化痰通絡湯改善腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)功能作用的研究

劉甜甜，馬春雷，劉付紅，郭平?

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250014；2.山東第一醫(yī)科大學，山東 濟南 250014；3.山東第一醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014）

缺血性腦卒中又稱腦梗死，是目前中老年人群常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率、致殘率、致死率居高不下，嚴重威脅人類生命和健康［1-2］。目前臨床治療缺血性腦卒中以溶栓、抗凝、抗血小板、降纖和血栓切除術(shù)等為主，從而恢復腦組織血流再灌注［3-4］。然而，由于腦部毛細血管致密，微血管內(nèi)細胞附壁及微血栓形成，與免疫炎癥反應密切關(guān)聯(lián)造成再灌注無復流現(xiàn)象，反而加劇了缺血性腦損傷［5-7］。再灌注后無復流是指通過多種方式實現(xiàn)大動脈再通后，局部組織仍得不到充分血液灌注的現(xiàn)象，這成為外科治療腦梗死，減輕中風后遺癥的重要障礙，重視改善再灌注后無復流現(xiàn)象是提高再灌注療效的重要方式［8］。

腦梗死屬中風病的范疇，缺血性中風病是由正氣虧虛、飲食不節(jié)、起居勞倦、情志內(nèi)傷等多種因素，產(chǎn)生風、火、痰、瘀等引起腦脈痹阻，臨床以猝然昏仆、不省人事、口歪言謇、半身不遂等為主要表現(xiàn)的病癥。其中，風、痰、瘀是影響缺血性中風的關(guān)鍵因素，治療宜以祛風化痰、活血通絡為基本治法。痰瘀互結(jié)因于津血同源，與血管內(nèi)皮損傷、血液黏度增加、過度凝血、神經(jīng)免疫炎癥反應關(guān)系密切［9-10］?；低ńj湯（Huatan Tongluo Decoction，HTTLD）具有熄風化痰、活血通絡的功效。本研究通過建立小鼠大腦中動脈缺血再灌注（MCAO/R）模型，探討化痰通絡湯對腦缺血再灌注損傷的治療作用及機制，以期為化痰通絡湯臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級小鼠購自北京維通利華實驗動物科技有限公司，許可證號：SCXK（京）2021-0006，品系C57BL/6J，雄性，8～12周齡，體質(zhì)量22～25 g。實驗單位使用許可證編號：SYXK（魯）20180009，小鼠在千佛山醫(yī)院動物研究中心SPF級條件飼養(yǎng)，室溫21～25 ℃，相對濕度40%～60%，自由進食飲水，自動光照系統(tǒng)模擬晝夜循環(huán)光照12 h/d。實驗中涉及動物處置的內(nèi)容均經(jīng)動物實驗倫理委員會審核并通過。

1.2 主要儀器

解剖顯微鏡（日本OLYMPUS，型號：SZX2-TR30）；MCAO/R線栓（深圳RWD）；全自動真空脫水機（德國徠卡，型號：APS200S）；生物組織包埋機（浙江科迪，型號：KD-BM/BL）；石蠟切片機（德國徠卡，型號：RM2235）；攤片烤片機（浙江科迪，型號：KD-P）；顯微鏡（日本OLYMPUS，型號：BX51T）；高速低溫組織研磨儀（武漢Servicebio）；高速冷凍離心機（德國eppendorf，型號：5424R）；酶標儀（美國Thermofisher Multiska）；蛋白電泳印記系統(tǒng)（美國伯樂，MINI）；冰凍切片機（德國徠卡，型號：CM1950）；倒置熒光顯微鏡（德國徠卡，型號：DMi8）。

1.3 主要試劑與藥物

2%TTC染液（Solarbio，批號：20220113）；蘇木素-伊紅染液（Servicebio，批號分別是ZH190905、ZH202812）；vWF多抗、Fibrinogen α鏈多抗、GP Ⅸ多抗、β-actin單抗（Proteintech，批號分別為27186-1-AP、20645-1-AP、14564-1-AP、66009-1-1 g）；Claudin-5多抗（Abcam，批號：ab15106）；HRP標記山羊抗兔IgG二抗（Jackson，批號：111-036-003）；HRP標記抗小鼠IgG二抗（Cell Signaling Technology，批號：7076P2）；488山羊抗兔熒光二抗、546猴抗兔熒光二抗（Invitrogen，批號：A11034、A10040）；DAPI溶液（Solarbio，批號：C0065）；BCA蛋白檢測試劑盒（Thermo，批號：UJ290653）；WB-HRP發(fā)光液（美國Millipore，批號：2205202）；中藥飲片（由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院提供）；阿司匹林腸溶片（沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司，國藥準字H20065051）。

