貝母瓜蔞散抑制炎癥反應(yīng)改善脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的機制研究

吳鑒超，趙源，陳久林，劉特，郁志華?

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海市中醫(yī)老年醫(yī)學(xué)研究所，上海 200031；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是臨床上引起嚴(yán)重呼吸窘迫、供氧難治低氧性呼吸衰竭的重要原因，發(fā)展到一定程度可以定義為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。ALI/ARDS的病因有很多，包括但不限于感染、膠原血管疾病、藥物作用、攝入劑作用、吸入劑作用、休克、急性嗜酸性肺炎、免疫介導(dǎo)的肺出血和血管炎以及放射性肺炎等［1］。

根據(jù)急性肺損傷的臨床癥狀，如咳嗽、呼吸困難，喘息鼻張等，可將其歸于“喘脫”“結(jié)胸”“暴喘”等范疇［2］。中醫(yī)古籍中對本病亦有論述，如《靈樞·五閱五使》［3］言：“故肺病者，喘息鼻張?！薄吨胁亟?jīng)》［4］載：“不病而暴喘促者死?！薄度数S直指方·喘嗽方論》曰［5］：“惟失邪氣伏藏，痰涎浮涌，呼不得呼，吸不得吸，于是上氣喘息?！必惸腹鲜V散出自清代程國彭所著《醫(yī)學(xué)心悟·卷三·痰飲》［6］，載其：“肺燥則潤之，貝母瓜蔞散?！庇韶惸浮⒐鲜V、天花粉、桔梗、茯苓、化橘紅6味藥組成。具有潤肺清熱、化痰止咳之效，為潤燥化痰之代表方?！渡鼾S遺書·虛損》［7］有言：“如金衰衛(wèi)弱而多外感之來，則氣傷而肺損。”可知急性肺損傷的病機多為邪氣入侵，正邪交爭，傷及正氣，邪盛正衰而致肺損。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗驗證的方法，分析貝母瓜蔞散治療ALI干預(yù)效果及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 貝母瓜蔞散活性成分及其對應(yīng)靶點篩選

貝母瓜蔞散的化學(xué)成分來自中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）［8］。按文獻(xiàn)報道設(shè)定藥物相似性（DL ≥ 0.18）和口服生物利用度（OB ≥ 30%）［9］作為篩選貝母瓜蔞散組方中藥活性成分的標(biāo)準(zhǔn)。通過PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）［10］得到活性成分的2D結(jié)構(gòu)的SDF格式文件。利用活性成分的SDF格式文件使用瑞士靶點預(yù)測數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）［11］進(jìn)行預(yù)測，即可得到對應(yīng)靶點信息，同時整合TCMSP數(shù)據(jù)庫貝母瓜蔞散組方中藥的靶點信息。最后再使用UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）［12］將靶點信息標(biāo)準(zhǔn)化。利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，篩選出貝母瓜蔞散活性成分的潛在靶點。

1.2 ALI靶基因收集和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

從GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）［13］中以“acute lung injury”為關(guān)鍵詞搜索與ALI有關(guān)的基因，得到ALI相關(guān)靶點。

將收集的貝母瓜蔞散組方活性成分靶點與ALI相關(guān)靶點，通過Venny 2.1.0在線軟件篩選出二者共同靶點作為研究靶點，即貝母瓜蔞散治療ALI可能的靶點。用STRING（https：//string-db.org）平臺［14］構(gòu)建共同靶點的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.3 GO基因功能分析及信號通路富集分析

將共同靶點導(dǎo)入Metascape（http：//metascape.org/）［15］平臺，進(jìn)行Gene Ontology（基因本體）分析。Reactome（https：//reactome.org/）數(shù)據(jù)庫［16］囊括NCBI、Ensembl、UniProt、UCSC基因組瀏覽器、KEGG化合物、ChEBI小分子數(shù)據(jù)庫和PubMed文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫等多個不同的在線生物信息學(xué)資源庫，借助Reactome平臺對共同靶點進(jìn)行信號通路富集分析。

