關(guān)性分析（Pearson法）和主成分分析并作圖。數(shù)據(jù)分析工具為Minitab 18.0軟件，采用單因素方差分析法分析數(shù)據(jù)的差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷藏過程中不同品種石榴果皮褐變指數(shù)及抗氧化能力比較

由圖1A可知，石榴果皮褐變指數(shù)在低溫貯藏過程中顯著增加（P＜0.05）。其中，‘凈皮甜’果皮表現(xiàn)出較易褐變，其褐變指數(shù)顯著高于其余兩個(gè)品種（P＜0.05）?！荒崴管涀选谫A藏過程中果皮色澤較好，褐變程度最輕。

圖1 冷藏過程中不同品種石榴果皮褐變指數(shù)與自由基清除能力比較Fig. 1 Comparison of browning index and free radical scavenging capacity of pomegranate husk from different cultivars during cold storage

由圖1B、C可知，3 個(gè)品種石榴果皮DPPH自由基清除率均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，但整體變化范圍不大。對(duì)于ABTS陽離子自由基清除率，僅‘突尼斯軟籽’總體呈現(xiàn)出先升高后降低趨勢，而‘凈皮甜’保持穩(wěn)定，‘驪山紅’在貯藏15 d后顯著下降，30 d后保持穩(wěn)定。對(duì)于果皮DPPH自由基清除率和ABTS陽離子自由基清除率，均是‘突尼斯軟籽’顯著高于其余兩個(gè)品種（P＜0.05），而‘凈皮甜’在45 d后顯著高于‘驪山紅’（P＜0.05）。結(jié)果表明‘突尼斯軟籽’石榴果皮具有優(yōu)于其余兩個(gè)品種的抗氧化能力。

2.2 冷藏過程中不同石榴果皮酚類物質(zhì)代謝比較

2.2.1 冷藏過程中不同石榴果皮總酚、總黃酮和花色苷含量比較

由圖2A可知，3 種石榴果皮總酚含量在貯藏過程中波動(dòng)范圍較小?！荒崴管涀选た偡雍砍尸F(xiàn)先升高后降低趨勢，在貯藏結(jié)束時(shí)含量為35.86 mg/g。‘凈皮甜’果皮總酚含量在貯藏30 d后保持在17.01～19.06 mg/g之間，變化不顯著（P＞0.05）。‘驪山紅’果皮總酚含量在貯藏到第60天略微上升，隨后下降，到貯藏結(jié)束時(shí)為17.70 mg/g。其中，整個(gè)貯藏過程中‘突尼斯軟籽’果皮總酚含量顯著高于其余兩個(gè)品種（P＜0.05）。

圖2 冷藏過程不同品種石榴果皮酚類物質(zhì)含量比較Fig. 2 Comparison of phenolic contents of pomegranate husk from different cultivars during cold storage

由圖2B可知，3 種石榴果皮總黃酮含量整體上均呈先上升后下降趨勢，但波動(dòng)較小，貯藏結(jié)束時(shí)，‘突尼斯軟籽’‘凈皮甜’‘驪山紅’果皮總黃酮含量分別為1.58、0.98、0.97 mg/g。其中，‘突尼斯軟籽’石榴果皮總黃酮含量始終顯著高于其余兩個(gè)品種（P＜0.05），在15～60 d，‘凈皮甜’果皮總黃酮含量顯著高于‘驪山紅’（P＜0.05）。

由圖2C可知，3 種石榴果皮花色苷含量均隨冷藏時(shí)間延長先升高后降低，在貯藏結(jié)束時(shí)‘突尼斯軟籽’果皮總花色苷含量為19.3 mg/kg，‘凈皮甜’為4.2 mg/kg，‘驪山紅’為17.2 mg/kg。在貯藏過程中，‘凈皮甜’果皮花色苷含量始終顯著低于其余兩個(gè)品種（P＜0.05），此外，在貯藏30～75 d，‘驪山紅’果皮花色苷含量也顯著低于‘突尼斯軟籽’（P＜0.05）。

2.2.2 冷藏過程中不同石榴果皮PPO、POD和PAL活力比較

由圖3A可知，3 個(gè)品種石榴果皮PPO活力整體上都是隨貯藏時(shí)間延長呈現(xiàn)先升高后降低趨勢?！荒崴管涀选窆PO活力總體顯著低于其余兩個(gè)品種（P＜0.05），保持在3.38～4.98 U/（min·g）之間。貯藏0～30 d，‘凈皮甜’果皮PPO活力高于‘驪山紅’，但在45～90 d其PPO活力均低于‘驪山紅’，貯藏結(jié)束時(shí)‘凈皮甜’果皮PPO活力降為5.51 U/（min·g），‘驪山紅’的PPO活力為7.82 U/（min·g）。