2 實驗方法

2.1 藥物組成及制備

化痰通絡湯組成：白術(shù)9 g，茯苓9 g，半夏9 g，天麻12 g，膽南星6 g，天竺黃6 g，制香附9 g，赤芍9 g，紅花9 g，炒桃仁9 g，紫丹參15 g，大黃6 g及三七（沖服）6 g。將中藥飲片加入8倍量水浸泡，煎煮45 min，過濾，水煎液濃縮至含生藥量2 g/mL，加入三七粉0.11 g/mL，混勻，藥液含生藥量為2.11 g/mL為高劑量組給藥藥液；中、低劑量組分別加1倍、3倍生理鹽水稀釋。

阿司匹林腸溶片（Aspirin Enteric-coated Tablets，AECT）研磨成極細粉末，加生理鹽水成0.93 mg/mL藥液。

2.2 動物分組及給藥

85只小鼠隨機分為假手術(shù)組（Control）10只和造模組75只；模型制作成功小鼠隨機分為模型組（Model）、化痰通絡湯高劑量組（HTTLD-H）、化痰通絡湯中劑量組（HTTLD-M）、化痰通絡湯低劑量組（HTTLD-L）和阿司匹林腸溶片組（AECT），每組15只。

化痰通絡湯高、中、低劑量組每日給藥劑量分別為29.64、14.82、7.41 g/kg；阿司匹林腸溶片組每日給藥劑量為13 mg/kg；假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水。于再灌注后30 min分別灌胃給予相應藥物，連續(xù)給藥7 d。

2.3 小鼠MCAO/R模型制備及神經(jīng)功能缺損評分

運用Longa法［11］，參照Uluc大鼠MCAO/R模型制作方法［12］，并根據(jù)小鼠解剖特點進行改良復制小鼠MCAO/R模型。小鼠術(shù)前自由進食飲水，整個造模過程需在解剖顯微鏡下操作。小鼠經(jīng)麻醉消毒后，逐步分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，自左側(cè)頸外動脈進栓，經(jīng)頸內(nèi)動脈至左側(cè)MCA分叉處，手下會感到輕微阻力，鏡下會看到線栓有輕微回彈，輕彈幾次刺激血管收縮利于阻塞成功，進栓深度約0.9～1 cm，缺血90 min后拔出線栓再灌注，并縫合傷口。假手術(shù)組僅暴露血管不插入線栓。具體流程圖見圖1。

圖1 小鼠MCAO/R模型制作流程圖

神經(jīng)功能缺損評分標準：0分，無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分，提尾時右前肢不能完全伸展；2分，爬行時轉(zhuǎn)圈；3分，右側(cè)前、后肢均不能完全伸展，爬行時身體向右側(cè)傾倒；4分，右側(cè)癱瘓，無自發(fā)活動或有意識障礙。評分1～3分為模型制作成功。

2.4 TTC染色法檢測腦組織梗死體積

于術(shù)后第8天麻醉小鼠并斷頭取腦組織，-20 ℃速凍20 min，在冰盒上自額葉前極起切出平均厚度約1 mm的5片冠狀切片，放入2% TTC染液中，37 ℃避光水浴20 min，4%多聚甲醛固定，將固定好的腦片按順序排列，并拍照。用ImageJ軟件計算每片腦組織面積及缺血部位腦組織面積。

缺血區(qū)體積比（%） = 各切片白色缺血區(qū)域面積之和/各腦片面積之和 × 100%

2.5 HE染色法進行病理組織形態(tài)檢測

用PBS緩沖液20 mL，4%多聚甲醛20 mL進行組織灌注后取腦組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h。腦組織經(jīng)脫水機固定程序脫水，經(jīng)包蠟、切片、脫蠟、HE染色、脫水、封片后，顯微鏡觀察并拍照。

2.6 Western blot檢測腦組織中vWF、Fibrinogen、Claudin-5和Occludin蛋白表達

選擇左側(cè)半暗帶部位腦組織，經(jīng)裂解液（RIPA∶PMSF = 100∶1）裂解15 min；研磨、離心后取上清；用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，按蛋白樣品：5 × Bufer = 4∶1比例向蛋白質(zhì)樣品中加入5 × Bufer，95 ℃加熱15 min使蛋白質(zhì)變性。取蛋白樣品50 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%牛奶封閉2 h，加入一抗（vWF、Fibrinogen、Claudin 5、Occludin抗體∶一抗稀釋液=1∶1 000；β-actin抗體∶一抗稀釋液=1∶5 000） 4 ℃孵育過夜。次日經(jīng)TBST洗，加入相應二抗（1∶8 000）孵育2 h，TBST洗膜后顯影。用ImageJ軟件進行灰度值分析。