1.4 實驗驗證

1.4.1 藥品與試劑

貝母瓜蔞散由川貝母4.5 g，瓜蔞3 g，天花粉2.5 g，茯苓2.5 g，化橘紅2.5 g，桔梗2.5 g配伍組成，采用中藥配方顆粒制劑（川貝母、瓜蔞、天花粉、茯苓、化橘紅、桔梗批號分別為18120462、18020402、19050172、20020212、19080072、19110202，江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司）；連花清瘟顆粒（北京以嶺藥業(yè)有限公司）；脂多糖（LPS，碧云天生物技術(shù)有限公司）；TRIzol（Thermo）；異丙醇、氯仿（國藥）；cDNA合成試劑盒、qPCR試劑盒（Servicebio）。

1.4.2 動物分組與模型制備

雄性6周齡C57小鼠48只，由維通利華有限公司提供，許可證號：SCXK（浙）2019-0001，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，具體飼養(yǎng)條件為：溫度24～26 ℃，相對濕度50%～70%，12/12 h明暗周期，自由飲食，提供充足的食物和水。所有動物程序均經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)機構(gòu)動物倫理和使用委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：PESHUTCM200703011），相關(guān)操作嚴(yán)格按照我國《實驗動物管理條例》進(jìn)行。

將小鼠隨機分為4組，每組12只，分別為空白組（灌胃等量生理鹽水）、模型組（腹腔注射1 mg/kg LPS），貝母瓜蔞散組（灌胃8 mL/kg貝母瓜蔞散藥液，腹腔注射1 mg/kg LPS）作為治療組，連花清瘟組（灌胃8 mL/kg連花清瘟藥液，腹腔注射1 mg/kg LPS）作為陽性對照組。造模開始第1天注射1 mg/kg LPS，第2天起給予人等效劑量中藥灌胃治療，此后每兩天注射1次LPS，連續(xù)給藥30 d后，小鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，收集肺組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 肺組織病理學(xué)檢查

將小鼠肺組織固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋，切成5 μm切片。然后，切片脫蠟至水，蘇木素染液染色15 min，雙蒸水漂洗5 min；1%鹽酸酒精分化30 s，雙蒸水室溫浸泡15 min，將切片置于伊紅染液染色2 min，雙蒸水漂洗5 min；常規(guī)脫水，透明，封片。在顯微鏡（BX51，OLYMPUS，Japan）40倍顯微鏡物鏡下觀察肺組織病理學(xué)的變化并拍照。

1.4.4 肺組織MASSON染色

將小鼠肺組織石蠟切片用蘇木素染色液染色5 min，雙蒸水漂洗5 min；將切片于Masson藍(lán)化液靜置處理5 min，然后放入雙蒸水漂洗1 min；麗春紅酸性品紅液染8 min；用0.2%冰醋酸水溶液洗1 min；用1%磷鉬酸水溶液分化約5 min，然后重復(fù)用0.2%冰醋酸水溶液洗1 min；入苯胺藍(lán)染液復(fù)染5 min，用0.2%冰醋酸水溶液洗1 min；最后脫水封片。封片后同樣在顯微鏡40倍顯微鏡物鏡下拍照。

1.4.5 肺組織細(xì)胞因子RT-qPCR檢測

從肺組織中提取總RNA，定量后用ReVertAid First Strand cDNA合成試劑盒將分離的mRNA反向轉(zhuǎn)錄成cDNA。用LightCycler96實時PCR系統(tǒng)和2 × SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR，引物序列見表1。檢測肺組織中IL-1α、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA表達(dá)，用2-ΔΔCT方法測定候選基因的表達(dá)水平，表達(dá)水平對照參考基因18S進(jìn)行歸一化。