圖3 冷藏過程不同品種石榴果皮酚類代謝相關(guān)酶活力比較Fig. 3 Comparison of phenolic metabolism-related enzyme activities of pomegranate husk from different cultivars during cold storage

由圖3B可知，‘突尼斯軟籽’與‘凈皮甜’果皮POD活力在45 d后均呈現(xiàn)顯著上升趨勢（P＜0.05），而‘驪山紅’果皮在30～60 d顯著下降（P＜0.05）。在貯藏0～45 d，‘突尼斯’軟籽果皮POD活力最低，‘凈皮甜’石榴果皮POD活力最高。在貯藏60～90 d，‘凈皮甜’果皮POD活力最高，其次是‘突尼斯軟籽’。貯藏結(jié)束時(shí)，‘突尼斯’‘凈皮甜’和‘驪山紅’果皮POD活力分別為31.2、38.3、11.3 U/（min·g）。

由圖3C可知，‘突尼斯軟籽’PAL活力在第60天驟增至114.6 U/（h·g），隨后呈下降趨勢，至貯藏結(jié)束時(shí)降為72.9 U/（h·g）。而‘凈皮甜’與‘驪山紅’PAL活力均在小范圍內(nèi)波動(dòng)，范圍分別為18.8～26.0、18.6～31.7 U/（h·g）。在冷藏過程中，‘突尼斯軟籽’果皮PAL活力均顯著高于其余兩個(gè)品種（P＜0.05）。

2.3 冷藏過程中不同石榴果皮能量代謝比較

2.3.1 冷藏過程中不同石榴果皮ATP、ADP、AMP含量及能荷比較

由圖4A可知，3 種石榴果皮ATP含量在貯藏過程中均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，其中‘突尼斯軟籽’與‘凈皮甜’石榴果皮ATP含量均在第60天達(dá)到最大，分別為7.47 mg/g和2.30 mg/g；‘驪山紅’果皮ATP含量在第15天最高，為2.33 mg/g。在整個(gè)貯藏過程中，‘突尼斯軟籽’果皮ATP含量顯著高于其余兩個(gè)品種（P＜0.05）。

圖4 冷藏過程不同品種石榴果皮能量物質(zhì)含量比較Fig. 4 Comparison of energy substance contents in pomegranate husk from different cultivars during cold storage

由圖4B可知，‘突尼斯軟籽’石榴ADP含量在貯藏過程中呈先升高后降低趨勢，在15～75 d其含量顯著高于‘凈皮甜’與‘驪山紅’（P＜0.05），貯藏結(jié)束時(shí)降為1.17 mg/g?！畠羝ぬ稹DP含量在貯藏過程中呈上升趨勢，除15 d外，整個(gè)冷藏過程中略高于‘驪山紅’，冷藏結(jié)束時(shí)為1.72 mg/g?！P山紅’果皮ADP含量整體上呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，結(jié)束時(shí)含量為1.29 mg/g。

由圖4C可知，3 種石榴果皮AMP含量均隨貯藏時(shí)間的延長呈顯著增加趨勢（P＜0.05）?！荒崴管涀选馎MP含量僅在45～60 d含量較低，其余時(shí)間AMP含量均高于其余兩個(gè)品種，在貯藏結(jié)束時(shí)增至1 007.7 μg/g。在貯藏前期（0～45 d），‘凈皮甜’果皮AMP含量略高于‘驪山紅’，而在貯藏后期（45～75 d），‘驪山紅’果皮AMP含量又略高于‘凈皮甜’，在冷藏第90天，‘凈皮甜’‘驪山紅’果皮AMP含量分別為908.1、774.0 μg/g。

由圖4D可知，‘突尼斯軟籽’石榴果皮能荷在貯藏0～60 d略有上升，隨后呈顯著下降趨勢（P＜0.05）?！畠羝ぬ稹c ‘驪山紅’果皮能荷總體呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。且在冷藏過程中，‘突尼斯’軟籽石榴果皮能荷總體上顯著高于其余兩個(gè)品種（P＜0.05）。