2.7 免疫熒光檢測腦組織vWF、GP Ⅸ、Fibrinogen、Claudin-5和Occludin表達

腦組織OCT包埋，切取7 μm冰凍切片，PBS清洗，按Triton∶PBS = 1∶1 000比例透膜10 min，PBS清洗，5%胎牛血清封閉液封閉30 min，加一抗（vWF、GP Ⅸ、Fibrinogen、Claudin-5、Occludin抗體∶PBS=1∶1 000）4 ℃孵育過夜。次日，PBS洗去一抗。加入二抗（vWF、GP Ⅸ、Fibrinogen用488羊抗兔熒光二抗，Claudin-5、Occludin用546 猴抗兔熒光二抗，二抗∶PBS = 1∶300）避光孵育2 h，PBS洗后加DAPI 10 min，PBS洗后用抗熒光衰減封片劑封片，于熒光顯微鏡下拍照。用ImageJ軟件進行灰度值分析。

2.8 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件，以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較，數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，滿足方差齊性，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較用最小顯著性差異法（LSD post hoc）檢驗，P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，所有實驗重復次數(shù)均 ≥ 3次。

3 結(jié)果

3.1 小鼠死亡情況

術(shù)后7 d內(nèi)，假手術(shù)組小鼠沒有死亡，模型組死2只，化痰通絡湯高、中劑量組各死亡1只，化痰通絡湯低劑量組死亡2只，阿司匹林腸溶片組死亡4只。

3.2 神經(jīng)功能缺損評分

于術(shù)后第8天進行神經(jīng)功能缺損評分。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組小鼠出現(xiàn)顯著神經(jīng)功能缺損（P＜0.01）；與模型組比較，化痰通絡湯高、中、低劑量組和阿司匹林腸溶片組小鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著降低（P＜ 0.01，P＜ 0.05）；其中化痰通絡湯中劑量組小鼠神經(jīng)功能缺損評分最低，但各給藥組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見表1。

表1 各組小鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦組織梗死體積比較（±s）

表1 各組小鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦組織梗死體積比較（±s）

注：與Control比較，**P ＜ 0.01；與Model比較，##P ＜ 0.01，#P ＜0.05。

梗死體積比/%0 29.10±0.51**16.35±1.29##13.11±0.93##15.85±1.05##15.61±1.34##組別Control Model HTTLD-H HTTLD-M HTTLD-L AECT n3 3 3 3 3 3神經(jīng)功能缺損評分/分0 1.77±0.17**1.29±0.13##1.21±0.11##1.38±0.14#1.30±0.15#

3.3 TTC染色結(jié)果

假手術(shù)組小鼠腦組織無明顯白色梗死灶，模型組與各模型加藥物組小鼠腦組織均有明顯白色梗死灶。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織梗死體積顯著增加（P＜ 0.01）；與模型組比較，化痰通絡湯高、中、低劑量組和阿司匹林腸溶片組小鼠腦組織梗死體積均顯著減小（P＜ 0.01）。見圖2。

圖2 腦組織TTC染色圖

3.4 HE染色結(jié)果

假手術(shù)組小鼠腦組織可見密布血管網(wǎng)，且血管清晰、分布均勻；細胞完整，排列整齊有序，胞質(zhì)均勻，核仁清晰可見。模型組小鼠腦組織鮮有完整血管存在、管腔內(nèi)斑塊阻塞微血管；細胞排列紊亂、胞膜碎裂，胞核固縮、變形，呈現(xiàn)出明顯壞死改變。各給藥組小鼠腦組織均有血管網(wǎng)分布，其中化痰通絡湯高、中劑量組血管網(wǎng)較為清晰，管內(nèi)有少量細胞沉積；多數(shù)細胞排列整齊，胞質(zhì)均勻，胞體完整，核仁清晰?；低ńj湯低劑量組和阿司匹林腸溶片相較于模型組，血管相對清晰，但仍有明顯斑塊沉積，血管閉塞情況有所改善。見圖3。