表1 引物序列表

1.4.6 統(tǒng)計學(xué)方法

MASSON染色圖片采用ImageJ進(jìn)行圖像分析。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布、方差齊，則選用單因素方差分析或t檢驗，否則采用秩和檢驗。檢驗水準(zhǔn)取雙側(cè)α = 0.05，P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 貝母瓜蔞散組方潛在活性成分及其核心靶點

通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫，篩選出同時符合DL ≥ 0.18和OB ≥ 30%這兩個標(biāo)準(zhǔn)的貝母瓜蔞散化學(xué)成分48個，其中貝母化學(xué)成分10個、瓜蔞化學(xué)成分8個、天花粉化學(xué)成分2個、茯苓化學(xué)成分15個、化橘紅化學(xué)成分9個、桔梗化學(xué)成分4個，合并重復(fù)項后得到44個活性成分，見表2。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫和Swiss target prediction平臺預(yù)測這44個活性成分的靶點，最終獲得了606個靶點。利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。

圖1 貝母瓜蔞散活性成分核心靶點網(wǎng)絡(luò)

表2 貝母瓜蔞散活性成分表

2.2 “貝母瓜蔞散-ALI”相關(guān)靶點的篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過 GeneCards 數(shù)據(jù)庫共搜集到ALI相關(guān)靶點1 701個，將1 701個靶點與貝母瓜蔞散606個候選靶點在 Venny 2.1.0 中映射篩選出258個共同靶點，結(jié)果見圖2。將258個基因帶入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析（要求的最低互動分?jǐn)?shù) = 0.96），結(jié)果形成包含258個節(jié)點，477條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。

圖2 貝母瓜蔞散-ALI靶點交集韋恩圖

圖3 貝母瓜蔞散-ALI靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

將網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.0并分析，其中度值（Degree） ＞ 26的靶點有20個，可能為“貝母瓜蔞散”治療ALI的核心靶點，見表3。

表3 貝母瓜蔞散組方治療ALI的核心靶點及參數(shù)

2.3 共同靶點的GO分析和信號通路富集分析

利用Metascape平臺對258個共同靶點進(jìn)行GO分析，P＜ 0.05前10條見圖4，生物過程主要涉及激酶活性的正調(diào)控、細(xì)胞運動的正調(diào)控、創(chuàng)傷反應(yīng)等過程；細(xì)胞組分主要涉及受體復(fù)合物、膜筏、黏著斑等過程；分子功能主要涉及蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、激酶結(jié)合等過程。

圖4 貝母瓜蔞散靶向基因GO分析

將258個共同靶點輸入到Reactome數(shù)據(jù)庫中，得到238條通路（P＜ 0.01），對其進(jìn)行富集分析并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對排名前40的通路進(jìn)行可視化處理，圖中節(jié)點大小反映P值的大小，見圖5。信號通路的基因富集分析發(fā)現(xiàn)，主要有白細(xì)胞介素信號、白介素-4和白介素-13的信號、癌癥中的PI3K/Akt信號、負(fù)調(diào)控PI3K/Akt網(wǎng)絡(luò)、受體酪氨酸激酶的信號、核外雌激素信號、免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞因子信號傳遞等通路。

圖5 信號通路的基因富集分析

2.4 各組小鼠肺組織病理形態(tài)改變

肺組織HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織肺泡增厚情況明顯，肺泡組織結(jié)構(gòu)損傷和炎癥細(xì)胞浸潤增加，肺泡水腫液積累、肺泡毛細(xì)血管充血；與模型組相比，貝母瓜蔞散組較模型組肺泡增厚情況減輕，鏡下肺泡結(jié)構(gòu)破壞程度減少，肺間質(zhì)和肺泡充血水腫較模型組減輕，肺泡內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤，但程度較模型組亦有所減輕。提示貝母瓜蔞散減輕了LPS引起的肺損傷。見圖6。