2.3.2 冷藏過程中不同石榴果皮ATPase活力比較

由圖5A可知，3 種石榴果皮H＋-ATPase活力在貯藏過程中均呈先升高后降低趨勢，其中除90 d外，‘突尼斯軟籽’石榴的H＋-ATPase活力在整個(gè)貯藏過程中均顯著高于其余兩個(gè)品種（P＜0.05）?！畠羝ぬ稹c‘驪山紅’果皮H＋-ATPase活力接近。在貯藏結(jié)束時(shí)，‘突尼斯軟籽’‘凈皮甜’‘驪山紅’果皮H＋-ATPase活力分別為5.73、5.37、6.08 μmol/（mg·h）。

圖5 冷藏過程不同品種石榴果皮能量代謝相關(guān)酶活力比較Fig. 5 Comparison of energy metabolism-related enzyme activities of pomegranate husk from different cultivars during cold storage

由圖5B可知，‘突尼斯軟籽’果皮Mg2＋-ATPase活力隨冷藏時(shí)間延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且整個(gè)貯藏過程中均顯著高于‘凈皮甜’和‘驪山紅’（P＜0.05），貯藏結(jié)束時(shí)為6.51 μmol/（mg·h）?！畠羝ぬ稹g2＋-ATPase活力隨冷藏時(shí)間延長也先升高后降低，且在30～75 d顯著高于‘驪山紅’（P＜0.05），貯藏結(jié)束時(shí)為5.18 μmol/（mg·h）?！P山紅’果皮Mg2＋-ATPase活力除第90天外均隨時(shí)間延長呈顯著下降趨勢，貯藏結(jié)束時(shí)為5.33 μmol/（mg·h）。

由圖5C可知，3 個(gè)品種Ca2＋-ATPase活力在整個(gè)貯藏過程中呈波動(dòng)變化，貯藏結(jié)束時(shí) ‘突尼斯軟籽’‘凈皮甜’‘驪山紅’果皮Ca2＋-ATPase活力分別為6.33、7.04、6.52 μmol/（mg·h）。

2.4 石榴果皮褐變與能量及酚類物質(zhì)代謝相關(guān)性分析

‘突尼斯軟籽’石榴果皮褐變指數(shù)與POD活力和AMP含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）（圖6A），‘凈皮甜’果皮褐變指數(shù)與總酚含量、POD活力和AMP含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與總黃酮含量、PAL活力和ADP含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）（圖6B）?！P山紅’果皮褐變指數(shù)與AMP含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與總酚含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與Mg2＋-ATPase活力呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與ABTS陽離子自由基清除率呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（圖6C）。綜上，石榴果皮褐變受酚類物質(zhì)含量、相關(guān)酶活力、能量物質(zhì)含量的影響。

圖6 石榴果皮褐變與能量及酚類物質(zhì)代謝相關(guān)性分析Fig. 6 Correlation analysis of pomegranate husk browning with energy and phenolic metabolism

2.5 石榴果皮能量及酚類物質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)主成分分析

表1是主成分分析法所得3 個(gè)主成分（principal component，PC）因子，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)83.540%。其中PC1特征值為9.561，貢獻(xiàn)率56.241%；PC2特征值為3.139，貢獻(xiàn)率為18.463%；PC3特征值為1.502，貢獻(xiàn)率為8.836%。前兩個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率已達(dá)74.704%，可基本反映指標(biāo)間相關(guān)信息。

表1 解釋的總方差Table 1 Total variance explained

載荷圖（圖7A）有助于進(jìn)一步分析各指標(biāo)之間的相關(guān)程度。根據(jù)PC1可知，石榴果皮ADP含量、總黃酮含量、DPPH自由基清除率、PAL活力、總酚含量、ATP含量、ABTS陽離子自由基清除率、Mg2＋-ATPase活力、H＋-ATPase活力、花色苷含量、能荷之間存在正相關(guān)關(guān)系，并且這些指標(biāo)與褐變指數(shù)和PPO活力存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。根據(jù)PC2可知，褐變指數(shù)與POD活力、AMP含量、Ga2＋-ATPase活力呈正相關(guān)，與PPO活力呈負(fù)相關(guān)。從圖7B可知，根據(jù)PC1可以明顯區(qū)分‘突尼斯軟籽’與其余兩個(gè)品種，‘驪山紅’與‘凈皮甜’石榴貯藏品質(zhì)更為相似。

圖7 石榴果皮能量及酚類物質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)主成分分析載荷圖和得分圖Fig. 7 PCA loading and score plots of energy and phenolic metabolismrelated indexes in pomegranate peel

