基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與動物實(shí)驗(yàn)探究肉蓯蓉總苷對炎癥性腸病的作用機(jī)制

閆文杰，馮 朵，2，張紹時(shí)，周士琦

（1 北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100023 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所 北京 100081）

炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）是一種特殊的、病因尚不明確的慢性腸道炎癥性疾病，包括兩種亞型：克羅恩?。–rohn's Disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）[1]。截止2017 年，全球有680 萬人被診斷患有IBD，全球發(fā)病率和患病率逐年增加，北美、西歐IBD 患病率較高[2-3]。1990—2019 年中國IBD 發(fā)病率從1.45/10 萬上升到3.62/10 萬，總體上升幅度為149.66%；死亡率從0.47/10 萬下降至0.33/10萬，總體下降幅度為29.79%[4]。隨著中國人口老齡化，老年患者高發(fā)病率的小幅增加會對醫(yī)療衛(wèi)生保健系統(tǒng)造成巨大的負(fù)擔(dān)。

有研究證明，飲食調(diào)節(jié)有助于減輕IBD 患者的腹痛或腹瀉等癥狀，減輕其并發(fā)癥；還可調(diào)節(jié)腸道微生物組成和功能，影響腸道穩(wěn)態(tài)，維持腸道平常功能[5]。肉蓯蓉作為一種具有悠久歷史的食藥同源植物，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中被廣泛應(yīng)用于腸道疾病的治療，也被認(rèn)為具有多種保健功效，因此在保健食品領(lǐng)域備受關(guān)注[6-7]。2020 年，肉蓯蓉（荒漠）被列為食藥同源物質(zhì)，開展生產(chǎn)經(jīng)營試點(diǎn)工作[6-7]。肉蓯蓉作為食品，在日常生活中可起到預(yù)防IBD 的作用；作為藥材食用，可在IBD 治療過程中起到緩解病癥的作用，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)荒漠肉蓯蓉水提物能刺激免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)免疫活性，預(yù)防炎癥性腸病[8]。Jia 等[9]發(fā)現(xiàn)從肉蓯蓉中提取到的松果菊苷（Echinacoside，ECH）可改善DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎；ECH 可通過刺激腸上皮細(xì)胞增殖、上調(diào)TGF-β 來預(yù)防細(xì)胞死亡并改善黏膜組織修復(fù)作用[10]。ECH 還可通過抑制mTOR/STAT3 通路表達(dá)水平，緩解LPS 誘導(dǎo)的大鼠腸上皮細(xì)胞凋亡和炎癥[11]。此外，毛蕊花糖苷可作為機(jī)體自由基清除劑，減緩2，4-二硝基苯酸（2，4-Dinitrobenzene sulfonic acid，DNBS）誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎進(jìn)展，減少組織損傷[12]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門綜合了生物信息學(xué)、生物化學(xué)、藥理學(xué)和計(jì)算科學(xué)等多個領(lǐng)域的交叉學(xué)科，其利用大數(shù)據(jù)、生物信息學(xué)和計(jì)算工具，分析和模擬生物體內(nèi)的復(fù)雜藥物代謝、作用機(jī)制和藥效預(yù)測，為新藥研發(fā)和現(xiàn)有藥物的優(yōu)化提供了重要支持[13-14]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的核心是建立藥物與生物體內(nèi)分子之間的網(wǎng)絡(luò)模型，以揭示藥物與靶標(biāo)蛋白、代謝途徑、細(xì)胞信號通路等之間的相互關(guān)系[15]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將繼續(xù)在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，為改善患者的生活質(zhì)量和健康做出貢獻(xiàn)。

有研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉總苷能夠有效抑制LPS 誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[16]，具有抑制肝癌進(jìn)展[17]、保肝護(hù)肝[18]、改善記憶認(rèn)知[19-20]、抗衰老[21]等作用。目前，肉蓯蓉總苷對炎癥性腸病的作用還鮮有研究報(bào)道。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與動物實(shí)驗(yàn)探究肉蓯蓉總苷對炎癥性腸病的作用機(jī)制，為其治療IBD 的臨床應(yīng)用提供新的方法和思路。

