夾脊電針通過TLR4/NF-κB 信號(hào)通路干預(yù)神經(jīng)根型頸椎病大鼠炎癥機(jī)制的研究*

王智元 鄭曉涵 楊旭霞 王文韜 謝 希 張?bào)阌?高 曦

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

頸椎病是一種以頸椎椎間盤退變?yōu)橹饕虏∫蛩氐募膊?，臨床上可出現(xiàn)頸背僵硬、疼痛、上肢放射性疼痛等伴隨癥狀。按照其累及的周圍組織結(jié)構(gòu)不同，將其分為神經(jīng)根型、頸型、脊髓型、交感神經(jīng)型和椎動(dòng)脈型5種類型［1］，其中神經(jīng)根型占比最高［2］。中醫(yī)對(duì)于神經(jīng)根型頸椎?。–SR）的治療方法有針灸、推拿、針刀、中藥內(nèi)服與外用等，其中電針療法在臨床較為常見?，F(xiàn)代研究已經(jīng)證實(shí)了電針對(duì)CSR 能夠起到緩解疼痛，消除或減輕增生物壓迫造成的炎癥、水腫，改善頸椎周圍微循環(huán)等作用［3］，但目前對(duì)于夾脊電針治療CSR 的作用機(jī)制研究較少。本實(shí)驗(yàn)研究以CSR大鼠為研究對(duì)象，探討夾脊電針對(duì)其的作用效應(yīng)和消炎機(jī)制，以期為夾脊電針治療CSR的臨床運(yùn)用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～7 周齡的SD 雄性大鼠，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量300～350 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（黑）2021-010。動(dòng)物在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，溫度（22±2）℃，濕度50%左右，12 h 循環(huán)照明，自由飲食攝水。實(shí)驗(yàn)過程遵照動(dòng)物的使用及倫理學(xué)相關(guān)規(guī)定［4］。

1.2 試藥與儀器

阿莫西林膠囊（通藥制藥集團(tuán)股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：221222）、大鼠白介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）、大鼠白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）、大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）、TLR4 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)bs-1021R）、NF-κB p65 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)bs-20159R）、TRAF6 抗體（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號(hào)FNab08921）、兔抗GAPDH 抗體［生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號(hào)D110016］、HRP 山羊抗兔IgG（H+L）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)SA00001-2）。DNM-9602 酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）、一次性無(wú)菌針灸針（長(zhǎng)春愛康醫(yī)療器械有限公司）、KWD-808Ⅰ型脈沖針灸治療儀（常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司）、TS-2000A多用脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、EPS300數(shù)顯穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海天能科技有限公司）、VM-300S 漩渦混勻儀（群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、VE-60 微型垂直槽多板灌膠器（上海天能科技有限公司）、ICEN-24R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（杭州奧盛儀器有限公司）、MDB100C 金屬浴（群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、DHP9162電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）。

1.3 分組與造模

將75 只SD 大鼠隨機(jī)分為5 組：空白對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、針刺組和電針組，每組15 只。用化學(xué)誘導(dǎo)法［5］對(duì)模型組、針刺組和電針組構(gòu)建CSR模型，假手術(shù)組不進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)僅手術(shù)。1）麻醉與固定：大鼠經(jīng)腹腔注射麻醉后俯臥位（選用戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射）固定于操作臺(tái)上，頸前部墊5 mL 注射器，以使頸椎后突便于操作。2）準(zhǔn)備：致炎物選擇在0.5%甲醛中浸泡24 h的定量濾紙片（1 mm×1 mm）。去除頸背部毛發(fā)，碘伏消毒（以T1～T2正中切口為中心消毒周圍4～5 cm），然后鋪蓋無(wú)菌洞巾，顯露T1～T2正中區(qū)域（T2為大鼠頸部第2 個(gè)高突點(diǎn)）。3）手術(shù)：以T1～T2正中切口，沿著棘突縱行切開皮膚和皮下組織（逐層切開），切口約2 cm，用手術(shù)刀鈍性分離棘突兩側(cè)肌肉，拉鉤拉開肌肉，鈍性分離暴露棘突和右側(cè)椎板，然后用顯微持針鉗咬去T1椎板，顯露出右側(cè)C8神經(jīng)根，仔細(xì)分離神經(jīng)根和周圍組織（務(wù)必不能損傷神經(jīng)），然后將甲醛濾紙片放在暴露的神經(jīng)根腋下。假手術(shù)組僅顯露C8神經(jīng)根，而不放置甲醛濾紙片。逐層縫合，關(guān)閉切口，縫合中在切口均勻涂抹阿莫西林膠囊。最終術(shù)中死亡2 只，術(shù)后死亡3只，每組取12只。

