線粒體活性氧在氟化鈉誘導(dǎo)PC12細(xì)胞NF-κB/NLRP3信號通路活化中的作用

陳德良,張 磊,付長其,舒 適,王國文,彭 巍*

(1.光山縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 動(dòng)物檢疫監(jiān)督所,河南 信陽 465450;2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院 鄭州市動(dòng)物營養(yǎng)代謝病與中毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450000;3.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海 西寧 810000)

氟可隨多種途徑進(jìn)入機(jī)體中,對神經(jīng)、生殖、免疫以及消化系統(tǒng)等造成明顯的毒性損傷[1]。研究發(fā)現(xiàn),氟具有明顯的神經(jīng)毒性,它能破壞血腦屏障,促進(jìn)氟在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的蓄積,引起炎性級聯(lián)反應(yīng)和誘導(dǎo)神經(jīng)元以及膠質(zhì)細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致退行性疾病的發(fā)生[2]。PC12細(xì)胞可傳代且經(jīng)誘導(dǎo)分化后具備神經(jīng)細(xì)胞的特性,被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的體外研究[3]。

目前有關(guān)氟毒性損傷的機(jī)制主要包括:氧化應(yīng)激和凋亡基因表達(dá)等[4]。最新研究表明,細(xì)胞焦亡與氟暴露引起的細(xì)胞損傷密切相關(guān)。過量的氟會(huì)導(dǎo)致核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族含熱蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3(NLR family pyrin domain containing 3,NLRP3)炎癥小體的活化,使胱天蛋白酶1(Caspase-1)被剪切,最終引起細(xì)胞焦亡[5]。然而,NLRP3活化是否參與氟化鈉(NaF)致PC12細(xì)胞損傷及其作用機(jī)制尚未完全清楚。因此,本研究以PC12細(xì)胞為研究對象,通過不同方法來探究氟致神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用及其潛在機(jī)制,為氟暴露引起神經(jīng)毒性損傷的臨床治療提供相應(yīng)的參考靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、抗體和試劑大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株(PC12細(xì)胞)由中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫提供;NaF、Mito-TEMPO、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)購自于美國Sigma-Aldrich公司;細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12購自于美國Hyclone公司;胎牛血清(FBS)、青鏈霉素購自美國Gibco公司;NLRP3 siRNA和陰性對照siRNA(NC siRNA)購自于上海吉瑪公司;Lip3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司;MitoSOX活性氧探針購自美國ThermoFisher公司;CCK-8試劑購自日本同仁公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒購自上海碧云天公司;大鼠白介素1β(IL-1β)和IL-18 ELISA檢測試劑盒購自武漢elabscience公司;含pyrin結(jié)構(gòu)域NLRP3抗體、核因子κB p65(NF-κB p65)抗體、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)抗體、核纖層蛋白(LAMIN B)抗體購自于英國Abcam公司;Caspase-1 p20購自武漢亞科因公司;磷酸化IκB激酶β(p-iKKβ)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、山羊抗兔熒光二抗、辣根過氧化物標(biāo)記的二抗購自江蘇Affinity公司。

1.2 主要儀器CO2培養(yǎng)箱和超低溫冰箱(美國Thermo公司);EPOCH酶標(biāo)儀(美國BioTek公司);蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司);化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(上海Tanon科技有限公司);冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及處理將細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)液(10%的FBS、100 mg/L鏈霉素、1×105U/L青霉素)放于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞的融合率達(dá)到80%左右時(shí)對細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞按照每孔1×106個(gè)接種于6孔板上,待細(xì)胞生長至約70%融合時(shí),參照Lip3000操作說明將NLRP3 siRNA和NC siRNA轉(zhuǎn)至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。NLRP3 siRNA的序列為:5′-ggauagguuugcugggau-att-3′,NC siRNA的序列為:5′-uucuccgaacgugucac-gutt-3′。為研究NaF對PC12細(xì)胞NLRP3炎性小體的影響,細(xì)胞在轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA后,按照文獻(xiàn)[6]報(bào)道,用質(zhì)量濃度為80 mg/L的NaF繼續(xù)處理細(xì)胞24 h,分為NC siRNA組(對照組)、NC siRNA+NaF組、NLRP3 siRNA組、NLRP3 siRNA+NaF組;為研究NF-κB通路在NaF致NLRP3活化中的作用,細(xì)胞提前用濃度為50 μmol/L的PDTC處理1 h,之后用質(zhì)量濃度為80 mg/L的NaF繼續(xù)處理細(xì)胞24 h,分為對照組、NaF組和NaF+PDTC組;為研究線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,mtROS)對NF-κB/NLRP3通路的影響,提前給予500 μmol/L mito-TEMPO預(yù)處理2 h,之后用質(zhì)量濃度為80 mg/L的NaF繼續(xù)處理細(xì)胞12 h,分為對照組、mito-TEMPO組、NaF組和mito-TEMPO+NaF組。

