羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及發(fā)酵產物抗氧化活性研究

劉倩，李 正，歐佳琪，黃 文，2，王 益，劉 瑩，2*

（1 華中農業(yè)大學食品科學技術學院 武漢430070 2 果蔬加工與品質調控湖北省重點實驗室 武漢 430070）

羊肚菌（Morchella esculenta）作為一種珍貴的藥食兩用真菌，其性質平和、味甘寒、沒有毒性[1]。羊肚菌中含有多糖、多酚等多種活性成分，具有防止氧化、抵御腫瘤生長、緩解疲勞等作用[2]。目前對羊肚菌活性成分的研究中，羊肚菌多糖作為含量最為豐富的物質被廣泛研究[3]，而對羊肚菌多酚的研究較少，且主要集中在羊肚菌子實體[4]或菌絲體[5]中多酚的提取工藝。

液體發(fā)酵技術就是在反應器中模擬自然界的環(huán)境[6]，向其中加入供菌種生長繁殖的營養(yǎng)物質，通過攪拌或振蕩等手段調節(jié)外部條件，使菌體在反應器中生長繁殖，獲得目標物質[7]。這種方法不僅可以提高菌絲體及其發(fā)酵產物的產量，還可以保證產品品質的標準化[8]。優(yōu)化液體發(fā)酵的方法可以從培養(yǎng)基添加物質、發(fā)酵條件等方面入手，使目標產物含量提高[9]。目前有關于羊肚菌液體發(fā)酵的相關報道中，有通過優(yōu)化發(fā)酵條件提高發(fā)酵液中多糖含量的研究，如Meng 等[10]通過優(yōu)化羊肚菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基以及工藝參數(shù)，得到發(fā)酵液的胞外多糖含量為（2 913±265）mg/L。Li 等[11]以羊肚菌胞外多糖含量為指標，利用豆腐渣發(fā)酵羊肚菌，最終得到多糖含量為（95.82±1.37）mg/g。此外，也有研究測定發(fā)酵產物中的多酚含量，如金紅等[12]測定金針菇等8 種食用菌發(fā)酵液中的總酚含量，結果發(fā)現(xiàn)，總酚含量最高的是金針菇，可達5.07 mg/100 mL，然而目前未見通過優(yōu)化羊肚菌液體發(fā)酵條件提高發(fā)酵液中多酚含量的相關報道。

針對羊肚菌發(fā)酵液中多酚含量較低的問題，本研究通過單因素實驗和Box-Behnken 響應面法優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無機鹽添加量，提高發(fā)酵產物中的多酚含量，并測定所得發(fā)酵產物的抗氧化活性，為羊肚菌發(fā)酵液中多酚的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肚菌株為M4M26 梯棱羊肚菌，保存于CYM 培養(yǎng)基上，來自華中農業(yè)大學應用真菌研究所；土豆淀粉（食品級），河北古松農副產品有限公司；大豆蛋白、乳清粉、蛋黃粉、食品級葡萄糖、蔗糖均為食品級，河南萬邦實業(yè)有限公司；黃豆粉（食品級），曲靖市晨駿商貿有限公司；紫薯粉（食品級），廣州福正東海食品有限公司。

試劑：蛋白胨、酵母浸粉均為分析級，安琪酵母股份有限公司；福林酚（分析級），上海源葉生物科技有限公司；瓊脂（分析級），廣州賽國生物科技有限公司；沒食子酸（分析級），阿拉丁生化科技股份有限公司；MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、葡萄糖、無水碳酸鈉、甲醇均為分析級，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1550 酶標儀，Thermo scientific 公司；SW-CJ-2FDG 超凈工作臺，萊特（南通）有限公司；HZQF160 全溫振蕩搖床，蘇州培英實驗設備有限公司；LGJ-10 真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羊肚菌種子液的制備及處理 CYM 培養(yǎng)基：蛋白胨2 g、酵母浸粉2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO40.6 g、K2HPO4·3H2O 1 g、葡萄糖22 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 自然，121 ℃高溫、高壓滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨2 g、酵母浸粉2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO40.6 g、K2HPO4·3H2O 1 g、葡萄糖22 g，蒸餾水1 L，121 ℃高溫、高壓滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：食品級葡萄糖2 g，大豆蛋白1 g，KH2PO40.5 g，加蒸餾水至100 mL，在高壓滅菌鍋內121 ℃，30 min 滅菌后備用。