1.4 干預(yù)方法

模型成功后，從第3 天開始各組大鼠予以干預(yù)。假手術(shù)組、模型組予捆綁15 min，每日1 次，持續(xù)10 d。針刺組俯臥位捆綁大鼠后，針刺部位消毒，使用一次性無(wú)菌針灸針針刺大鼠C7～T13 對(duì)頸夾脊穴，穴位定位參照大鼠穴位圖譜［6］，得氣后留針15 min，每日1次，持續(xù)10 d。電針組俯臥位捆綁大鼠后，取C7～T13 對(duì)頸夾脊穴，電針正負(fù)極左右交替聯(lián)，疏密波，頻率5 Hz，電流強(qiáng)度2.5 mA（以大鼠頸肌及前肢輕度抖動(dòng)為度），每日1次，每次15 min，持續(xù)10 d?？瞻捉M不予干預(yù)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 步態(tài)評(píng)分 結(jié)合Kawakami 與Dubuisson 法對(duì)大鼠由疼痛攣縮造成的步態(tài)障礙進(jìn)行評(píng)估。從造模前1 d起每日評(píng)定，正常步態(tài)、足無(wú)畸形計(jì)為1分；受損傷足輕觸玻璃臺(tái)面、不持重或輕微持重、走時(shí)跛行或足內(nèi)收蜷縮畸形計(jì)為2分；走動(dòng)時(shí)不著臺(tái)面計(jì)為3分。

1.5.2 抓桿法評(píng)定 手持一根一次性筷子，使其平行于地面并位于距地面0.5 m處。抓取大鼠，將大鼠雙前爪置于桿上，令其充分抓握后使其懸吊于桿上，用秒表記錄大鼠雙前肢的抓桿時(shí)間。另外，將雙前肢抓握能力相近者計(jì)為1 分；右前肢能抓握但抓握能力明顯弱于左前肢者計(jì)為2分；右前肢無(wú)法抓握者計(jì)為3分。從造模前1 d起每日評(píng)定。

1.5.3 ELISA 法檢測(cè)血清IL-1β、IL-6、TNF-α 含量大鼠經(jīng)腹腔注射麻醉后仰臥位（選用戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射）固定于操作臺(tái)上，先自腹部動(dòng)脈取血，而后取C8神經(jīng)根。將血液靜置2 h 后進(jìn)行離心，抽取上層血清，用ELISA法檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，嚴(yán)格參照說明書進(jìn)行，于450 nm 波長(zhǎng)下讀取光密度（OD）值，根據(jù)OD值計(jì)算上述檢測(cè)因子含量。

1.5.4 Western blotting 法檢測(cè)神經(jīng)根組織中的TLR4、TRAF6、NF-κB-p65 蛋白表達(dá)水平 取大鼠神經(jīng)根組織，加入蛋白提取劑（RIPA 裂解緩沖液∶PMSF 蛋白酶抑制劑=100∶1）抽提神經(jīng)根組織總蛋白，4 ℃離心機(jī)10 000 r/min 離心10 min，取上清液，BCA 法測(cè)定上清液總蛋白濃度，加入含溴酚藍(lán)染料的上樣緩沖液和RIPA 裂解緩沖液將總蛋白濃度調(diào)整至6 mg/mL，而后100 ℃金屬浴加熱變性5 min。用10%的SDSPAGE 電泳分離蛋白，而后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDE 膜上。用5%的脫脂牛奶在搖床上室溫封閉2 h，加入TLR4、TRAF6、NF-κB-p65 一抗（1∶1 000）在4 ℃冰箱中過夜，TBST 洗膜5 次，每次8 min。用HRP 標(biāo)記的二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，再次洗膜。將ECL 工作液均勻的滴加在膜上，避光孵育1 min，使用化學(xué)發(fā)光圖像處理系統(tǒng)掃膜，將蛋白條帶圖像保存下來。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism9.5.1 軟件。計(jì)量資料均以（±s）表示，多組間比較符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，組間差異比較采用Tukey's 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 模型評(píng)價(jià)

