酵母菌及其衍生物抗菌功能研究進(jìn)展

馬 悅，單嘉宇，蔣耀東，黃俊楠，王 旭，張凌魁，楊 朔，董慶利

（上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093）

食品中含有豐富的營養(yǎng)成分，在較為適宜的環(huán)境條件下，某些致腐的微生物（又稱植物病原菌）可在食品基質(zhì)上大量繁殖，加速食品腐敗，嚴(yán)重影響食品質(zhì)量[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）報(bào)道，全球約25%的果蔬食品在收獲后因感染致腐微生物而腐爛變質(zhì)，由此造成的經(jīng)濟(jì)損失不可估量[2]。此外，食源性致病微生物的污染是造成食源性疾病頻發(fā)的重要原因之一，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康和生命安全。據(jù)報(bào)道，我國每年由食源性致病微生物污染引發(fā)的疾病病例數(shù)約占總食源性疾病暴發(fā)病例數(shù)的50%[3]。因此，實(shí)現(xiàn)食品中有害微生物的有效防控對提高食品質(zhì)量及保障食品微生物安全具有重要意義。

食品工業(yè)中通常應(yīng)用一些理化抗菌技術(shù)抑制食品中有害微生物的生長繁殖[4-5]。然而這種抗菌處理可能會(huì)對食品品質(zhì)造成不可逆的負(fù)面影響[6-7]。例如，超高溫瞬時(shí)殺菌技術(shù)可在135～150 ℃溫度環(huán)境下2～8 s內(nèi)迅速消殺有害微生物，從而保障食品的微生物安全，但高溫條件也可能導(dǎo)致食品中的蛋白質(zhì)變性，改變食品質(zhì)地并造成營養(yǎng)損失[8]。又如，苯甲酸作為一種常用的化學(xué)抗菌劑，在酸性條件下對霉菌、細(xì)菌等多種微生物均具有抑制作用，然而過量使用化學(xué)抗菌劑會(huì)使微生物產(chǎn)生抗藥性，且化學(xué)試劑的殘留可能對環(huán)境造成污染[9]。近年來，利用天然溫和的生物防控方法控制食品中有害微生物污染引起了廣泛關(guān)注[10]。在真實(shí)食品環(huán)境下，利用生防菌與致腐菌或致病菌間的相互作用可以抑制體系中有害微生物的生長繁殖，延緩食品腐敗并保障食品安全，且對食品的品質(zhì)及風(fēng)味影響較小，因此在食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[11-12]。

拮抗酵母菌具有來源廣泛、適應(yīng)性和繁殖能力強(qiáng)、代謝產(chǎn)物無毒且無致敏性的特點(diǎn)，可以通過競爭營養(yǎng)物質(zhì)和空間、分泌抗菌物質(zhì)、寄生于病原菌及誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗病性4 種主要的拮抗途徑抑制多種有害微生物的生長，作為生防制劑已被廣泛用于果蔬的采后保鮮[13]。除了利用拮抗酵母菌的生物活性外，利用酵母菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)特性，將一些化學(xué)抗菌劑包裹在失活的酵母菌細(xì)胞中也可以實(shí)現(xiàn)酵母菌的抗菌功能化。與一般的聚合物載藥原理相同，酵母菌載體可提高化學(xué)抗菌劑的局部濃度和穩(wěn)定性，從而提高抗菌效率[14]。然而目前關(guān)于酵母菌抗菌功能的綜述局限于酵母菌及其代謝產(chǎn)物與特定有害微生物之間的拮抗作用[15-17]，對利用失活酵母菌搭載化學(xué)抗菌劑從而實(shí)現(xiàn)高效抗菌效果的總結(jié)尚待完善。

本文在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，從拮抗作用及搭載抗菌藥兩個(gè)方面歸納酵母菌的抗菌功能：在拮抗作用方面，總結(jié)討論拮抗酵母菌的種類、來源、與其他抗菌技術(shù)的聯(lián)合抗菌效果及其拮抗的機(jī)制；同時(shí)分析酵母菌作為天然載體搭載多種化學(xué)抗菌劑的優(yōu)勢及局限性。此外，展望未來酵母菌在抗菌領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向，旨在為以酵母菌為基礎(chǔ)的新型抗菌劑的開發(fā)提供參考，以期更好地提高食品質(zhì)量，保障食品安全。

1 拮抗酵母菌的來源及種類

拮抗酵母菌廣泛存在于果實(shí)表面、葉片、根部、土壤和海水等多種自然環(huán)境中，可通過離體/體外（in vitro）或活體/體內(nèi)（in vivo）篩選兩類方法實(shí)現(xiàn)拮抗酵母菌的篩選與分離[18-19]。其中，體外篩選是指在配制的培養(yǎng)基上，將潛在的拮抗酵母菌和對其敏感的植物病原菌共同培養(yǎng)。孵育特定時(shí)間后，通過檢測敏感植物病原菌的存活率，評價(jià)相應(yīng)酵母菌的拮抗活性。體內(nèi)篩選則是以真實(shí)果蔬基質(zhì)作為兩者的共培養(yǎng)基質(zhì)，通過計(jì)算果蔬的患病率來評價(jià)相應(yīng)酵母菌的拮抗活性。目前，國內(nèi)外研究者已經(jīng)通過上述兩類方法成功地篩選分離出了多種不同來源的拮抗酵母菌。例如，Wilson等[20]早在1993年即通過體內(nèi)篩選的方法將具有拮抗活性的喜橄欖假絲酵母菌（Candida oleophila）從番茄果實(shí)中篩選并分離出來，目前該酵母菌已被廣泛用于降低采后蘋果果實(shí)青霉病的發(fā)病率[21]。Qin Guozheng等[22]也通過體內(nèi)篩選的方法從蘋果果實(shí)中分離出羅倫隱球菌酵母菌（Cryptococcus laurentii），該酵母菌可有效地抑制由于互生鏈格孢菌（Alternaria alterneta）、擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和黑根霉（Rhizopus stilonifer）感染而導(dǎo)致的甜櫻桃果實(shí)腐爛，實(shí)現(xiàn)果蔬采后保鮮。體外篩選的方法通?？舍槍我幻舾芯晖瑫r(shí)篩選多個(gè)潛在拮抗酵母菌。例如，Cabanas等[23]在配制的馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上一次性篩選出了對光滑青霉（Penicillium glabrum）具有拮抗活性的陸生畢赤酵母菌（Pichia terricola）、出芽短梗霉/黑酵母菌（Aureobasidium pullulans）和接合囊酵母菌（Zygoascus meyerae）。Chen Ou等[24]也通過體外篩選方法，從來源于柑橘園的78 株酵母菌中成功篩選出16 株對指狀青霉（Penicillium digitatum）具有抗菌性的拮抗酵母菌。