圖6 各組小鼠肺組織HE染色（× 400）

2.5 各組小鼠肺組織MASSON染色變化

空白組僅可見少量膠原纖維陽性染色；與空白組比較，模型組小鼠肺組織水腫嚴(yán)重且有大量炎癥細(xì)胞浸潤，并且膠原纖維染色陽性明顯（P＜ 0.001），提示肺組織炎癥伴纖維化；貝母瓜蔞散組肺組織藍(lán)染的膠原纖維表達(dá)少量存在，較模型組上述肺組織水腫、損傷和纖維化有顯著改善，膠原纖維染色面積減少（P＜0.01）。見圖7、圖8和表4。

圖7 各組肺組織Masson染色圖（× 400）

圖8 各組小鼠肺組織MASSON染色陽性率比較

表4 各組小鼠肺組織MASSON染色陽性率比較（±s）

表4 各組小鼠肺組織MASSON染色陽性率比較（±s）

注：與空白組比較，***P ＜ 0.001；與模型組比較，## P ＜ 0.01。

組別空白組模型組貝母瓜蔞散組連花清瘟組陽性率/%23.87±4.236 42.96±3.115***30.31±1.766##30.75±4.855##n3 3 3 3

2.6 各組小鼠肺組織細(xì)胞因子mRNA變化

與空白組比較，模型組小鼠肺組織IL-1α、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA表達(dá)增加（P＜ 0.01）；與模型組比較，貝母瓜蔞散組和連花清瘟組小鼠IL-1α、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA表達(dá)下降（P＜0.01）。見表5。

表5 各組小鼠肺組織IL-1α、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA水平比較（±s）

表5 各組小鼠肺組織IL-1α、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA水平比較（±s）

注：與空白組比較，** P ＜ 0.01；與模型組比較，## P ＜ 0.01。

組別空白組模型組貝母瓜蔞散組連花清瘟組TNF-α 1.005±0.112 11.231±0.917**1.296±0.325##0.038±0.004##n4 4 4 4 IL-1α 1.014±0.185 36.529±8.341**1.678±0.285##8.710±2.428##IL-2 1.008±0.145 2.909±0.456**1.821±0.231##0.739±0.096##IL-6 1.010±0.158 14.389±1.454**0.809±0.144##0.167±0.031##IL-10 1.026±0.259 8.646±2.388**0.772±0.234##0.024±0.005##

3 討論

急性肺損傷（ALI）存在多種免疫細(xì)胞共同介導(dǎo)的過度、失控的肺部炎癥反應(yīng)，同時肺部和全身炎癥之間的相互影響促進(jìn)了ALI的發(fā)展，是ALI發(fā)病過程中重要病理因素［17-19］。有研究者觀察臨床ALI患者的中醫(yī)證候發(fā)現(xiàn)，痰熱壅肺證是其中最主要的證型［2］。貝母瓜蔞散，載于《醫(yī)學(xué)心悟·卷三·痰飲》，主治燥痰澀而難出；由貝母1錢5分，瓜蔞1錢，天花粉8分，茯苓8分，橘紅8分，桔梗8分組成；有潤肺清熱、理氣化痰之效。方以貝母清熱潤肺、止咳化痰為君；瓜蔞、天花粉清熱滌痰而潤燥為臣；茯苓、橘紅健脾理氣以祛痰為佐；桔梗載諸藥入肺，宣肺利氣為使；共奏清熱潤燥、理氣化痰之功，使肺陰得潤而燥痰可除，清肅有權(quán)則咳逆可止。宗紹波等［20］研究發(fā)現(xiàn)，具有祛痰止咳作用的中成藥金振口服液能夠有效改善LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織間質(zhì)性水腫及降低致炎細(xì)胞因子的含量。貝母瓜蔞散中君藥貝母具有祛痰、鎮(zhèn)咳和抗炎作用［21-22］。基于以上原因，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對貝母瓜蔞散治療ALI進(jìn)行預(yù)測分析，篩選貝母瓜蔞散治療ALI的靶點和通路，并進(jìn)行實驗驗證。