1 材料與儀器

1.1 試劑

葡聚糖硫酸鈉（DSS，相對分子量36 000～50 000），美國MP 公司；尿糞隱血測試盒，南京建成生物工程研究所；無水乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二甲苯，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；PBS 緩沖液、RNA 提取液、第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增的預(yù)混合溶液、RTQPCR 引物，武漢賽維爾生物科技有限公司；無菌無酶水，美國HyClone 公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

KZ-Ⅲ-FP 型低溫研磨儀，武漢賽維爾生物科技有限公司；CT15RE 型高速離心機(jī)，日本HITACHI 公司；CFX 熒光定量PCR 儀，美國Bio-rad公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)，德國Thermo 公司；FBZ2001-up-p 標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀，青島富勒姆科技有限公司；INFINITE M NANO 型多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN 公司，UV-1600 型紫外分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 肉蓯蓉活性成分 在已有研究[7，22]的基礎(chǔ)上，選擇“Echinacoside”“Verbascoside”“Cistanoside A”“Tubuloside A”“Isoacteoside”“2-Acetylacteoside”“Tubuloside B”作為分析生物活性成分。通過Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）找 出上述7 種成分的三維化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，存為sdf 格式。

2.1.2 潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測與篩選 將活性成分的三維結(jié)構(gòu)文件分別導(dǎo)入PharmMapper 數(shù)據(jù)庫（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html），靶點(diǎn)物種選擇“human protein targets only”，其余選項(xiàng)保持默認(rèn)，得到不同成分對應(yīng)的相應(yīng)目標(biāo)靶點(diǎn)。采用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）獲取每個靶點(diǎn)對應(yīng)的蛋白名稱和基因名稱信息。將7 種成分對應(yīng)的目標(biāo)靶點(diǎn)合并。

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中（https：//www.genecards.org/），以“inflammatory bowel disease”為關(guān)鍵詞檢索與炎癥性腸病相關(guān)的基因，整理檢索結(jié)果。

2.1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein，Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用jvenn（https：//jvenn.toulouse.inrae.fr/app/example.html）在線繪制韋恩圖，獲取肉蓯蓉活性成分靶點(diǎn)和IBD 的靶點(diǎn)交集。將得到的交集靶點(diǎn)上傳到String 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 篩選分析。下載PPI 網(wǎng)絡(luò)的TSV 文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0，計(jì)算蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中度（degree）值，再依據(jù)degree 值大小對PPI 網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行美化。

2.1.4 基因本體（Gene Ontology，GO）功能富集和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析 使用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對 肉蓯蓉活性成分對IBD 發(fā)揮保護(hù)作用的靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析，再用DAVID 數(shù)據(jù)庫對肉蓯蓉活性成分對IBD 發(fā)揮保護(hù)作用的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析。

2.1.5 肉蓯蓉“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將肉蓯蓉的活性成分，肉蓯蓉活性成分與IBD 的交集靶點(diǎn)和KEGG 富集的通路構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

2.2 動物模型驗(yàn)證

2.2.1 動物模型建立 使用SPF 級雄性BALB/c小鼠（5～8 周，18～21 g），由北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品檢測中心提供【實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（京）2017-0038】，飼養(yǎng)于SPF 級動物房中，溫度（23±2）℃，相對濕度50%～70%，日光燈照射12 h 交替晝夜。動物實(shí)驗(yàn)方案均獲得北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品檢測中心動物實(shí)驗(yàn)室批準(zhǔn)。將20 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4 組，每組5 只。①對照組（CZ）：自由飲用無菌水，灌胃無菌水，連續(xù)7 d；②DSS 對照組（DZ）：自由飲用每日現(xiàn)配3%DSS 液，連續(xù)7 d；③肉蓯蓉總苷低劑量組（LZ）（藥液濃度：0.1 g/mL）：自由飲用每日現(xiàn)配3%DSS 液，灌胃藥液，連續(xù)7 d；④肉蓯蓉總苷高劑量組（HZ）（藥液濃度0.4 g/mL）：自由飲用每日現(xiàn)配3%DSS 液，灌胃藥液，連續(xù)7 d。連續(xù)造模7 d 后斷食12 h，頸椎脫臼處死。處死前4 h 腹腔注射雞紅細(xì)胞，處死后立即摘眼球收集血液，抽取腹腔積液后打開腹腔。測量結(jié)腸長度，取小鼠脾臟、派氏結(jié)等器官。