如表1所示，體內(nèi)篩選的方式可以同時(shí)監(jiān)測酵母菌對病菌的抑制作用及其對食品基質(zhì)理化性質(zhì)的影響，現(xiàn)已成為拮抗酵母菌的主要篩選途徑。然而，該方法相較于體外篩選通常需要更長的篩選周期，導(dǎo)致篩選效率較低。未來可以將體內(nèi)外篩選方法結(jié)合，通過體外篩選的方法，針對同一敏感菌同時(shí)篩選多種潛在拮抗酵母菌，再進(jìn)行二次體內(nèi)篩選，評價(jià)其在真實(shí)食品基質(zhì)上的拮抗效率，提高拮抗酵母菌的篩選效率。

表1 典型拮抗酵母菌的來源及其篩選方法Table 1 Sources of typical antagonistic yeasts and their screening methods

2 拮抗酵母菌的抗菌作用

2.1 單一拮抗酵母菌抗菌作用

表2總結(jié)了幾種典型的拮抗酵母菌對特定致病菌或致腐菌的抑制效果。雖然抗菌效果因拮抗酵母菌的代謝活性、生命周期、繁殖能力及外部環(huán)境的不同而有所區(qū)別，但總體而言，單一酵母菌的抑菌譜較窄且拮抗效率有待提高，因此，商業(yè)化的酵母菌拮抗劑通常是多種拮抗酵母菌的組合，或與物理化學(xué)抗菌手段相結(jié)合，以滿足實(shí)際應(yīng)用中對廣譜高效抗菌功能的需求[17]。

表2 典型拮抗酵母菌的抗菌效果Table 2 Antimicrobial effects of typical antagonistic yeasts

2.2 多種拮抗酵母菌聯(lián)合抗菌作用

單一拮抗酵母菌的抗菌譜較窄且容易引發(fā)有害微生物耐藥。聯(lián)合多種拮抗酵母菌可望拓寬抗菌譜并提高整體抗菌效率，由此減少酵母菌拮抗劑的使用量和使用頻率，抑制有害微生物耐藥的發(fā)生。例如，Janisiewicz等[32]的研究表明，相較于等量的單一種類拮抗酵母菌，美極梅奇酵母菌（Metschnikowia pulcherrima）和羅倫隱球酵母菌聯(lián)合使用對采后蘋果青霉菌腐爛的控制效果更佳。Guetsky等[33]發(fā)現(xiàn)季也蒙畢赤酵母菌（Pichia guilliermondii）與蕈狀芽鞄桿菌（Bacillus mycoides）在不同溫度和濕度條件下聯(lián)合使用，可將草莓葉片及植株中灰葡萄孢的抑制率從74.0%提高到88.0%～99.8%。

然而不同種拮抗酵母菌之間的相容性可能影響它們聯(lián)合使用時(shí)的拮抗效果。例如，相較于單一酵母菌處理組，兩種黏紅酵母菌（SL1和SL30）聯(lián)合使用對蘋果果實(shí)傷口中灰霉病的抑制效率反而下降[34]。這可能是因?yàn)椴煌N類拮抗酵母菌之間存在對營養(yǎng)和空間的競爭關(guān)系，導(dǎo)致其對植物病原菌的抗菌活性總體降低。因此，聯(lián)合多種拮抗酵母菌提高抗菌效率的相關(guān)研究應(yīng)注重于酵母菌種的篩選，避免拮抗酵母菌之間的競爭。在同一系統(tǒng)共存的前提下實(shí)現(xiàn)協(xié)同抗菌效應(yīng)的最大化。

2.3 拮抗酵母菌聯(lián)合物理抗菌方法

借助熱處理[35]、紫外線照射[36]、臭氧處理[37]和微波處理[38]等物理手段控制有害微生物的生長繁殖是食品領(lǐng)域中常用的抗菌方法。然而長時(shí)間、高強(qiáng)度的物理抗菌處理可能影響食品質(zhì)地和風(fēng)味。將其與拮抗酵母菌聯(lián)合使用有望提高抗菌效率，從而減少食品在苛刻物理抗菌環(huán)境下的處理時(shí)間及強(qiáng)度，降低食品質(zhì)量及風(fēng)味損失。例如，Zhou Yahan等[39]將采后受傷的柑橘果實(shí)用53 ℃的熱水處理2 min后引入膜醭畢赤酵母菌，成功提高了對意大利青霉（Penicillium italicum）和指狀青霉的抑菌效率，顯著降低了采后柑橘青霉病和綠霉病的發(fā)病率及病斑的直徑。此外，聯(lián)合作用后有效提高了系統(tǒng)內(nèi)苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶的活性，促進(jìn)了抗菌活性物質(zhì)的合成。相似地，Zhao Yan等[40]用45 ℃的熱水和季也蒙畢赤酵母菌先后處理了被匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）和擴(kuò)展青霉感染的桃子果實(shí)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合熱水和拮抗酵母菌處理可以提高果實(shí)真菌病害的抑制率，延緩桃子果實(shí)中抗氧化參數(shù)的下降，實(shí)現(xiàn)了采后桃果的保鮮。然而，拮抗酵母菌作為一種微生物，對環(huán)境壓力的耐受力有一定的閾值。當(dāng)其與高強(qiáng)度的物理抗菌手段同時(shí)聯(lián)用時(shí)，有可能造成自身菌體的損傷失活，喪失拮抗功能。因此，針對拮抗酵母菌與物理方法聯(lián)合的開發(fā)需要注意物理抗菌手段及強(qiáng)度對拮抗酵母菌拮抗活性的影響。此外，應(yīng)該在理解不同種抗菌手段抗菌機(jī)制的基礎(chǔ)上，量化各手段對抗菌效率提升的貢獻(xiàn)，實(shí)現(xiàn)聯(lián)合抗菌效率的最大化。