3 討 論

3.1 3 種石榴果皮褐變與抗氧化能力的差異

冷藏是目前石榴貯藏保鮮最常見的手段，褐變常常發(fā)生在貯藏過程中并影響果實(shí)品質(zhì)。首先，石榴果皮含有豐富的多酚類物質(zhì)[14]，具有強(qiáng)抗氧化活力，其中DPPH自由基與ABTS陽離子自由基清除能力是反映抗氧化活性的具體指標(biāo)。徐洪宇等[15]研究發(fā)現(xiàn)在21 種水果中，石榴果皮總酚、總黃酮含量最高，并且具有較強(qiáng)的抗氧化活性。而徐冉冉等[12]研究發(fā)現(xiàn)在貯藏過程中石榴果皮的DPPH自由基與ABTS陽離子自由基清除能力有所減弱。本研究表明‘突尼斯軟籽’石榴具有優(yōu)于其余兩個(gè)品種的抗氧化能力，且褐變程度在3 個(gè)品種中最低。

3.2 3 種石榴果皮褐變與酚類代謝之間的關(guān)系及差異

石榴果皮的總酚含量在品種間具有明顯差異[15]，有研究表明石榴皮的抗氧化活性與總酚含量之間存在正相關(guān)關(guān)系[16]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，在更易發(fā)生褐變的‘凈皮甜’果皮中，總酚與總黃酮含量與DPPH自由基與ABTS陽離子自由基清除能力均存在顯著正相關(guān)性。酚類物質(zhì)是酶促褐變的重要底物，是石榴果皮褐變的重要影響因子，其含量的變化影響果皮的氧化-還原平衡[17]。石榴皮黃酮類化合物含量較高，能降低各類自由基活力，具有強(qiáng)于VC的抗氧化性[18]。石榴果皮花色苷同樣具有良好的抗氧化能力，對(duì)自由基表現(xiàn)出強(qiáng)清除能力[19-20]。PPO、POD、PAL是酚類代謝中的關(guān)鍵酶。PPO、POD酚類物質(zhì)被氧化從而加速深褐色物質(zhì)生成，進(jìn)而產(chǎn)生褐變[21]。PAL是苯丙氨酸代謝途徑中的重要酶，也是酚類物質(zhì)生成的關(guān)鍵酶，對(duì)果皮褐變具有重要影響[7,21]。

本研究結(jié)果顯示，褐變程度更低的‘突尼斯軟籽’石榴總酚、總黃酮含量更高，而其PPO和POD活力相對(duì)較低，因此推測‘突尼斯軟籽’石榴褐變度低是因?yàn)镻PO、POD活力較低，對(duì)酚類物質(zhì)的氧化程度較低，從而使酚類物質(zhì)含量保持較高。而褐變嚴(yán)重的‘凈皮甜’石榴PPO、POD活力在貯藏過程中整體上更高?？芾蚱嫉萚11]在茉莉酸甲酯貯藏保鮮‘凈皮甜’石榴實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，PPO活力在貯藏后期呈現(xiàn)下降趨勢，且與褐變指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，均與本研究結(jié)果一致。何瑛等[22]研究發(fā)現(xiàn)石榴果皮褐變底物主要是單寧物質(zhì)，并且通過對(duì)果皮褐變產(chǎn)物的提取、分離和定性定量分析發(fā)現(xiàn)褐變產(chǎn)物為蒽醌類化合物，具體包含4 種，分別為大黃酚、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚[23]。齊笑笑等[17]還研究了石榴采后果皮非酶褐變反應(yīng)過程中的酶、底物和產(chǎn)物，結(jié)果表明美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物5-羥甲基糠醛含量隨底物還原糖和氨基態(tài)氮含量減少而增加，導(dǎo)致非酶褐變發(fā)生，進(jìn)而對(duì)果皮褐變產(chǎn)生影響。故石榴果皮的褐變既有酶促褐變的作用，又存在非酶褐變的影響，深層次的原因還需進(jìn)一步通過分子生物學(xué)進(jìn)行研究。