2.2.2 疾病活 動指數(shù)（Disease activity index，DAI）每日固定時(shí)間灌胃前稱小鼠體質(zhì)量，觀察小鼠精神狀態(tài)、糞便性狀，測定糞便隱血情況，并進(jìn)行相應(yīng)評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 DAI 評分表Table 1 Scoring criteria of DAI

DAI 評分=（體質(zhì)量評分+糞便性狀評分+糞便隱血評分）/3（1）

2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測免疫信號通路（qRT-PCR）檢測 收集小鼠脾臟，剪切成0.5 cm大小的組織塊，浸泡在組織RNA 穩(wěn)定保存液中存放。取出組織切塊，加入RNA 提取液并研磨粉碎，提取其總RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、PCR 擴(kuò)增，檢測小鼠脾臟中mTOR、TGF-β 兩個關(guān)鍵免疫信號通路激活情況。qRT-PCR 所用引物序列見表2。

表2 引物序列表Table 2 Primer sequence table

2.2.4 PICRUSt2 功能注釋 采用CTAB 或SDS方法提取樣品的小鼠糞便基因組DNA，之后用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA 純度和濃度。隨后取適量DNA 于離心管中，用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA 為模板，根據(jù)擴(kuò)增區(qū)域選擇使用帶barcode 的特異性引物、New England Biolabs 公司的含GC 緩沖液的高保真PCR 混合物和高效高保真酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

PCR 產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳再次檢測。對目的條帶使用Qiagen 公司提供的膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

根據(jù)16S rDNA 擴(kuò)增子測序結(jié)果，基于Greengene 數(shù)據(jù)庫中的ASV tree 和ASV 的基因信息，推斷它們共同祖先的基因功能譜。同時(shí)對Greengene 數(shù)據(jù)庫中其它未知物種的基因功能譜進(jìn)行推斷，構(gòu)建古菌和細(xì)菌域全譜系的基因功能預(yù)測譜。最后將測序得到的菌群組成映射到數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行菌群代謝功能預(yù)測。

3 結(jié)果與分析

3.1 肉蓯蓉總苷靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)分析

將活性成分的三維結(jié)構(gòu)文件分別導(dǎo)入PharmMapper 數(shù)據(jù)庫，得到不同成分對應(yīng)的相應(yīng)目標(biāo)靶點(diǎn)。采用UniProt 數(shù)據(jù)庫獲取每個靶點(diǎn)對應(yīng)的蛋白名稱和基因名稱信息。將7 種成分對應(yīng)的目標(biāo)靶點(diǎn)合并，共得到354 個靶點(diǎn)。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中，以“inflammatory bowel disease”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)的基因，整理檢索結(jié)果，最終獲得7 851 個靶點(diǎn)。使用jvenn 在線繪制韋恩圖獲取肉蓯蓉活性成分靶點(diǎn)和IBD 的靶點(diǎn)交集，如圖1 所示，得到肉蓯蓉活性成分對IBD 有防護(hù)作用的靶點(diǎn)254 個。

圖1 活性成分靶點(diǎn)與炎癥性腸?。↖BD）疾病靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of active ingredients targets and IBD targets

3.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的交集靶點(diǎn)上傳到String 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 篩選。如圖2 所示，不同顏色節(jié)點(diǎn)分別代表肉蓯蓉中的活性成分和IBD 相關(guān)靶點(diǎn)，邊代表活性成分和作用靶點(diǎn)相互作用關(guān)系，顏色越深代表其節(jié)點(diǎn)越重要。該網(wǎng)絡(luò)共包括227 個節(jié)點(diǎn)，這些節(jié)點(diǎn)相互作用產(chǎn)生917 個蛋白互作邊，平均度值為7.25。根據(jù)Cytoscape 3.8.0 插件CytoHubba 分析網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。如圖3 所示，排名前30 的核心靶點(diǎn)包含有PTK2、PIK3R1、JAK2、表皮生長因子受體（EGFR）、KDR、非受體酪氨酸激酶（SRC）、HSP90AA1、絲氨酸/酸酸激酶1（AKT1）、STAT1、PTPN11 等。