圖3 腦組織HE染色圖（× 400）

3.5 Western blot結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中vWF、Fibrinogen蛋白表達顯著升高（P＜ 0.01），Claudin-5、Occludin蛋白表達顯著降低（P＜ 0.01）。與模型組比較，化痰通絡湯高、中劑量組與阿司匹林腸溶片組vWF和Fibrinogen表達顯著降低（P＜ 0.01）；化痰通絡湯低劑量組vWF表達顯著降低（P＜ 0.01），F(xiàn)ibrinogen表達降低不顯著（P＞ 0.05）；化痰通絡湯中劑量組Claudin-5蛋白表達顯著升高（P＜ 0.01），化痰通絡湯高、低劑量組Claudin-5蛋白表達雖有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）；化痰通絡湯高、低劑量組Occludin蛋白表達顯著升高（P＜ 0.05），化痰通絡湯中劑量組與阿司匹林腸溶片組Occludin蛋白表達雖有升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見圖4和表2。

表2 各組小鼠腦組織Western blot相對表達量比較（±s）

表2 各組小鼠腦組織Western blot相對表達量比較（±s）

注：與Control比較，**P ＜ 0.01；與Model比較，##P ＜ 0.05，#P ＜ 0.01；與AECT比較，▲▲P ＜ 0.01。

組別Control Model HTTLD-H HTTLD-M HTTLD-L AECT Occludin/β-actin 1.12±0.01 0.59±0.00**1.08±0.03#1.03±0.07 1.20±0.27#0.97±0.24 n3 3 3 3 3 3 vWF/β-actin 0.49±0.07 0.87±0.05**0.53±0.05##0.39±0.05##0.38±0.07##0.42±0.1##Fibrinogen/β-actin 0.27±0.02 1.01±0.05**0.49±0.11##0.59±0.11##0.96±0.04▲▲0.44±0.07##Claudin-5/β-actin 1.53±0.11 0.69±0.05**0.88±0.05 1.25±0.12##▲▲0.86±0.13 0.53±0.19

圖4 Western blot結(jié)果

3.6 免疫熒光結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中vWF、GPⅨ、Fibrinogen表達顯著增加（P＜ 0.01），Claudin-5和Occludin表達顯著降低（P＜ 0.01）；與模型組比較，化痰通絡湯高、中、低劑量組和阿司匹林腸溶片組vWF、GP Ⅸ、Fibrinogen表達顯著降低（P＜ 0.01），Claudin-5表達顯著升高（P＜ 0.05，P＜ 0.01）；化痰通絡湯高、中、低劑量組Occludin表達顯著升高（P＜ 0.01）。見圖5～9和表3。

表3 各組小鼠腦組織熒光表達量比較（±s，%）

表3 各組小鼠腦組織熒光表達量比較（±s，%）

注：與Control比較，**P ＜ 0.01；與Model比較，##P ＜ 0.05，#P ＜ 0.01；與AECT比較，▲▲P ＜ 0.01。

Occludin 2.60±0.17 0.63±0.07**2.51±0.13##▲▲2.24±0.13##▲▲2.05±0.12##▲▲0.97±0.09組別Control Model HTTLD-H HTTLD-M HTTLD-L AECT n4 4 4 4 4 4 vWF 0.27±0.02 5.56±0.36**0.43±0.05##▲▲0.82±0.22##▲▲3.21±0.16##2.77±0.25##GP9 1.33±0.10 2.79±0.22**0.29±0.04##▲▲0.29±0.03##▲▲1.25±0.06##1.28±0.27##Fibrinogen 0.34±0.03 5.54±0.61**0.42±0.04##0.62±0.12##1.76±0.23##1.09±0.09##Claudin-5 3.25±0.49 0.21±0.05**1.08±0.07#1.44±0.13##1.37±0.15##1.68±0.10##