2.4 拮抗酵母菌聯(lián)合化學(xué)抗菌方法

將拮抗酵母菌與化學(xué)物質(zhì)聯(lián)用是提高其抗菌效率的另一策略。根據(jù)所應(yīng)用的化學(xué)試劑的類別可將其分為抗菌化學(xué)藥劑、金屬鹽以及植物激素。表3總結(jié)了典型的拮抗酵母菌與各類化學(xué)物質(zhì)聯(lián)用后，針對特定植物病原菌的協(xié)同抗菌效果。不同種類的化學(xué)制劑與拮抗酵母菌之間的協(xié)同抗菌機(jī)制有所不同。例如，苯并-(1,2,3)-噻二唑-7-硫代甲酸甲酯（benzo-thiadiazole-7-carbothioic acid methyl ester，BTH）、殼聚糖及苯菌靈能夠直接抑制植物病原菌生長，與拮抗酵母菌聯(lián)合使用后的抗菌效率提升作用可能歸因于簡單的抗菌效應(yīng)疊加[41-43]。然而，植物激素則是通過增加拮抗酵母菌群的數(shù)量和誘導(dǎo)宿主對植物病原體的抗性來提高拮抗酵母菌的抗菌效率，其協(xié)同抗菌的機(jī)制更為復(fù)雜，需要根據(jù)情況具體分析。

表3 拮抗酵母菌與典型化學(xué)制劑聯(lián)合的抗菌效果Table 3 Antimicrobial effects of antagonistic yeast in combination with typical chemical agents

拮抗酵母菌與化學(xué)物質(zhì)的聯(lián)合使用因其低成本、高效率的特點(diǎn)已經(jīng)成為食品工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的抗菌策略之一。已有研究表明，在保證相同殺菌效果的前提下，添加拮抗酵母菌可降低化學(xué)抗菌物質(zhì)的投放劑量，從而降低有害微生物對相應(yīng)化學(xué)制劑的耐藥性，為此后拮抗酵母菌生防制劑的商業(yè)化推廣提供了新思路。然而，化學(xué)制劑也可能對拮抗酵母菌的抗菌活性帶來負(fù)面影響。因此，有必要系統(tǒng)性地量化化學(xué)制劑與酵母菌之間的相互作用，為優(yōu)化抗菌劑配比提供科學(xué)依據(jù)。

3 拮抗酵母菌抗菌作用機(jī)制

如圖1所示，拮抗酵母菌的抗菌機(jī)制可分為4 個(gè)主要路徑：1）與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)及空間；2）分泌抗菌物質(zhì)；3）直接寄生在病原菌菌絲上；4）誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗病性。

圖1 拮抗酵母菌的抗菌機(jī)制示意圖Fig. 1 Schematic diagram of antimicrobial mechanisms of antagonistic yeasts

3.1 與病原菌的競爭作用

拮抗酵母菌與植物病原菌競爭有限的空間和營養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)其生防作用最主要的機(jī)制之一。相較于典型的植物致病菌，拮抗酵母菌具有適應(yīng)能力強(qiáng)、繁殖迅速等特點(diǎn)，使其可以在短時(shí)間內(nèi)迅速搶占果蔬傷口處的營養(yǎng)與空間，由此抑制植物病原菌的生長繁殖，實(shí)現(xiàn)果蔬的采后保鮮[17]。

3.1.1 競爭營養(yǎng)物質(zhì)

可以根據(jù)營養(yǎng)物質(zhì)的種類將拮抗酵母菌和植物病源菌對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭分為碳源營養(yǎng)物、氮源營養(yǎng)物和金屬離子。相較于碳源和氮源營養(yǎng)物質(zhì)，參與細(xì)胞內(nèi)酶代謝及合成的金屬離子在食品基質(zhì)中的含量較少，是拮抗酵母菌與植物病原微生物競爭的主要營養(yǎng)對象[49]。拮抗酵母菌所產(chǎn)生的異羥肟酸鹽類物質(zhì)中，N-羥基及羰基氧原子均可以作為三價(jià)鐵離子（Fe3＋）的配體，與其形成穩(wěn)定的鐵離子復(fù)合物，從而減少同一營養(yǎng)體系下植物致病菌對Fe3＋的獲取。典型的鐵載體結(jié)構(gòu)如圖2所示。例如，拮抗黏紅酵母菌可以通過產(chǎn)生鐵載體紅酵母菌酸提高對擴(kuò)展青霉的生物防控效率[50]。此外，Saravanakumar等[51]證明了美極梅奇酵母菌和核果梅奇酵母菌可以產(chǎn)生Pulcherrimnic acid鐵載體，通過結(jié)合Fe3＋產(chǎn)生一種紅色染料Pulcherrimin，成功抑制了灰葡萄孢、互生鏈格孢菌和擴(kuò)展青霉植物病原菌在采后蘋果果實(shí)上的生長繁殖。然而，一些有害微生物也可產(chǎn)生鐵載體，與同一營養(yǎng)體系下的拮抗酵母菌競爭鐵離子。例如，革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌分泌的Staphyloferrin、革蘭氏陰性菌大腸桿菌分泌的腸桿菌素、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）分泌的熒光嗜鐵素和螯鐵蛋白以及植物致病真菌粉紅鐮刀菌（Fusarium roseum）產(chǎn)生的一種線型鐵載體（fusarinineB）均可與環(huán)境中的鐵離子結(jié)合，為自身提供競爭性的生長優(yōu)勢[52]。因此，拮抗酵母菌是否占有鐵離子的競爭優(yōu)勢主要取決于競爭者所分泌的鐵載體的產(chǎn)量及其對Fe3＋的親和性。