圖2 交集靶點(diǎn)蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI-network diagram of common targets

3.3 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫對肉蓯蓉活性成分對IBD 發(fā)揮保護(hù)作用的254 個靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析（P〈0.05），共獲得283 條生物過程（Biological process，BP）、79 條細(xì)胞組分（Cellular component，CC）、166 條分子功能（Molecular function，MF）數(shù)據(jù)，再利用微生信在線平臺（http：//bioinformatics.com.cn/login/）對Count 值排名靠前的10 位進(jìn)行富集分析。如圖4 所示，肉蓯蓉活性成分干預(yù)IBD 參與的BP 有信號傳導(dǎo)（Signal transduction）、蛋白質(zhì)磷酸化（Protein phosphorylation）、凋亡過程負(fù)調(diào)控（Negative regulation of apoptotic process）、RNA聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、蛋白質(zhì)水解（Proteolysis）、先天免疫反應(yīng)（Innate immune response）、細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)（Positive regulation of cell proliferation）、細(xì)胞分化（Cell differentiation）、DNA 模板的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控（Positive regulation of transcription DNA-templated）、細(xì)胞對外源性刺激的反應(yīng)（Response to xenobiotic stimulus）。CC 主要有胞液（Cytosol）、細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm）、核（Nucleus）、質(zhì)膜（Plasma membrane）、Extracellular exosome、Extracellular region、核漿（Nucleoplasm）、Extracellular space、薄膜（Membrane）、線粒體（Mitochondrion）。MF 主要有蛋白結(jié)合（Protein binding）、相同蛋白結(jié)合（Identical protein binding）、ATP 結(jié)合（ATP binding）、金屬離子結(jié)合（Metal ion binding）、鋅離子結(jié)合（Zinc ion binding）、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（Protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、酶結(jié)合（Enzyme binding）、蛋白質(zhì)同源二聚活性（Protein homodimerization activity）、蛋白激酶活性（Protein kinase activity）、蛋白酪氨酸激酶活性（Protein tyrosine kinase activity）。

圖4 GO 功能富集圖Fig.4 Enrichment analysis diagram of GO

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫對肉蓯蓉活性成分對IBD 發(fā)揮保護(hù)作用的254 個靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，共獲得161 條通路。將肉蓯蓉的活性成分，肉蓯蓉活性成分與IBD 的交集靶點(diǎn)和KEGG富集的通路構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。如圖5 所示，最左側(cè)是肉蓯蓉，左側(cè)第1 個圓圈為肉蓯蓉活性成分，右側(cè)圓圈為交集靶點(diǎn)對應(yīng)篩選出的富集通路，中間矩形部分是交集靶點(diǎn)。由該圖可以推測，肉蓯蓉活性成分可能通過作用于IL2、mTOR、ADH、CAS、SMAD、MAPK、NF-κB 等靶點(diǎn)來調(diào)控癌癥通路、mTOR 通路、TGF-β 通路、JAKSTAT 通路、AMPK 通路等，進(jìn)而影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)、增殖、分化、凋亡等。

3.4 肉蓯蓉總苷提高DSS 誘導(dǎo)的DAI 評分

試驗(yàn)結(jié)果表明，除CZ 組外，其余3 組均有不同程度的體質(zhì)量減輕和糞便隱血情況（圖6）。其中，DSS 對照組體質(zhì)量減輕率最高，糞便血情況最嚴(yán)重，DAI 最高，第6 天糞便出血明顯。經(jīng)肉蓯蓉總苷干預(yù)后，DAI 評分逐漸降低，隱血情況逐漸降低。HZ 組體質(zhì)量減輕率最低，糞便隱藏血量最低。結(jié)果表明肉蓯蓉總苷改善了炎癥性腸病引起的生理反應(yīng)。