1.4 CCK-8檢測每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞,在處理結(jié)束后每孔中加入10 μL的CCK-8溶液,避光孵育2 h后與450 nm波長條件下測定吸光度(D)值。細(xì)胞存活率(%)=(D樣品孔值-D本底值)/(D對照組值-D空白孔值)×100%。

1.5 LDH檢測將細(xì)胞按照1×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,待細(xì)胞處理結(jié)束后收集上清,根據(jù) LDH 檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作,測定D值,計(jì)算LDH含量。

1.6 ELISA檢測將細(xì)胞按照1×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,待細(xì)胞處理結(jié)束,按照ELISA試劑盒說明書檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-1β和IL-18的分泌水平。

1.7 mtROS檢測將細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待處理結(jié)束,棄掉原有培養(yǎng)液,在每孔里面加入 1 mL的MitoSOX工作液(5 μmol/L),37℃條件下避光孵育 15 min;用不含血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基輕洗3遍,胰酶消化收集細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.8 免疫熒光處理結(jié)束后加入4%的多聚甲醛進(jìn)行室溫固定,20 min后用PBS清洗,加入Triton X-100透化液透化,1%的BSA室溫封閉1 h,加入一抗(1∶100)置于4℃搖晃孵育過夜,最后加入熒光二抗(1∶200),37℃避光孵育1 h。DAPI染色液避光染色5 min后置于熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.9 Western blot檢測按照核蛋白提取說明書將處理好的細(xì)胞進(jìn)行核蛋白的提取。細(xì)胞總蛋白則是將處理完成后的細(xì)胞用含有磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液,放置于冰上裂解20 min,之后于4℃,12 000 r/min條件下離心10 min,收集上清。樣品通過BCA法測定蛋白濃度,將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟后進(jìn)行一抗4℃過夜孵育,一抗的稀釋比例分別為NLRP3(1∶1 000)、Caspase-1 p20(1∶1 000)、p-iKKβ(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)、LAMIN B(1∶5 000)。一抗孵育完成后用洗滌液進(jìn)行清洗,二抗在室溫條件下進(jìn)行孵育1 h(1∶1 000),ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影。采集到的圖像使用Image J軟件對灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 NLRP3 siRNA降低了NaF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞NLRP3炎性小體活化如圖1A、B所示,與對照組比較,NLRP3 siRNA組細(xì)胞中NLRP3蛋白水平顯著降低(P<0.01);NaF組細(xì)胞中NLRP3和Cas-pase-1 p20的蛋白表達(dá)水平明顯升高,較對照組差異顯著(P<0.01);與NaF組比較,NLRP3 siRNA+NaF組細(xì)胞中NLRP3和Caspase-1 p20蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)。與NaF組比較,NLRP3 siRNA干預(yù)降低了NaF處理PC12細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-18和IL-1β的含量(P<0.01)(圖1C)。

2.2 NLRP3 siRNA減弱了NaF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性損傷如圖2A、B所示,與對照組比較,NaF組細(xì)胞的存活率顯著降低,LDH漏出率升高,差異顯著(P<0.01);與NaF組比較,NLRP3 siRNA+NaF組細(xì)胞的存活率升高,LDH漏出率則明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A.細(xì)胞存活率;B.LDH活性

2.3 PDTC減弱了NaF誘導(dǎo)的NF-κB通路活化如圖3所示,與對照組比較,NaF處理后細(xì)胞中p-NF-κB p65和p-iKKβ水平升高(P<0.01);與NaF組比較,PDTC+NaF組細(xì)胞中p-NF-κB p65和p-iKKβ蛋白水平降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A.免疫印跡;B.蛋白表達(dá)

2.4 PDTC減弱了NaF誘導(dǎo)的NF-κB p65入核NaF處理后細(xì)胞核中的NF-κB p65水平與對照組比較顯著增加(P<0.01),而PDTC干預(yù)抑制了NaF暴露引起的NF-κB p65入核(P<0.01)(圖4A～C)。

A.免疫熒光測定NF-κB p65入核;B.Western blot檢測細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá);C.蛋白表達(dá)

2.5 PDTC減弱了NaF誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化如圖5A、B所示,與NaF處理組比較,PDTC+NaF組細(xì)胞中NLPR3和Caspase-1 p20蛋白表達(dá)水平降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);PDTC+NaF組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-18和IL-1β的含量較NaF單獨(dú)處理組也明顯降低(P<0.01)(圖5C)。

A、B.NLRP3和Caspase-1 p20蛋白表達(dá);C.細(xì)胞上清中IL-1β和IL-18含量

2.6 Mito-TEMPO減弱了NaF誘導(dǎo)的mtROS水平升高如圖6所示,與對照組比較,NaF組細(xì)胞中的mtROS水平顯著升高(P<0.01);加入Mito-TEMPO減弱了NaF暴露引起的mtROS水平升高,較NaF組比較有顯著性差異(P<0.01)。