圖2 拮抗酵母菌和有害微生物產(chǎn)生的鐵載體結(jié)構(gòu)Fig. 2 Chemical structures of siderophores produced by antagonistic yeasts and harmful microorganisms

除金屬離子外，對碳源和氮源營養(yǎng)物質(zhì)的競爭也是拮抗酵母菌抑制有害微生物的重要拮抗途徑。早在1996年，F(xiàn)ilonow等[53]利用13C標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)等量接種的羅倫隱球酵母菌和粉紅擲抱酵母菌（Sporobolomyces roseus）在蘋果果實(shí)傷口處培養(yǎng)48 h后，所利用葡萄糖、果糖和蔗糖的量遠(yuǎn)高于灰霉病菌灰葡萄孢。相較于對照組，接種拮抗酵母菌的蘋果果實(shí)灰霉病的發(fā)病率降低了約80%。由此可知，在有限的營養(yǎng)條件下，拮抗酵母菌可通過迅速地?fù)寠Z植物致病菌的碳源營養(yǎng)而抑制同一體系下有害微生物的生長繁殖，從而減少采后果蔬腐敗病的發(fā)病率，提高采后果蔬質(zhì)量。然而在含糖量較高的果蔬體系中，果實(shí)中所富含的D-葡萄糖、D-果糖和蔗糖等可以同時(shí)為拮抗酵母菌及病原體提供足量的碳源營養(yǎng)。此時(shí)對碳源營養(yǎng)的競爭不太可能發(fā)揮重要作用[54]。除了碳源營養(yǎng)外，果蔬中含有的氨基酸、胺類、多肽、蛋白質(zhì)和核酸是微生物生長繁殖所需氮源營養(yǎng)物的主要來源。Liu Pu等[55]在含有檸檬形克勒克酵母菌（Kloeckera apiculata）和意大利青霉菌的柑橘傷口處添加氨基酸后，削弱了兩者對氮源營養(yǎng)的競爭，導(dǎo)致拮抗酵母菌的生防效果顯著下降，證明了競爭氮源營養(yǎng)是拮抗酵母菌發(fā)揮生防功能的另一重要途徑。

3.1.2 競爭生存空間

微生物的生長繁殖除了對營養(yǎng)物質(zhì)的需求外，還需要一定的生存空間。對生存空間的競爭是酵母菌抑制植物病原菌的另一個(gè)關(guān)鍵拮抗途徑。在真實(shí)食品基質(zhì)中，可用的定植空間十分有限，一些拮抗酵母菌通過在傷口處迅速繁殖并形成生物被膜占據(jù)有限的生存空間，從而抑制其他有害微生物的繁殖[56]。例如，只有具有強(qiáng)定植能力的生物被膜狀態(tài)下的釀酒酵母菌M25才能夠有效地抑制擴(kuò)展青霉在蘋果傷口處的感染，證明了拮抗酵母菌可能是通過形成酵母菌生物被膜占據(jù)定植空間，實(shí)現(xiàn)對植物病原體的抑制[57]。然而有些可以生成生物被膜的酵母菌，在定植過程中會(huì)轉(zhuǎn)化為菌絲形式，攻擊宿主細(xì)胞，即使在沒有植物病原菌的條件下仍會(huì)導(dǎo)致采后果蔬的病變。例如，發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）DISAABA 726是一種可以形成生物被膜的酵母菌，對由念珠菌屬（Moniliniaspp.）病原菌引起的蘋果褐腐病具有出色的拮抗活性。然而當(dāng)其接種在桃果中，發(fā)酵畢赤酵母菌會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧倬z狀態(tài)，加速桃組織的腐爛[58]。由此可見，不同的宿主環(huán)境可能誘導(dǎo)酵母菌狀態(tài)的改變，導(dǎo)致其拮抗功能的下降甚至使之具有致病性。因此，對酵母菌拮抗功能的研究必須限定在特定的應(yīng)用環(huán)境下才具有參考意義。

總之，競爭有限的營養(yǎng)物質(zhì)及空間是酵母菌拮抗作用的重要機(jī)制之一。然而只有當(dāng)酵母菌對營養(yǎng)和空間的競爭能力強(qiáng)于植物病原體的時(shí)候，才能發(fā)揮其生防作用，減少采后果蔬的病發(fā)率，提高食品質(zhì)量。此外還需要考慮酵母菌在不同宿主環(huán)境下因狀態(tài)改變而導(dǎo)致的對宿主的致病性。

3.2 分泌抗菌物質(zhì)

拮抗酵母菌可能通過分泌抗菌物質(zhì)抑制植物病原體的生長繁殖[59]。根據(jù)抗菌物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)可將其分為嗜殺毒素、裂解酶類和揮發(fā)性VOCs。