圖5 vWF免疫熒光結(jié)果（× 200）

圖6 GPIX免疫熒光結(jié)果（× 200）

圖7 Fibrinogen免疫熒光結(jié)果（× 200）

圖8 Claudin-5免疫熒光結(jié)果（× 200）

圖9 Occludin免疫熒光結(jié)果（× 200）

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，vWF和GP Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ復合物介導的血小板早期黏附在缺血性腦卒中血栓炎癥反應和再灌注無復流現(xiàn)象中發(fā)揮關(guān)鍵性作用［7］。vWF是一種大的多聚體糖蛋白，主要在內(nèi)皮細胞和巨核細胞內(nèi)合成，然后被分泌到血液或存儲到內(nèi)皮細胞Weibel-Palade小體和血小板α顆粒。血小板膜糖蛋白GP Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ復合物是血小板表面黏附受體，在缺血性腦卒中的病理過程中，vWF通過與血小板膜糖蛋白GP Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ復合物結(jié)合，刺激血小板黏附和下游活化信號激活血小板，并結(jié)合激活整合素GP Ⅱb/Ⅲa，刺激血小板聚集［13-16］；vWF與結(jié)合活化的血小板在缺血性腦卒中病理過程中通過各種黏附分子的相互作用，募集白細胞、單核細胞、T淋巴細胞等并進一步刺激微血栓形成阻塞微血管［7，17］。研究指出，抑制vWF聚集［17-18］，或抑制血小板膜糖蛋白 Ⅰb（glycoprotein Ⅰb，GP Ⅰb）［19］，或阻斷vWF與GP Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ復合物相互作用［20］，減少血小板早期黏附可明顯減少中性粒細胞、T細胞等免疫細胞募集，維護血腦屏障［21-24］，減少微血栓的形成和纖維蛋白原沉積，改善微循環(huán)阻塞，發(fā)揮抗血栓形成、減輕炎癥反應，進而減輕腦缺血再灌注損傷。

血腦屏障是介于血液與腦組織之間的重要屏障，能夠限制有潛在毒性的血漿成分、血細胞和病原體等進入腦組織，發(fā)揮維護神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的作用。血腦屏障主要由兩部分組成，一是由腦毛細血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細胞形成的血漿與腦細胞之間的屏障；二是由脈絡叢形成的血漿與腦脊液之間的屏障。腦毛細血管內(nèi)皮細胞之間通過緊密連接、黏附連接和間隙連接蛋白連接，在緊密連接中Occludin、Claudins和黏附分子形成對液體不可滲透的屏障［25］。Occludin和Claudin-5是最具代表性的緊密連接蛋白，在腦毛細血管高表達，通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮通透性發(fā)揮維持血管穩(wěn)態(tài)的作用［26］。腦缺血誘導Occludin降解和Claudin-5表達減少，促使內(nèi)皮細胞凋亡從而增加再灌注后出血的可能［27-28］。因此，維持Occludin和Claudin-5表達，維護血腦屏障完整性對減少再灌注后腦出血至關(guān)重要。因本研究所用化痰通絡湯活血化瘀之力較強，恐有損傷血脈之弊，故而同時研究其對血腦屏障緊密連接蛋白Claudin-5和Occludin的調(diào)節(jié)作用。

化痰通絡湯適用于缺血性中風中經(jīng)絡之風痰阻絡證，主方由半夏、生白術(shù)、天麻、茯苓、膽南星、天竺黃、紫丹參、香附、酒大黃、三七組成，本實驗所用化痰通絡湯參照臨床應用在原方基礎(chǔ)上加用桃仁、紅花、赤芍以增強活血化瘀之力［29］。方中半夏燥濕化痰，天麻平肝潛陽、祛風通絡為君藥；丹參、桃仁、紅花、赤芍涼血化瘀，活血而不致血熱妄行為臣藥；白術(shù)、茯苓健脾利濕，膽南星、天竺黃有清熱化痰之效，共奏理氣健脾、燥濕化痰、熄風止痙之功，香附理氣和中，兼三七止血活血共為佐藥；酒大黃通腑泄?jié)?，蕩滌腸胃，使腑氣通而痰濁得化。綜觀全方，溫涼并用，活血與化痰兼顧，共奏活血祛瘀、化痰通絡之功。

降低病死率和致殘率是中風病治療的首要目標，本研究結(jié)果顯示，小鼠MCAO/R后，腦組織梗死灶明顯，神經(jīng)功能出現(xiàn)明顯缺損?；低ńj湯高、中劑量能夠減少MCAO/R小鼠病死率，高、中、低劑量均可減少腦組織梗死體積，改善神經(jīng)功能，以中劑量組效果最佳。HE染色結(jié)果顯示，化痰通絡湯中劑量組較好地維持了血管壁的完整性，血管中細胞沉積較少。Western blot和免疫熒光檢測結(jié)果表明，化痰通絡湯可減少MCAO/R小鼠腦組織中vWF、GP Ⅸ和Fibrinogen蛋白表達，同時升高Claudin-5和Occludin蛋白表達，在抗血小板、降聚、降纖的同時，在一定程度上維護血腦屏障。

綜上所述，化痰通絡湯可減少腦缺血再灌注小鼠腦組織梗死體積，改善神經(jīng)功能，其作用可能與化痰通絡湯能降低缺血再灌注后腦組織中vWF表達，減少血小板黏附和聚集，減少纖維蛋白原沉積，同時升高Claudin-5和Occludin蛋白表達，維護血腦屏障有關(guān)。