圖6 Mito-TEMPO對NaF處理PC12細(xì)胞mtROS水平的影響

2.7 Mito-TEMPO減弱了NaF引起的NF-κB/NLRP3信號通路活化如圖7A、B所示,與NaF組比較,mito-TEMPO+NaF組中p-NF-κB p65、p-iKKβ和NLRP3蛋白水平降低(P<0.01)。此外,mito-TEMPO+NaF組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-18和IL-1β的含量較NaF處理組明顯降低(P<0.01)(圖7C)。

A、B.p-NF-κB p65、iKKβ和NLRP3蛋白表達(dá);C.細(xì)胞上清中IL-1β和IL-18含量;Ⅰ.對照組;Ⅱ.Mito-TEMPO組;Ⅲ.NaF組;Ⅳ.Mito-TEMPO+NaF組

3 討論

氟會(huì)通過多種途徑進(jìn)入機(jī)體并在體內(nèi)累積。近年來的研究揭示氟會(huì)透過血腦屏障,因此有關(guān)氟神經(jīng)毒性受到越來越多關(guān)注[7]。進(jìn)一步深入探究氟致大腦神經(jīng)元的毒性作用對于氟神經(jīng)毒性的闡明有著重要的意義。細(xì)胞焦亡作為一種新的細(xì)胞死亡方式,有研究指出氟對細(xì)胞毒性損傷與其誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡有關(guān)[8]。NLRP3炎癥小體在細(xì)胞焦亡中起至關(guān)重要的作用,NLRP3炎癥小體激活后誘導(dǎo)Caspase-1活化,進(jìn)而促進(jìn)IL-18和IL-1β前體的成熟與釋放[9]。本研究的結(jié)果進(jìn)一步表明,NLRP3 siRNA抑制了NaF誘導(dǎo)的NLRP3和Caspase-1活化,細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18的分泌水平顯著降低。NaF導(dǎo)致的細(xì)胞存活率降低隨著NLRP3 siRNA的干預(yù)得到明顯改善。此外,PC12細(xì)胞中LDH的釋放水平顯著增加,進(jìn)一步說明NaF處理后會(huì)對細(xì)胞膜的完整性造成破壞,而抑制NLRP3減輕了LDH的釋放。這些研究結(jié)果證實(shí)了NLRP3炎癥小體的活化參與了NaF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷。

NF-κB是氟致細(xì)胞損傷過程中的關(guān)鍵因子[10-11]。生理狀況下,NF-κB在胞質(zhì)中處于未活化的狀態(tài)。當(dāng)受到外界刺激時(shí)會(huì)引起NF-κB p65和iKKβ蛋白的磷酸化,從而引起NF-κB的活化,激活下游基因的轉(zhuǎn)錄[12-13]。本研究結(jié)果表明,NF-κB抑制劑PDTC能夠降低NaF暴露PC12細(xì)胞中p-NF-κB p65、p-iKKβ、NLRP3、Caspase-1 p20蛋白水平,NaF誘導(dǎo)的NF-κB p65入核也被PDTC抑制。此外,細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的IL-18和IL-1β水平明顯降低。這些結(jié)果提示活化的NF-κB信號參與了NLRP3炎癥小體的激活。

ROS的過量生成是NaF致機(jī)體損傷的重要因素[14]。線粒體是細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的主要來源,且mtROS的過量生成與NLRP3炎癥小體的激活密切相關(guān),特別是在NF-κB信號通路的活化方面發(fā)揮重要作用[15-17]。本研究的結(jié)果表明,NaF暴露能夠誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中mtROS的產(chǎn)生,而mtROS抑制劑mito-TEMPO的使用抑制了mtROS的生成。此外,清除過量的mtROS可以減弱NaF誘導(dǎo)的p-NF-κB p65、iKKβ、NLRP3蛋白水平的升高,IL-1β和IL-18的分泌水平也明顯降低。這些研究結(jié)果表明mtROS在NF-κB/NLRP3通路活化中的作用。我們發(fā)現(xiàn)抑制mtROS并不能夠完全清除NaF對NF-κB/NLRP3信號的影響。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase4,NOX4)也參與ROS的調(diào)控[18]。最新研究發(fā)現(xiàn),NaF暴露引起的ROS水平升高與NOX4表達(dá)水平升高有關(guān)[19]。那么NOX4/ROS在NaF致PC12細(xì)胞NF-κB/NLRP3通路活化中的作用需要未來進(jìn)一步的研究。

綜上所述,NaF暴露誘導(dǎo)PC12細(xì)胞產(chǎn)生大量的mtROS,mtROS促進(jìn)NF-κB通路的活化繼而激活NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。本研究補(bǔ)充完善了氟致神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制研究,進(jìn)一步為氟中毒的防治提供理論基礎(chǔ)。