3.2.1 嗜殺毒素

某些酵母菌具有嗜殺活性，即能分泌蛋白質(zhì)類的殺手毒素殺死其他菌株，而其自身則對殺手毒素具有免疫力[60]。通常嗜殺酵母菌所分泌的殺手毒素被糖基化后會(huì)與目標(biāo)微生物細(xì)胞壁上的一級受體（β-1,3-D-葡聚糖、β-1,6-D-葡聚糖、β-1,3-甘露糖蛋白和幾丁質(zhì)）結(jié)合。隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)膜上，與二級受體結(jié)合并最終通過水解細(xì)胞壁、破壞細(xì)胞膜、阻斷細(xì)胞周期、攻擊tRNA、破壞DNA或阻斷鈣的攝取，導(dǎo)致敏感病原體失活[61]。

目前研究較多的嗜殺酵母菌是釀酒酵母菌，它可以產(chǎn)生3 種典型的嗜殺毒素——K1、K2和K28。K1毒素首先與目標(biāo)微生物細(xì)胞壁中的一級受體β-1,6-D-葡聚糖進(jìn)行特異性結(jié)合，改變細(xì)胞通透性，然后由附著在細(xì)胞質(zhì)膜上的細(xì)胞壁蛋白Kre1p介導(dǎo)，將含有大量疏水氨基酸結(jié)構(gòu)的K1毒素遞送到細(xì)胞質(zhì)膜上，形成陽離子通道，導(dǎo)致鉀離子大量泄漏并最終造成目標(biāo)微生物死亡[52]。K2毒素與K1毒素具有相似的前軀體結(jié)構(gòu)，因此兩者的結(jié)合受體及作用途徑相同[62]。K28毒素的一級受體是則是細(xì)胞壁上的β-1,3-甘露糖蛋白，而細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Erd2p則可能作為K28毒素的二級受體。K28毒素的毒素信號最終被傳導(dǎo)到目標(biāo)微生物的細(xì)胞核內(nèi)，通過抑制其DNA的合成阻斷細(xì)胞生命周期，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[63]。除了釀酒酵母菌外，膜醭畢赤酵母菌可以產(chǎn)生PMKT和PMKT2兩種嗜殺毒素，從而抑制其他致病菌甚至其他種類拮抗酵母菌的生長[64]。

針對嗜殺毒素未來的研究方向可以分為3 類：1）合成機(jī)制及受體結(jié)構(gòu)探究。除釀酒酵母菌外，膜醭畢赤酵母菌，土星擬威爾酵母菌（Williopsis saturnus）、威客漢姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus）和乳酸克魯維酵母菌（Kluyveromyces lactis）等其他嗜殺酵母菌的嗜殺毒素的合成路線及其受體結(jié)構(gòu)的研究較為罕見，有待進(jìn)一步完善。2）嗜殺毒素的活性評估。絕大多數(shù)嗜殺毒素的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，受pH值、溫度和水分活度等環(huán)境因素的影響較大。因此嗜殺酵母菌應(yīng)用于真實(shí)食品基質(zhì)時(shí)，應(yīng)該系統(tǒng)評估不同食品基質(zhì)及加工環(huán)境對嗜殺酵母菌所產(chǎn)生的嗜殺毒素活性的影響。3）嗜殺毒素的靶向改性。除有害微生物外，一些益生菌或拮抗酵母菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中也具有嗜殺毒素的結(jié)合受體，因此可能被嗜殺毒素滅活。對此可以通過基因工程或者化學(xué)修飾技術(shù)，賦予嗜殺毒素針對有害微生物的靶向特性，提高對有害微生物的防控效率。

3.2.2 裂解酶類

幾丁質(zhì)、葡聚糖和蛋白質(zhì)是組成微生物細(xì)胞的重要組成成分，某些拮抗酵母菌可以通過分泌相應(yīng)的裂解酶破壞特定微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而抑制其生長繁殖[17]。

根據(jù)幾丁質(zhì)酶作用時(shí)的切割位點(diǎn)，可以將其分為內(nèi)切酶和外切酶兩大類。其中內(nèi)切酶可以作用于幾丁質(zhì)中的β-1,4糖苷鍵，在幾丁質(zhì)長鏈中隨機(jī)切割，形成二乙酰殼二糖及低分子殼寡糖。外切幾丁質(zhì)酶再細(xì)分為兩類：催化幾丁質(zhì)從非還原性末端釋放二乙酰殼二糖的外切幾丁質(zhì)水解酶以及可以分解低分子殼寡糖，生成N-乙酰葡萄糖胺的N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶[65]。一般情況下，拮抗酵母菌會(huì)同時(shí)產(chǎn)生多種幾丁質(zhì)酶，共同作用實(shí)現(xiàn)抗菌功能。例如，美極梅奇酵母菌和羅倫隱球菌酵母菌均可以同時(shí)分泌出內(nèi)切和外切幾丁質(zhì)酶，減少了由于蘋果中灰葡萄孢及梨中擴(kuò)展青霉感染而導(dǎo)致的水果采后腐爛[66-67]。與幾丁質(zhì)酶相似，葡聚糖酶通過破壞β-1,4糖苷鍵裂解有害微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的葡聚糖致其死亡。同理，葡聚糖酶也可以分為內(nèi)切酶和外切酶兩類。前者是在葡聚糖的隨機(jī)位點(diǎn)水解β-1,4糖苷鍵，生成聚合度較小的寡糖及單體葡萄糖，而后者則是從葡聚糖的非還原端依次切割葡萄糖單元的殘基，破壞葡聚糖結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)葡聚糖的結(jié)構(gòu)裂解[68]。例如季也蒙畢赤酵母菌分泌的外切葡聚糖酶可有效抑制蘋果果實(shí)中灰葡萄孢的感染。然而上調(diào)或下調(diào)拮抗酵母菌中編碼該葡聚糖酶的基因雖然能夠影響酶的表達(dá)量，但是對其抗菌效果影響甚微。這可能是由于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中葡聚糖層外部的酵母菌甘露糖蛋白的空間阻隔效應(yīng)，使得只有少量的葡聚糖酶進(jìn)入葡聚糖層催化水解反應(yīng)[69]。此外，這些進(jìn)入內(nèi)部的葡聚糖酶也難以擴(kuò)散出去，從而被周圍的葡聚糖重復(fù)利用。因此，在不存在蛋白酶的條件下，水解葡聚糖對酶的需求量極低，調(diào)控拮抗酵母菌內(nèi)葡聚糖酶的表達(dá)量對其生防效率影響較小。在此后的研究中，可通過添加蛋白酶驗(yàn)證上述假說。