見表1、表2。造模3 d 后模型組、針刺組和電針組大鼠表現(xiàn)出倦臥少動(dòng)等特征。造模后模型組、針刺組及電針組大鼠步態(tài)評(píng)分和大鼠抓桿評(píng)分相近（P＞0.05）。與空白組大鼠相比，模型組、針刺組和電針組大鼠的步態(tài)和抓桿評(píng)分受到較大影響（P＜0.01），而假手術(shù)組由于僅用顯微持針鉗咬去T1椎板，顯露出右側(cè)C8神經(jīng)根，未進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)，故相較于模型組、針刺組及電針組，對(duì)大鼠步態(tài)和抓桿評(píng)分影響較?。≒＞0.05）。

表1 各組大鼠步態(tài)評(píng)分比較（分，±s）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05；與針刺組比較，△P ＜0.05。下同。

干預(yù)后1.00±0.00 1.08±0.28 2.33±0.48 1.63±0.58#1.13±0.34#△組 別空白組假手術(shù)組模型組針刺組電針組n 12 12 12 12 12造模后1.00±0.00 1.17±0.38 2.50±0.51**2.59±0.50**2.67±0.48**

表2 各組大鼠抓桿評(píng)分比較（分，±s）

表2 各組大鼠抓桿評(píng)分比較（分，±s）

組 別空白組假手術(shù)組模型組針刺組電針組n 12 12 12 12 12造模后1.00±0.00 1.21±0.41 2.58±0.50**2.67±0.48**2.63±0.49**干預(yù)后1.00±0.00 1.04±0.20 2.17±0.48 1.58±0.50#1.17±0.38#△

2.2 各組大鼠步態(tài)評(píng)分比較

見表1。干預(yù)結(jié)束后模型組、針刺組和電針組的步態(tài)情況均有所好轉(zhuǎn)（P＜0.05）。相較于模型組，經(jīng)過干預(yù)后針刺組及電針組干預(yù)后大鼠步態(tài)顯著好轉(zhuǎn)（P＜0.05），且電針組大鼠步態(tài)好轉(zhuǎn)情況更明顯（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠抓桿評(píng)分比較

見表2。干預(yù)結(jié)束后模型組、針刺組和電針組的大鼠抓桿情況均有所好轉(zhuǎn)（P＜0.05）。相較于模型組，經(jīng)過干預(yù)后針刺組及電針組干預(yù)后大鼠抓桿情況顯著好轉(zhuǎn)（P＜0.05），且電針組大鼠抓桿情況好轉(zhuǎn)情況更明顯（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較

見表3。與空白組比較，假手術(shù)組大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量升高不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，針刺組和電針組大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量均降低（P＜0.05）；相較于針刺組，電針組大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

注：與假手術(shù)組比較，▲P ＜0.01。

組 別空白組假手術(shù)組模型組針刺組電針組TNF-α 204.35±56.33 211.39±46.78 384.91±17.09▲303.88±42.05#239.09±40.39#△n 12 12 12 12 12 IL-1β 25.79±3.75 28.92±3.83 47.02±4.19▲41.07±2.30#34.72±3.29#△IL-6 86.89±12.27 89.09±10.59 128.86±15.01▲111.82±13.07#95.09±6.0281#△

2.5 各組大鼠神經(jīng)根組織TLR4、TRAF6、NF-κB p65蛋白表達(dá)比較

見圖1。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)根組織TLR4、TRAF6、NF-κB p65 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，針刺組和電針組大鼠神經(jīng)根組織TLR4、TRAF6、NF-κB p65 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01），且相較于針刺組，電針組大鼠神經(jīng)根組織TLR4、TRAF6、NF-κB p65 蛋白表達(dá)降低更明顯（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠神經(jīng)根組織TLR4、NF-κB p65、TRAF6 p65蛋白表達(dá)

3 討 論

目前醫(yī)學(xué)上對(duì)CSR 的病理機(jī)制雖然并未完全明確，但認(rèn)為其主要與機(jī)械性壓迫、炎性因子浸潤(rùn)或損傷對(duì)神經(jīng)根的刺激以及疼痛等傷害性信息的傳導(dǎo)密切相關(guān)［7］。王小云等［8］研究表明，椎間盤或神經(jīng)根出現(xiàn)局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致一氧化氮、白介素等炎性因子的浸潤(rùn)或損傷對(duì)神經(jīng)根的刺激則是神經(jīng)根產(chǎn)生疼痛進(jìn)而引起肩臂痛的主要原因之一，但并未對(duì)炎性因子增多的機(jī)制進(jìn)行探索。Tsukasa Onozawa 等［9］研究表明，在神經(jīng)根受到損傷的過程中炎癥因子產(chǎn)生的多種化學(xué)物質(zhì)使中樞神經(jīng)接受了大量傷害性信息，導(dǎo)致其敏感性增高，也是神經(jīng)根疼痛的病因之一，但此研究并未涉及其相關(guān)炎癥通路。因此積極探索與之相關(guān)的炎癥通路與發(fā)生機(jī)制及高效的治療方法，對(duì)臨床治療CSR 具有重要意義。