將保存于試管中的M4M26 梯棱羊肚菌（以下簡稱羊肚菌）接種至CYM 平板上，待菌絲體生長5 d 后，取直徑1 cm 的菌塊24 個，接入種子培養(yǎng)基中，置于全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，設置轉速為120 r/min，溫度25 ℃。搖瓶振蕩4 d 后取出，在超凈工作臺上將種子培養(yǎng)基和菌球進行勻漿，制成羊肚菌種子液，按10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。

將發(fā)酵完成的羊肚菌發(fā)酵液勻漿后，在80 ℃水浴鍋中加熱30 min，使菌絲體中的活性物質浸出后，離心、過濾得到澄清的羊肚菌發(fā)酵液，濃縮后凍干獲得粉末狀樣品，用于后續(xù)測定。

1.3.2 單因素實驗

1）碳源單因素實驗 以土豆淀粉、紫薯粉、蔗糖代替1.3.1 節(jié)中發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，其它添加物質與1.3.1 節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基保持一致。試驗條件：溫度25 ℃、搖床轉速120 r/min、發(fā)酵7 d，以多酚含量為指標確定最佳碳源。對最佳碳源的添加量進行單因素實驗。

2）氮源單因素實驗 在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎上選用黃豆粉、乳清粉、蛋黃粉代替大豆蛋白作為氮源，其它成分保持不變。試驗條件與1.3.2（1）節(jié)一致。之后對最佳氮源添加量進行單因素實驗。

3）無機鹽單因素實驗 趙航軻等[13]的研究表明，在選取的8 種無機鹽中，以KH2PO4為唯一無機鹽時得到的菌絲體最多。本試驗直接選用KH2PO4作為無機鹽供給，對其添加量進行單因素實驗，試驗條件與1.3.2（1）節(jié)一致，以多酚含量為指標確定最優(yōu)添加量。

4）響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基 基于單因素實驗篩選的各種添加物，用Design-Expert 12軟件，以發(fā)酵后的多酚含量作為優(yōu)化指標進行條件優(yōu)化。響應面試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.3 多酚含量的測定方法及表示 采用Folin-Ciocalteus 法測定多酚含量[14]，在10 mL 離心管中加入1 mL 待測樣品，5 mL 蒸餾水，3 mL 的7.5%碳酸鈉溶和1 mL 福林酚試劑，在室溫避光處反應2 h，取200 μL 加入96 孔板中，用酶標儀于765 nm 波長下測定吸光度，以沒食子酸（0，5，10，15，25，30 μg/mL）為對照品繪制標準曲線。

本節(jié)試驗中待測樣品為羊肚菌菌絲體發(fā)酵液經冷凍干燥后得到的固體粉末，用蒸餾水配制成0.50 mg/mL 的待測溶液。發(fā)酵液中多酚含量計算公式如下：

式中，X——發(fā)酵液中的多酚含量（mg/mL）；ρ——以樣品反應體系吸光度及沒食子酸標準曲線計算得出（mg/mL）；c——待測樣品的溶液質量濃度，0.50 mg/mL；m——發(fā)酵液凍干粉的質量（mg）；V——發(fā)酵液體積（mL）。

1.3.4 抗氧化活性的測定方法

1）DPPH 自由基清除率的測定方法 參考Zeng 等[15]的方法并加以調整。用甲醇溶解DPPH配成0.2 mmol/L 的溶液（使用時配制），避光放置。以酶標孔為反應容器，取一定濃度的樣液100 μL于酶標孔中，加等量的DPPH 溶液，充分混合，室溫下避光靜置反應10 min，在517 nm 波長處測定吸光值Ai。用甲醇代替DPPH 溶液測得吸光值為Aj，用蒸餾水代替樣品測得吸光值為A0。清除率計算公式如下：

2）ABTS 自由基清除率測定方法

①ABTS 溶液的配制 配制7.0 mmol/L ABTS 溶液和140.0 mmol/L K2S2O8溶液，分別取5 mL 和88 μL 完全混勻，避光保存14 h。試驗前用蒸餾水稀釋，734 nm 波長處的吸光度在0.698～0.702 之間即可使用。