某些拮抗酵母菌可以分泌蛋白酶，通過催化有害微生物中蛋白質(zhì)分子的酰胺鍵水解實(shí)現(xiàn)對其生長繁殖的控制。根據(jù)催化位點(diǎn)的特性和作用條件的不同，將蛋白酶分為絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸（硫醇）蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶4 類[70]。例如，拮抗黑酵母菌通過分泌堿性絲氨酸蛋白酶可以有效抑制灰葡萄孢、核果褐腐病菌（Monilinia laxa）和擴(kuò)展青霉的菌絲生長，表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性能[71-72]。將該拮抗酵母菌中控制堿性絲氨酸蛋白酶的相關(guān)基因整合到大腸桿菌BL21后，大腸桿菌也可以有效抑制相關(guān)植物致病菌的生長，充分證明了拮抗酵母菌分泌的蛋白酶是其實(shí)現(xiàn)抗菌功能的重要途徑之一[73]。

3.2.3 揮發(fā)性有機(jī)化合物

VOCs是由某些拮抗酵母菌在其代謝過程中產(chǎn)生的具有一定抗菌活性的醇類、酯類等小分子物質(zhì)（分子質(zhì)量小于300 Da）[74]。例如，Zhou Yi等[75]利用固相微萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)尼泊爾德巴利酵母菌（Debaryomyces nepalensis）可以通過分泌苯乙醇減少芒果果實(shí)中約40%的盤長孢狀刺盤孢（Colletotrichum gloeosporioides）的菌絲生長。異常畢赤酵母菌（Pichia anomala）所分泌2-苯基乙酸乙酯可有效抑制赭曲霉菌（Aspergillus ochraceus）的生長[76]。然而在實(shí)際情況下，拮抗酵母菌可以產(chǎn)生多種VOCs協(xié)同抑制病菌生長繁殖。因此，純化后的單一VOC對特定病原菌的體外抑制效果不能直接反應(yīng)該拮抗酵母菌在真實(shí)食品基質(zhì)中的拮抗效果。

拮抗酵母菌的衍生物VOCs有望作為一種新的生防制劑應(yīng)用于果蔬采后病原菌的控制[77]。當(dāng)VOCs用作生防劑時(shí)，通常需要在密閉的條件下才能維持足夠高的濃度實(shí)現(xiàn)有效的抑菌活性。然而，果蔬的呼吸作用會(huì)迅速消耗掉該密閉環(huán)境中的氧氣，迫使果蔬細(xì)胞進(jìn)行無氧呼吸，將果蔬中的糖和有機(jī)酸等營養(yǎng)物質(zhì)分解成乙醇和乙醛等不完全氧化產(chǎn)物，對果蔬的感官特性造成負(fù)面影響，降低食品質(zhì)量。對此，可以在密閉體系中充入大量氧氣來避免無氧呼吸，然而果蔬在有氧呼吸條件下可能釋放大量的熱能，導(dǎo)致果蔬附近的溫度上升，增加病菌的繁殖活性，降低VOCs的抗菌效率[78]。原位富集拮抗酵母菌產(chǎn)生的抗菌VOCs是突破此類生物防治劑應(yīng)用限制的關(guān)鍵。例如，Parafati等[77]將可產(chǎn)生VOCs的拮抗酵母菌固定在水凝膠顆粒中，利用水凝膠材料中多孔結(jié)構(gòu)對VOCs的富集性能，實(shí)現(xiàn)了在開放環(huán)境下VOCs對采后草莓和柑橘中灰色、綠色和藍(lán)色霉菌的長效抑制，為酵母菌基VOCs生防制劑的產(chǎn)業(yè)化提供了新思路。

3.3 直接寄生作用

直接的寄生效應(yīng)是指拮抗酵母菌依附在病原菌的菌絲結(jié)構(gòu)中，通過從病原菌細(xì)胞中汲取營養(yǎng)或釋放相關(guān)裂解酶破壞病原菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，抑制其生長繁殖，從而減少由病原菌感染而引發(fā)的果蔬采后病變，提高果蔬質(zhì)量[17]。例如，Liu Ye等[29]通過電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)桔梅奇酵母菌（Metschnikowia citriensis）會(huì)寄生在指狀青霉的菌絲上，通過奪取原本由青霉菌獲得的鐵離子，減少了71.22%的致病菌菌絲生長。而扣囊復(fù)膜孢酵母菌（Saccharomycopsis schoenii）則是通過寄生在耳念珠菌（Candida auris）中獲得蛋氨酸，一方面可作為自身的氮源營養(yǎng)，另一方面也可刺激扣囊復(fù)膜孢酵母菌中天冬氨酸蛋白酶基因的高表達(dá)，所產(chǎn)生的天冬氨酸蛋白酶可破壞耳念珠菌的細(xì)胞壁，使其失活[79]。除蛋白酶外，拮抗酵母菌產(chǎn)生的其他裂解酶，如β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶也可能導(dǎo)致病原體的分解，已在3.2.1節(jié)進(jìn)行系統(tǒng)性總結(jié)，這里不作贅述。