電針是指針刺得氣后，在針上通以微弱的連續(xù)波或斷續(xù)波，從而起到刺激穴位、治愈病癥的目的?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用其治療局部炎性改變。任祥等［10］的研究已經(jīng)證實(shí)了電針對(duì)CSR 能夠起到緩解疼痛，消除或減輕增生物壓迫造成的炎癥、水腫，改善頸椎周圍微循環(huán)等作用。夾脊穴位于椎棘突下，后正中線旁開0.5 寸，刺激穴位有調(diào)節(jié)自主神經(jīng)的作用。在臨床常用于緩解疼痛。王勇等［11］的研究表明針刺夾脊穴在臨床上能有效緩解CSR 患者的癥狀和體征，明顯減輕CSR 患者的疼痛，但并未將其與電針相結(jié)合。本研究將電針與夾脊穴相結(jié)合，以期為臨床提供新的思路。

現(xiàn)代研究證明TLR4/NF-κB 信號(hào)通路是免疫應(yīng)答中起重要作用的炎癥信號(hào)通路之一［12］。有研究［13］表明游離脂肪酸可以通過直接與TLR4 結(jié)合來激活髓樣分化因子88（MyD88）依賴性途徑，然后通過MyD88 和IL-1 受體相關(guān)激酶（IRAK）激活NF-κB，使NF-κB p65進(jìn)入細(xì)胞核并轉(zhuǎn)錄激活下游炎癥因子IL-6，觸發(fā)免疫炎癥反應(yīng)。TRAF6是一種重要的NF-κB調(diào)節(jié)因素［14］，可以通過自身的泛素化修飾活化kappa B 抑制因子激酶（IKK）激酶轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激酶1（TAK1），TAK1 則可與TAB3 結(jié)合進(jìn)而激活NF-κB 通路。TNF-α 為炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)因子，生理狀態(tài)下有助于增強(qiáng)免疫力和抑制腫瘤生長(zhǎng)，但過度表達(dá)時(shí)可增大和加重炎癥反應(yīng)，引起多種病理?yè)p傷［15］。在CSR 發(fā)展期TNF-α 的含量與椎間盤的退變和疼痛呈正相關(guān)，TNF-α 能誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的活化，活化調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)，增加炎癥細(xì)胞的活性及聚集性［16］。且IL-1β也可以與IFN-γ 結(jié)合來驅(qū)動(dòng)IL-6 的產(chǎn)生，促進(jìn)機(jī)體免疫炎癥進(jìn)程［17］。所以通過抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，減少IL-1β、IL-6、TNF-α 的產(chǎn)生與表達(dá)是緩解CSR炎性反應(yīng)的重要機(jī)制。

本研究顯示，使用夾脊電針干預(yù)可以顯著改善CSR 大鼠的步態(tài)和抓桿情況，抑制了TLR4、TRAF6、NF-κB p65的蛋白表達(dá)，降低了IL-1β、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生，緩解了CSR 大鼠的疼痛。研究將普通針刺組作為陽(yáng)性對(duì)照，顯示電針與普通針刺的作用機(jī)制相似，但電針對(duì)TLR4、TRAF6、NF-κB p65 的蛋白表達(dá)的抑制和對(duì)IL-1β、IL-6、TNF-α 的降低更明顯。研究設(shè)置假手術(shù)組，以排除造模對(duì)大鼠傷害對(duì)TLR4、TRAF6、NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TNF-α的影響。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示夾脊電針可以改善CSR 模型大鼠的步態(tài)和抓桿情況，緩解了CSR 模型大鼠的疼痛，且抑炎作用明顯。夾脊電針減少IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá)，并抑制TLR4/NF-KB 信號(hào)通路是緩解CSR炎性反應(yīng)的關(guān)鍵機(jī)制之一。由于本研究?jī)H集中于單一途徑與部分靶點(diǎn)，缺乏統(tǒng)一聯(lián)系，限制了實(shí)驗(yàn)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。在后續(xù)研究中，需要通過更多實(shí)驗(yàn)從其他新途徑與新靶點(diǎn)進(jìn)一步揭示夾脊電針治療CSR的相關(guān)機(jī)制；同時(shí)通過大樣本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)比研究不同取穴標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于CSR 療效的影響，以期為臨床提供更多幫助。