②試驗方法 以酶標孔為反應容器，吸取一定濃度的樣液20 μL 于酶標孔中，加入180 μL ABTS 自由基溶液，室溫避光反應10 min，在734 nm 波長處測定其吸光度值Ai。用蒸餾水代替ABTS 自由基溶液測得吸光度值Aj，用蒸餾水代替樣品測得吸光度值A0。清除率計算公式同1.3.4節(jié)。

3）羥自由基清除率的測定方法 參考Nicholas 等[16]的方法并加以調整。以酶標孔為反應容器，吸取一定濃度的樣液50 μL 于酶標孔中，依次加入FeSO4溶液（9.0 mmol/L）和水楊酸乙醇溶液（9.0 mmol/L）50 μL，完全混勻后加入50 μL H2O2（8.8 mmol/L）溶液，37 ℃反應60 min。反應結束后在510 nm 波長處測定其吸光度值Ai。用蒸餾水代替H2O2溶液測得吸光度值Aj，用蒸餾水代替樣品測得吸光度值A0。清除率計算公式同1.3.4節(jié)。

4）FRAP 鐵離子還原能力的測定

①FRAP 工作液的配制 將0.3 mol/L 醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH=3.6），0.01 mol/L TPTZ 溶液和0.02 mol/L FeCl3溶液分別取10，1，1 mL，混合均勻，開始使用時配制。其中TPTZ 用0.04 mol/L 鹽酸溶解，兩者充分混合。

②制作標準曲線 以酶標孔為反應容器，在其中加入10 μL 不同濃度的FeSO4溶液，再加入190 μL FRAP 工作液，在37 ℃反應15 min。結束后在593 nm 波長處測吸光度值Ai。用蒸餾水代替FRAP 工作液測得吸光度值Aj，用蒸餾水代替樣品測得吸光度值A0。以Ai-A0-Aj值為縱坐標，對應的FeSO4溶液濃度為橫坐標作圖。

③測定FRAP 值 按照制作標準曲線的方法，將FeSO4溶液換成發(fā)酵液樣品，其余操作一致，得到Ai-A0-Aj值，將其帶入標準曲線中，確定相應的FeSO4濃度，即FRAP 值。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 培養(yǎng)基碳源和氮源種類對多酚含量的影響

從圖1 可看出，不同碳源和氮源對發(fā)酵液中多酚含量的影響差異顯著，其中最佳碳源為土豆淀粉，最佳氮源為大豆蛋白。因此，選取這兩種物質作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和氮源。

圖1 不同碳源（a）、氮源（b）、無機鹽（c）種類對發(fā)酵液中多酚含量的影響Fig.1 Effects of different carbon（a），nitrogen（b）and inorganic salt（c）species on polyphenol content in fermentation broth

據(jù)王瑩[17]的研究結果，淀粉作為碳源時所得菌絲體生物量最少，僅為葡萄糖的2/3；劉華晶等[18]的研究也證明了這一點。而本試驗以土豆淀粉為碳源時，得到的發(fā)酵液中多酚含量最高。推測是菌絲發(fā)酵過程中，如果菌絲體的生物量超過一定限度，就會開始利用多酚，從而使發(fā)酵產物中多酚含量減少[19]。

李文靜[20]對羊肚菌深層發(fā)酵培養(yǎng)基的研究表明，羊肚菌在無機氮源中的生物量不如在有機氮源中的生物量高。趙航軻等[13]研究表明將有機氮源黃豆粉添加至發(fā)酵培養(yǎng)基時，得到的菌絲體生物量最多。而本試驗中，用大豆蛋白作為氮源時，發(fā)酵液中多酚含量最高，分析大豆蛋白和黃豆粉的成分，大豆蛋白中蛋白質含量可達90%以上，分解后有利于菌絲體合成蛋白質和核酸[21-22]，可以供給菌絲體生長足夠的營養(yǎng)，有利于菌絲體發(fā)酵產物的生成。