圖6 肉蓯蓉總苷對小鼠DAI 評分的影響Fig.6 Effect of Total glycosides of Cistanche deserticola on the IBD score in mice

3.5 肉蓯蓉總苷下調(diào)IBD 小鼠脾臟中mTOR 和TGF-β 信號通路表達(dá)

mTOR 和TGF-β信號通路是激活炎癥反應(yīng)的兩個重要信號通路。通過qRT-PCR 檢測小鼠脾臟組織中mTOR 和TGF-β的表達(dá)，結(jié)果顯示：DSS 對照組小鼠中mTOR 和TGF-β的mRNA 表達(dá)量較正常小鼠顯著增加，與DSS 對照小鼠相比，肉蓯蓉干預(yù)后小鼠中mTOR 和TGF-β表達(dá)顯著降低。其中，高劑量組的下降幅度最為顯著，且表達(dá)水平與正常組基本一致（圖7）。結(jié)果表明，肉蓯蓉總苷下調(diào)了mTOR 和TGF-β信號通路的表達(dá)。

圖7 肉蓯蓉總苷對小鼠脾臟中和mTOR 和TGF-β mRNA 表達(dá)水平的影響Fig.7 Total glycosides of Cistanche deserticola downregulates the mRNA of TGF-β and mTOR signaling pathways in IBD mice

3.6 PICRUSt2 功能注釋分析

PICRUSt2 是一種基于生物16S rRNA 以及Greengene 數(shù)據(jù)庫中的ASV tree 和ASV 的基因信息進(jìn)行元基因組功能預(yù)測的生物信息工具。選用COG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能預(yù)測，結(jié)果顯示，腸道菌群功能主要涉及RNA 加工；染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)；細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分割；防御機(jī)制；信號細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/包膜生物發(fā)生；細(xì)胞外結(jié)構(gòu)；細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸；能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換；碳水化合物的運(yùn)輸和代謝等20 多種功能。選取豐度排名前15 的功能及它們在每個樣品中的豐度信息繪制熱圖（圖8），并從不同功能層面進(jìn)行聚類。與CZ 組相比，DZ 對照組小鼠的COG1132（ABCtype multidrug transport system）、COG0745（DNAbinding response regulator）、COG1131（ABC-type multidrug transport system）、COG1961（Site-specific DNA recombinase related to the DNA invertase Pin）、COG0438（Lycosyltransferase involved in cell wall bisynthesis）、COG0534（Na+-driven multidrug efflux pump）、COG0642（Signal transduction histidine kinase）、COG1595（DNA-directed RNA polymerase specialized sigma subunit）、COG0463（Endonuclease）、COG4974（Site-specific recombinase XerD）、COG2207（AraC-type DNAbinding domain and AraC-containing proteins）、COG1136（ABC-type lipoprotein export system）、COG1309（DNA-binding transcriptional regulator）功能基因表達(dá)異常。這些基因主要涉及：V：防御機(jī)制；T：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；M：細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/包膜生物生成；I：脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝；K：轉(zhuǎn)錄；L：復(fù)制、重組和修復(fù)。這六大功能給予肉蓯蓉總苷后，這些有差異的生理功能表達(dá)均向正常組接近。與CZ 和DZ 組小鼠對比，HZ 組小鼠的COG1028（Short-chain alcohol dehydrogenase family）、COG0451（Nucleoside-diphosphate-sugar epimerase）基因發(fā)生高表達(dá)，這兩個基因與I：脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝以及M：細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/包膜生物生成功能有著密切聯(lián)系，因此推測肉蓯蓉總苷可能通過調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)脂代謝、糖代謝過程及相關(guān)防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制過程來調(diào)控IBD 小鼠損傷。

圖8 PICRUSt2-功能豐度聚類熱圖Fig.8 Heatmap of the PICRUSt2-functional abundance clustering