3.3 3 種石榴果皮褐變與能量代謝之間的關(guān)系及差異

能量是生理代謝的基礎(chǔ)，有研究表示果實(shí)采后能量狀態(tài)對(duì)果皮褐變具有重要影響[24]，在貯藏過程中果皮ATP、ADP含量和能荷下降，能量代謝失衡，自由基攻擊膜脂和大分子使膜脂代謝遭到破壞，同時(shí)果實(shí)的逆境脅迫抵抗力下降，加速果皮褐變及果實(shí)品質(zhì)劣變[7,24]?，F(xiàn)有研究可證實(shí)果實(shí)能量狀態(tài)與果皮褐變之間存在密切聯(lián)系[9-10,25-26]。林毅雄等[9]研究發(fā)現(xiàn)龍眼果實(shí)在采后貯藏過程中ATP、ADP含量和能荷呈下降趨勢，AMP含量呈上升趨勢，并且采前噴施胺鮮酯的實(shí)驗(yàn)組果實(shí)果皮ATP、ADP含量和能荷更高，AMP含量更低，褐變指數(shù)上升得更緩慢。李澤等[10]研究發(fā)現(xiàn)減壓處理后的荔枝果皮能保持較高水平的ATP、ADP含量和能荷，AMP含量上升速率減緩，為果皮細(xì)胞膜修復(fù)提供了能量，可保護(hù)果皮細(xì)胞膜的完整性和功能，從而顯著降低荔枝果皮的褐變和霉變程度。因此，若貯藏過程中ATP與能荷保持較高水平，AMP維持在較低水平，果實(shí)就能維持正常代謝和細(xì)胞機(jī)能[24-25,27]。本研究結(jié)果顯示，‘突尼斯軟籽’石榴果皮在冷藏過程中保持了更高的ATP、ADP含量和能荷，并且褐變程度更輕。而褐變最嚴(yán)重的‘凈皮甜’石榴果皮ATP和ADP含量和能荷均較低。

ATPase存在于細(xì)胞的質(zhì)膜、液泡膜、線粒體膜等細(xì)胞器膜上，通過使ATP上的高能磷酸鍵斷裂和連接實(shí)現(xiàn)能量釋放和貯存，主要包含Mg2＋-ATPase、H＋-ATPase和Ca2＋-ATPase等[28-29]。王志華等[26]在研究蘋果果皮褐變時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)ATP相關(guān)酶活力下降時(shí)，果實(shí)線粒體結(jié)構(gòu)和功能被破壞，線粒體產(chǎn)能效率降低，使細(xì)胞能量虧損從而引起果皮褐變。因此ATPase保持高活力，能使果實(shí)保持良好的能量平衡，有助于延緩果皮褐變與果實(shí)衰老劣變[24]。汪永紅等[27]研究發(fā)現(xiàn)冷藏能維持紅肉蜜柚H＋-ATPase、Ca2＋-ATPase活力，保持ATP、ADP水平和能荷，從而保持果實(shí)品質(zhì)并延長果實(shí)的貯藏期。本研究發(fā)現(xiàn)褐變程度更低的‘突尼斯軟籽’石榴果皮在冷藏過程中維持了更高的H＋-ATPase和Mg2＋-ATPase活力。

綜上，通過能量物質(zhì)與相關(guān)酶活力變化可初步探討得出石榴果皮褐變與能量代謝間的關(guān)系，但基于蛋白質(zhì)組學(xué)的能量虧損和調(diào)控還需進(jìn)一步研究。王鶴潼[30]基于金針菇線粒體蛋白表達(dá)差異顯著，發(fā)現(xiàn)與能量代謝相關(guān)的生物過程包括碳水化合物分解代謝、谷氨酸分解代謝等，且金針菇能量代謝相關(guān)酶表達(dá)受抑制時(shí)，ATP消耗減少，糖酵解循環(huán)呼吸代謝減慢，以此降低金針菇的呼吸速率和褐變速度。能量代謝的分子機(jī)制影響生物代謝，進(jìn)而對(duì)果蔬貯藏造成不良影響。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，石榴在（4.0±0.5）℃貯藏過程中果皮褐變逐漸加深，其中‘突尼斯軟籽’石榴果皮褐變最輕，‘凈皮甜’石榴果皮褐變最嚴(yán)重。與‘凈皮甜’和‘驪山紅’相比，‘突尼斯軟籽’石榴果皮的自由基清除能力、酚類物質(zhì)含量、PAL活力更高，PPO活力更低。此外，‘突尼斯’軟籽石榴還保持了較高的ATP、ADP含量與能荷，其Mg2＋-ATPase、H＋-ATPase活力保持較好，能量狀態(tài)優(yōu)于‘凈皮甜’和‘驪山紅’。相關(guān)性分析和主成分分析結(jié)果表明，石榴果皮褐變與酚類代謝和能量代謝均相關(guān)，石榴果皮的褐變受酚類物質(zhì)含量、相關(guān)酶活力、能量物質(zhì)含量的影響。本研究立足石榴果皮褐變與代謝關(guān)系，發(fā)現(xiàn)石榴果皮褐變在品種間呈現(xiàn)的差異與果實(shí)在冷藏過程中的酚類代謝及能量代謝密切相關(guān)，為深入探究褐變轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)及蛋白組學(xué)提供了方向，進(jìn)而為選育更耐貯藏、不易褐變的石榴品種提供參考。