2.1.2 各物質添加量對多酚含量的影響 由圖2a可知，隨著土豆淀粉添加量的增加，發(fā)酵液中的多酚含量呈先增加后降低的趨勢，且土豆淀粉添加量為0.5%時，發(fā)酵液中多酚含量達到最大值。土豆淀粉添加量在0～0.25%時，發(fā)酵液中多酚含量增長緩慢，而添加量0.25%～0.5%時迅速增加，說明當土豆淀粉添加量小于0.25%時，土豆淀粉作為碳源，不足以提供羊肚菌菌絲體生長發(fā)育所需營養(yǎng)，不利于發(fā)酵產物的積累。隨著土豆淀粉添加量的增大，羊肚菌菌絲體生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質逐漸充足，使其發(fā)酵產物的多酚含量達到最大值。然而，當土豆淀粉添加量繼續(xù)增大時，菌絲體的生長發(fā)育迅速增長，當土豆淀粉供給的營養(yǎng)不足以支撐菌絲體生長發(fā)育所需時，便開始消耗發(fā)酵液中的多酚，使其含量大幅度下降。最終選擇土豆淀粉添加量為0.5%。

圖2 培養(yǎng)基各物質添加量和發(fā)酵液中多酚含量的關系Fig.2 The relationship between the added amount of each substance in the medium and the content of polyphenols

由圖2b 可知，隨著大豆蛋白添加量的增加，發(fā)酵液中的多酚含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當大豆蛋白添加量為4%時，發(fā)酵液中多酚含量達到最大值。大豆蛋白添加量在1%～4%時，發(fā)酵液中多酚含量不斷增大，添加量4%～8%時逐漸降低，說明其添加量小于4%時，隨著供給羊肚菌菌絲體生長發(fā)育的營養(yǎng)的增加，其發(fā)酵產物多酚含量達到最大值。而在發(fā)酵培養(yǎng)基水溶液保持100 mL 不變時，大豆蛋白添加量越多，發(fā)酵培養(yǎng)基溶液的黏稠度越大，在同樣搖床轉速下，培養(yǎng)基的振蕩幅度相對減小，不利于氣體的流動，溶解氧減少[23-24]，使菌絲體生長緩慢，不利于發(fā)酵產物的生成，因此發(fā)酵液中多酚含量開始下降。最終選擇大豆蛋白添加量為4%。

由圖2c 可知，增大KH2PO4的添加量，發(fā)酵液中的多酚含量先增多后減少，當KH2PO4添加量為0.25%時，多酚含量達到最大值。KH2PO4添加量在0～0.25% 時，多酚含量不斷增加，這是因為無機鹽在液體發(fā)酵過程中起到調節(jié)滲透壓和氧化-還原電位的作用，添加少量的無機鹽可促進菌絲體和發(fā)酵產物的生成[25-26]。然而繼續(xù)增加無機鹽濃度，可能使培養(yǎng)基濃度過高，從而抑制菌絲體的生長[18]。最終選擇KH2PO4的添加量為0.25%。

2.2 響應面法分析優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基提高發(fā)酵液中多酚含量

響應面試驗設計是通過對上述單因素實驗中的3 個因素：土豆淀粉添加量、大豆蛋白添加量和磷酸二氫鉀添加量，進行排列組合得出，見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.1 模型建立和顯著性分析結果 使用軟件對表2 進行擬合，結果見表3。回歸方程為：

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

多酚含量=1.04+0.0124A+0.0170B-0.1137C-0.0675AB +0.0034AC +0.0511BC -0.2185A2-0.2210B2-0.2388C2，回歸模型的方差分析見表3。

由表3 可看出，模型的P=0.0351〈0.05（顯著），失擬項檢驗的P=0.9395（不顯著），R2=0.8448，其中R2用于反映回歸方程對響應值的擬合效果[27]，意味著此次模擬可以解釋84.48%的情況，表明模型充分擬合試驗數(shù)據(jù)[28]。該方程是發(fā)酵液中多酚含量與培養(yǎng)基各物質添加量適合的數(shù)學模型，可利用其確定提高發(fā)酵液中多酚含量的培養(yǎng)基物質添加量。在試驗范圍，不同因素對發(fā)酵液中多酚含量的影響排序為C〉B〉A，即KH2PO4〉大豆蛋白〉土豆淀粉添加量。