4 討論

IBD 會導(dǎo)致腸道黏膜的慢性炎癥和潰瘍，現(xiàn)代西方醫(yī)學(xué)無法完全治愈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[23-25]。中醫(yī)認(rèn)為，調(diào)整飲食可以平衡體內(nèi)陰陽，有助于緩解腸道炎癥[26]。中醫(yī)飲食療法在炎癥性腸病的輔助治療中可以發(fā)揮積極作用。肉蓯蓉可作為輔助炎癥性腸病治療的傳統(tǒng)保健食品原料。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明，肉蓯蓉總苷成分對IBD 有防護(hù)作用的靶點(diǎn)254 個。GO 富集結(jié)果表明肉蓯蓉總苷干預(yù)IBD 可能與信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化、凋亡過程負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)水解、先天免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、DNA 模板的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、蛋白結(jié)合、ATP 結(jié)合、金屬離子結(jié)合、鋅離子結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、酶結(jié)合等生物過程及分子功能相關(guān)?；钚猿煞?靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析表明，肉蓯蓉的活性成分可能通 過作用 于IL2、mTOR、ADH、CAS、SMAD、AMPK、NF-κB 等靶點(diǎn)來調(diào)控癌癥通路、mTOR 通路、TGF-β 通路、JAK-STAT 通路、AMPK 通路等，進(jìn)而影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)、增殖、分化、凋亡等。

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，選用DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠模型模擬IBD 患者相似的臨床癥狀，對分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證?，F(xiàn)有研究表明TGF-β 在整個IBD 疾病的形成和發(fā)生過程中居于中心，TGF-β1的大量表達(dá)，會導(dǎo)致結(jié)腸的上皮損傷與異常的修復(fù)，肌成纖維細(xì)胞增生及基膜下纖維化，最終造成IBD 的發(fā)生[27]。mTOR 作為一類重要蛋白質(zhì)物質(zhì)，是細(xì)胞生長和增殖的中心調(diào)節(jié)因子[28-29]。mTOR 參與調(diào)節(jié)許多重要的細(xì)胞過程，包括翻譯、轉(zhuǎn)錄和自噬。其中，AMPK/mTOR 信號通路可以共同介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)合成代謝和分解代謝過程[30-31]。此外，AMPK/mTOR 通路也被證實(shí)是調(diào)控IBD 疾病的重要通路[32]。mTOR 是AMPK 重要的下游信號分子，在自噬調(diào)控中起負(fù)調(diào)控作用，TGF-β1 也可以通過調(diào)節(jié)mTOR 相關(guān)信號通路表達(dá)水平抑制自噬，并可通過介導(dǎo)SMADS 的信號通路間接地對細(xì)胞起到調(diào)控作用[31，33]。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)驗(yàn)證了mTOR 和TGF-β兩個信號通路基因的表達(dá)。結(jié)果表明，肉蓯蓉總苷能有效緩解患病小鼠體質(zhì)量減輕及糞便出血，降低DAI 評分，抑制脾臟中mTOR 和TGF-β 信號通路表達(dá)。通過對小鼠糞便的16S rDNA 擴(kuò)增子測序進(jìn)行PICRUSt2 基因功能注釋分析。結(jié)果表明，患病小鼠中 COG1132、COG0745、COG1131、COG1961、COG0438、COG0534、COG0642、COG1595、COG0463、COG4974、COG2207、COG1136、COG1309功能基因表達(dá)異常升高。給予肉蓯蓉總苷干預(yù)后13 種基因表達(dá)恢復(fù)正常，同時(shí)COG1028、COG0451 基因高表達(dá)。推測肉蓯蓉總苷可能通過調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)脂代謝、糖代謝過程及相關(guān)防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等機(jī)制過程來緩解IBD 小鼠損傷。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果基本相同。

綜上所述，肉蓯蓉總苷通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用治療炎癥性腸病。其作用靶點(diǎn)應(yīng)該與IL2、mTOR、TGF-β、JAK-STAT、NF-κB 等相關(guān)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肉蓯蓉總苷可能主要是通過抑制TGF-β、mTOR 兩個信號通路表達(dá)來治療炎癥性腸病。本實(shí)驗(yàn)為闡明肉蓯蓉治療IBD 的臨床應(yīng)用提供了新的方法，然而，其具體機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)還需更深入的研究。