3.4 誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性

果蔬植物具有先天免疫系統(tǒng)，可識(shí)別并響應(yīng)病原菌的存在，但如果該響應(yīng)效果不足，植物就可能被植物病原菌侵害，加速病變腐敗。某些拮抗酵母菌能夠強(qiáng)化植物宿主對病原菌的響應(yīng)，誘導(dǎo)宿主通過一系列的超敏反應(yīng)（hypersensitivity reactions，HR）生成與致病相關(guān)的蛋白（pathogenesis-related protein，PR）、裂解酶、抗氧化酶和植物抗毒素等物質(zhì)抑制植物病原菌的生長繁殖，減少果蔬的真菌病變，從而提高食品質(zhì)量[80]。例如，在喜橄欖假絲酵母菌的刺激下，果蔬宿主組織中致病相關(guān)蛋白（PR-8）的表達(dá)顯著上調(diào)，分泌產(chǎn)生了更多的PR-8蛋白，增強(qiáng)了宿主對灰霉病菌的抗性[81]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，即使是失活的酵母菌也可以上調(diào)宿主PR蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，刺激PR蛋白的分泌，抑制擴(kuò)展青霉在宿主上的繁殖[82]。顯然，PR蛋白在宿主抗病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，但是酵母菌細(xì)胞如何介導(dǎo)宿主調(diào)控PR蛋白相關(guān)基因的分子機(jī)制尚未可知。

除PR蛋白外，拮抗酵母菌也可誘導(dǎo)宿主提高多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等多種抗氧化酶的活性，增強(qiáng)宿主對由植物病原菌感染而引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的抗性[83]。此外，一些酵母菌可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生植物抗毒素，從而抑制植物病原體的污染。例如，擬南芥經(jīng)過釀酒酵母菌處理后，產(chǎn)生大量植物抗毒素Camalexin，顯著提高了擬南芥對由丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）和灰葡萄孢引起的灰霉病菌的抗性[84]。然而，許多植物抗毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)尚未確定。液相色譜-質(zhì)譜分析和全基因組分析等多種技術(shù)的結(jié)合可能有助于發(fā)現(xiàn)更多的植物抗毒素，闡明植物抗毒素的合成途徑，更好地解析植物抗毒素對宿主抗性的誘導(dǎo)機(jī)制。

綜上，盡管大量的研究已經(jīng)證明了拮抗酵母菌可以通過誘發(fā)宿主產(chǎn)生對植物病原體的抗性從而實(shí)現(xiàn)抗菌效果，但兩者間的劑量關(guān)系尚不明確。此外，宿主在酵母菌刺激下的抗性形成機(jī)制難以從分子水平解析。未來可結(jié)合蛋白組學(xué)及基因工程技術(shù)進(jìn)一步研究。

4 酵母菌微膠囊搭載抗菌劑

拮抗酵母菌的抗菌效率通常較低且抗菌譜相對較窄，難以滿足特定應(yīng)用場景下對快速、高效且廣譜抗菌功能的需求。通過真空高壓或化學(xué)水解法去除酵母菌內(nèi)部的細(xì)胞器，可使之成為其他化學(xué)抗菌劑的天然載體，將其與不同種化學(xué)抗菌劑結(jié)合即可重新賦予酵母菌顆?？咕钚訹85]。相較于其他藥物遞送載體，酵母菌及其衍生微粒具有大小可控、成本低的優(yōu)點(diǎn)。此外，酵母菌外壁中的β-1,3-D-葡萄糖可與有害微生物細(xì)胞上的Dectin-1受體（C型凝集素受體）進(jìn)行特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)靶向抗菌，提高抗菌效率[86]。本文根據(jù)酵母菌微膠囊所搭載的化學(xué)抗菌劑種類分以下3 個(gè)方面討論。

4.1 酵母菌搭載氯基抗菌劑

常見的氯基抗菌劑有次氯酸鈉（NaClO）、次氯酸（HClO）以及鹵胺類。因其具有高效廣譜的殺菌特性而被廣泛應(yīng)用于食品加工環(huán)節(jié)。然而氯基抗菌劑穩(wěn)定性較差，在熱或光照條件下容易水解從而失去抗菌活性[87]。將氯基抗菌劑載入酵母菌微膠囊可有效提高其抗菌功能穩(wěn)定性。例如，將一種鹵胺聚合物（即氯化后的聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI））封裝于酵母菌微膠囊中，鹵胺聚合物中具有抗菌功能的有效氯通過蛋白質(zhì)之間的傳質(zhì)作用緩慢擴(kuò)散至酵母菌微膠囊外壁，當(dāng)有害微生物與其接觸后迅速失活，在5 min內(nèi)即可殺死5 種典型的細(xì)菌和真菌。另一方面，大量搭載有效氯的PEI被包裹在酵母菌的有限細(xì)胞空間內(nèi)，可有效減少鹵胺鍵的水解，在水溶液中存放28 d后，活性氯含量未見降低[88]。由此可見，將酵母菌作為載藥微膠囊可有效提高氯基抗菌劑的抗菌速率并提高其抗菌功能的穩(wěn)定性。然而，酵母菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)可能被高濃度的活性氯破壞，造成酵母菌微膠囊的結(jié)構(gòu)裂解。因此，此后的研究應(yīng)注重酵母菌微膠囊中氯基抗菌劑的載藥率，以期在實(shí)現(xiàn)高效穩(wěn)定殺菌功能的同時(shí)保證酵母菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。