2.2.2 響應面結果分析 響應面的3D 圖形是響應值對各因素所構成的三維空間曲面圖，可看出各因素水平的最優(yōu)解及其之間的影響[29]。曲面越陡，表明該因素對響應值的影響越大[30]。從圖3 可看出，KH2PO4添加量的響應面坡面比較陡峭，說明其對多酚含量影響較大，而土豆淀粉和大豆蛋白的響應面坡面較平緩，說明其對發(fā)酵液中多酚含量的影響不是很大，這與表3 的回歸分析結果一致。

圖3 兩因素交互作用對多酚含量的響應面Fig.3 Response surface of two-factor interaction on polyphenol content

2.2.3 最佳工藝驗證 通過軟件分析得到最優(yōu)結果為土豆淀粉0.5%、大豆蛋白4%、磷酸二氫鉀0.3%，在此條件下由公式計算出的多酚含量理論值為1.06 mg/mL。以最優(yōu)結果為基礎，進行3 組驗證試驗，3 組發(fā)酵液中多酚平均含量為1.02 mg/mL，測定結果與理論值的相對誤差為3.3%，表明試驗結果合理、可靠。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH 自由基清除能力 由圖4 可看出，在1～5 mg/mL 范圍內，發(fā)酵液對DPPH 自由基的清除效果與濃度變化一致，基本呈直線，表明發(fā)酵液對DPPH 自由基有很好的清除作用。根據(jù)擬合得到的線性方程計算發(fā)酵液的IC50=1.83 mg/mL，與李文靜[20]得到的羊肚菌發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的IC50（約6 mg/mL）相比，本樣品的DPPH 自由基清除效果更好。

圖4 VC 和發(fā)酵液樣品對DPPH 自由基的清除作用Fig.4 The scavenging effect of VC and fermentation broth samples on DPPH

2.3.2 ABTS 自由基清除能力 由圖5 可以看出，隨著發(fā)酵液濃度的增大，對ABTS 自由基的清除效果變好，當質量濃度大于10 mg/mL 時，清除效果沒有明顯變化，維持在60%左右，達到清除極限。根據(jù)擬合曲線計算得到的IC50=4.81 mg/mL，相比于猴頭菌發(fā)酵液[31]的IC50=68 mg/mL，羊肚菌發(fā)酵液的ABTS 自由基清除率效果優(yōu)于此猴頭菌發(fā)酵液。

2.3.3 羥自由基清除能力 從圖6 可以看出，VC和發(fā)酵液質量濃度與其對羥自由基清除能力的變化一致。計算VC 的IC50=0.1 mg/mL，而發(fā)酵液質量濃度為3 mg/mL，對羥自由基的清除能力達80%左右，且不再有明顯升高，達到清除極限。計算其IC50=0.78 mg/mL，是維生素C 的70%左右，表明羊肚菌發(fā)酵液具有較強的羥自由基清除效果。

2.3.4 FRAP 鐵離子還原能力分析 由圖7 可以看出，隨著發(fā)酵液濃度的升高，對鐵離子的還原能力也升高，發(fā)酵液質量濃度達15 mg/mL 時，F(xiàn)RAP值基本保持在0.8 左右，到達飽和。相比李文靜[20]的羊肚菌發(fā)酵液質量濃度25 mg/mL 時的FRAP值0.75，本試驗得到的發(fā)酵液效果更好。

圖7 VC 和發(fā)酵液樣品對鐵離子還原能力的測定Fig.7 The scavenging effect of VC and fermentation broth samples on FRAP

3 結論

本研究通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加物質及其添加量來調控羊肚菌發(fā)酵液中的多酚含量，是從發(fā)酵源頭進行調控，便于工廠生產，且發(fā)酵原料來源廣泛、價格便宜，無毒性，得到的多酚更加安全。在單因素實驗的基礎上，通過響應面法分析得出培養(yǎng)基各物質的最佳添加量，其中土豆淀粉0.5%、大豆蛋白4%、磷酸二氫鉀0.3%。對最佳條件下得到的羊肚菌發(fā)酵液進行活性測定，發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗氧化活性，符合多酚具有較好抗氧化活性的特征。其多酚結構還有待進一步研究。