本研究采用腹腔注射LPS模擬全身感染，間接導(dǎo)致炎性反應(yīng)性ALI?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥患者也極易發(fā)生ALI，因此以LPS為代表的生物因素誘導(dǎo)膿毒血癥致ALI是最常見的ALI造模方法［23-24］。此外，本研究參考既往文獻(xiàn)報道，采取了小劑量間斷腹腔注射LPS，在保證小鼠存活率的同時觀察到了ALI炎癥反應(yīng)和肺纖維化表現(xiàn)［25-26］。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出貝母瓜蔞散活性化合物44個，相對應(yīng)靶點606個。急性肺損傷關(guān)聯(lián)分析確定了258個共同靶點，PPI 網(wǎng)絡(luò)分析表明，HSP90AA1、IL-6、TNF-α等免疫與炎癥相關(guān)蛋白均具有較高的度值（≥ 28），處于網(wǎng)絡(luò)的中心位置，可能是貝母瓜蔞散治療ALI的關(guān)鍵靶點。在一項輸血相關(guān)急性肺損傷患者預(yù)后的研究中［27］，患者入院時血清促炎因子IL-6、TNF-α的表達(dá)水平和發(fā)生肺損傷患者存活和死亡呈正相關(guān)，存活組IL-6和TNF-α表達(dá)水平均顯著低于死亡組。本研究的動物實驗中，通過實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測各組小鼠肺組織IL-1α、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA表達(dá)，相較空白組，模型組中這些細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)顯著升高。同時，這些在模型組中顯著高表達(dá)的炎癥性細(xì)胞因子mRNA，經(jīng)貝母瓜蔞散干預(yù)后，均呈現(xiàn)低表達(dá)。提示貝母瓜蔞散能夠抑制LPS引起的小鼠肺組織IL-1α、IL-2、IL6、IL-10、TNF-α mRNA過度表達(dá)。

同時GO分析結(jié)果顯示，貝母瓜蔞散對ALI的作用主要涉及了激酶活性的正調(diào)控、受體復(fù)合物、蛋白激酶活性等過程。從信號通路的基因富集分析結(jié)果來看，貝母瓜蔞散可能調(diào)控白細(xì)胞介素信號、IL-4和IL-13的信號、免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞因子信號傳遞等信號通路發(fā)揮ALI治療作用。白介素是目前發(fā)現(xiàn)種類最多，調(diào)控作用最廣泛的一類細(xì)胞因子，而研究發(fā)現(xiàn)許多中藥對白介素類細(xì)胞因子具有干預(yù)作用，通過抗炎、抗病毒、改善免疫狀態(tài)等，可以減輕或抑制炎癥反應(yīng)對機體的損傷［28］。貝母瓜蔞散可能從改善機體細(xì)胞因子風(fēng)暴方向發(fā)揮對急性肺損傷的治療作用。細(xì)胞因子風(fēng)暴，即炎癥風(fēng)暴，最早由FERRARA等［29］于1993年在graft-versus-host disease（GVHD）中提出，是由感染、藥物或某些疾病引起的機體過度免疫。本研究中的HE染色結(jié)果提示，與模型組相比，貝母瓜蔞散減輕了LPS引起的小鼠肺組織損傷，改善了LPS引起的肺組織形態(tài)學(xué)異常。

4 結(jié)論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究貝母瓜蔞散治療急性肺損傷可能的作用機制，發(fā)現(xiàn)貝母瓜蔞散可能通過多靶點多途徑發(fā)揮對急性肺損傷的治療作用，其作用機制或許和白細(xì)胞介素信號密切相關(guān)，特別是白細(xì)胞介素信號通路的調(diào)控可能是關(guān)鍵機制之一。本研究還通過動物實驗發(fā)現(xiàn)貝母瓜蔞散對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷有潛在的治療作用，貝母瓜蔞散可減少模型小鼠肺組織細(xì)胞因子IL-1α、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α釋放，抑制肺組織炎癥反應(yīng)和纖維化，避免炎癥反應(yīng)對肺組織的進(jìn)一步損傷，發(fā)揮急性肺損傷治療作用。