4.2 酵母菌搭載抗菌光敏劑

抗菌光敏劑通常具有共軛化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過吸收特定波長的光源，將光敏分子從基態(tài)激發(fā)至激發(fā)態(tài)后，再與氧氣和水分反應(yīng)生成多種具有抗菌活性的活性氧（reactive oxygen species，ROS），從而實(shí)現(xiàn)抗菌功能[89]。由于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，抗菌光敏劑通常在水環(huán)境中的溶解度有限且與有害微生物間的親和性較差，導(dǎo)致抗菌效率較低[90]。因此，將光敏劑包裹在酵母菌微膠囊中，可提高抗菌顆粒整體的親水性及與有害微生物間的親和性，實(shí)現(xiàn)抗菌效率的提高。例如，姜黃素作為一種天然光敏抗菌劑，將其封裝在酵母菌微膠囊中，在紫外光照射30 min后，可殺死約99%生物被膜狀態(tài)下的單核細(xì)胞增生李斯特菌。而未封裝的姜黃素在相同條件下，細(xì)菌數(shù)量未見顯著變化[91]。值得注意的是，封裝后的光敏劑必須從酵母菌微膠囊中釋放并暴露在特定波長光源后才能產(chǎn)生抗菌功能的ROS。過快釋放可能導(dǎo)致大量光敏劑聚集在一起，短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的大量ROS相互猝滅，抗菌效率降低；而釋放速率過慢可能只造成有害微生物的可逆損傷而非徹底殺滅。因此，實(shí)現(xiàn)光敏劑從酵母菌微膠囊體系中的可控釋放是提高其抗菌效果的關(guān)鍵。

4.3 酵母菌搭載抗菌精油

相較于氯基及光敏抗菌劑，抗菌精油可從天然植物中提取，相對毒性較低，可作為添加劑應(yīng)用在食品中[92]。然而抗菌精油因穩(wěn)定性差、揮發(fā)性和氣味性強(qiáng)和有效劑量濃度高等問題限制了其應(yīng)用范圍。將抗菌精油搭載在酵母菌微膠囊中，可有效保護(hù)精油成分、遮掩氣味且通過靶向遞送提高目標(biāo)范圍內(nèi)的精油濃度，在不影響食品質(zhì)地的前提下，實(shí)現(xiàn)高效穩(wěn)定且持久的抗菌效果。例如，Liu Shanshan等[93]將Manuka抗菌精油（Manuka essential oil，MEO）封裝于酵母菌微膠囊后，可顯著提高精油的熱穩(wěn)定性及抗菌效率。在70 ℃下處理30 min后，封裝后的MEO保留率達(dá)65%。而在相同處理?xiàng)l件下，未封裝的MEO保留率僅為22%。此外，在化學(xué)需氧量為1 000 mg/L的條件下，封裝后的MEO對芽孢桿菌的抗菌效率遠(yuǎn)高于未封裝組。這是由于酵母菌微膠囊可保護(hù)抗菌精油免于環(huán)境中有機(jī)污染物的非特異性消耗而提高精油的抗菌效率。

抗菌精油是一種小分子混合物，其抗菌效果可能是多種活性成分共同作用的結(jié)果。在利用酵母菌封裝抗菌精油時(shí)，不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的小分子與酵母菌微膠囊間的相互作用強(qiáng)度不同，可能導(dǎo)致緩釋速度差異，使得協(xié)同抗菌的效率降低。因此，之后的研究應(yīng)傾向于各種抗菌精油成分與酵母菌膠囊之間相互作用的定量化研究，并通過調(diào)整各抗菌成分的配比，實(shí)現(xiàn)抗菌精油的協(xié)同抗菌效果最大化。

5 結(jié) 語

致腐和致病的微生物污染食品可能會(huì)影響食品質(zhì)量，造成食品安全隱患。利用某些酵母菌的拮抗作用或者載藥功能可以抑制有害微生物在果蔬等食品基質(zhì)中的生長繁殖，提高食品質(zhì)量并保障食品安全。近年來，開發(fā)與酵母菌相關(guān)的抗菌制劑已經(jīng)成為有害微生物防控領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，從拮抗作用及載藥抗菌兩個(gè)方面，系統(tǒng)性地歸納總結(jié)酵母菌的抗菌功能。在拮抗作用方面，從拮抗酵母菌的種類、篩選方法、與其他抗菌技術(shù)的聯(lián)合抗菌效果及其拮抗機(jī)制多個(gè)角度，總結(jié)與拮抗酵母菌相關(guān)的生防劑開發(fā)存在的主要問題及改進(jìn)方向；在載藥抗菌方面，分析酵母菌作為天然藥物載體與多種化學(xué)抗菌劑組合的優(yōu)勢及局限性。

未來針對酵母菌抗菌功能的研究展望：第一，結(jié)合體外和體內(nèi)酵母菌篩選方法的優(yōu)勢，提高拮抗酵母菌的篩選效率。首先通過體外篩選的方法，針對同一敏感菌同時(shí)篩選多種潛在拮抗酵母菌，從其中選擇拮抗效果最佳的酵母菌株，再利用真實(shí)食品基質(zhì)進(jìn)行二次體內(nèi)篩選，考察拮抗效果的同時(shí)評估拮抗酵母菌對食品基質(zhì)的影響，提高拮抗酵母菌篩選效率。第二，從分子水平探討拮抗酵母菌的作用機(jī)制。目前酵母菌拮抗機(jī)制的研究多止步于對所分泌的鐵載體、裂解酶等抗菌化合物的檢測，但在其產(chǎn)生過程中，酵母菌分子水平上的代謝機(jī)制尚不清晰。此外，不同種酵母菌在分子水平上的拮抗機(jī)制不盡相同，系統(tǒng)性地總結(jié)和歸納拮抗酵母菌在分子水平上的最新研究動(dòng)態(tài)，能夠進(jìn)一步揭示拮抗酵母菌的拮抗機(jī)制并為基因工程改性高活性拮抗酵母菌提供科學(xué)參考。第三，實(shí)現(xiàn)載藥酵母菌微膠囊的可控釋放。首先定量評估酵母菌微膠囊與所搭載的化學(xué)抗菌劑兩者間的相互作用，在此基礎(chǔ)上通過對酵母菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行物化改性，實(shí)現(xiàn)載藥酵母菌微膠囊的可控釋放從而提高抗菌效率。以希望實(shí)現(xiàn)利用酵母菌及其衍生物的抗菌功能提高食品質(zhì)量，保障食品安全。