松郁安神方通過(guò)海馬NLRP3炎性小體通路改善慢性睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的研究

曾雪愛，周春權(quán)，郭昕子，張瑜，張敏，張一帆，陳銘奇，黃俊山（.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建 福州 350003；.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350003）

睡眠剝奪是由于環(huán)境或自身原因所引起的睡眠時(shí)間減少或者睡眠質(zhì)量下降[1]。隨著生活節(jié)奏加快，夜間生活時(shí)間延長(zhǎng)，睡眠時(shí)間縮短，越來(lái)越多的人群出現(xiàn)不同程度的睡眠剝奪。睡眠剝奪能引起廣泛的機(jī)體損傷，例如增加大腦神經(jīng)性疾病、心血管疾病、腸道穩(wěn)態(tài)失衡和其他多器官疾病的發(fā)病率、死亡率[2]。長(zhǎng)期睡眠不足會(huì)直接導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降，因此針對(duì)睡眠剝奪進(jìn)行積極干預(yù)具有重要意義。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)揭示NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domian associated protein 3，NLRP3）炎性小體在睡眠障礙、學(xué)習(xí)記憶障礙、認(rèn)知損害中發(fā)揮了重要作用，其能夠誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素18（Interleukin-18，IL-18）、IL-1β 等的成熟和分泌，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生[3-4]。

松郁安神方是本課題組在臨床上針對(duì)肝郁化火、陰虛火旺型失眠創(chuàng)立的經(jīng)驗(yàn)方，具有疏肝解郁、平肝潛陽(yáng)、寧心安神的功效，臨床療效確切[5-6]。本課題組前期研究顯示，松郁安神方具有改善失眠大鼠睡眠及學(xué)習(xí)記憶的作用[7-9]，可降低睡眠剝奪大鼠血清促炎性細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)水平[10]，但其調(diào)節(jié)睡眠改善學(xué)習(xí)記憶的潛在作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。故本研究擬通過(guò)慢性睡眠剝奪建立失眠大鼠模型，探討松郁安神方對(duì)NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）及其下游促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18 的影響，揭示其改善睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，2月齡，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：110300000100882563。動(dòng)物置于安靜、室溫25～26 ℃、相對(duì)濕度50%～60%、12 h/12 h 明暗光照環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水、攝食。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批文號(hào)：FJATCM-IAEC2022002。

1.2 藥物及試劑松郁安神方組成：甘松10 g、郁金15 g、玫瑰花10 g、丹參15 g、酸棗仁15 g、首烏藤30 g、珍珠母30 g、生龍骨30 g、合歡皮15 g，飲片均購(gòu)于福州鷺燕藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明教授鑒定為正品。按照前期研究[9]方法制備松郁安神方藥液，經(jīng)煎煮、過(guò)濾后濃縮至含生藥3.4 g·mL-1濃度，4 ℃保存。IL-1β（批號(hào)：R11013726）、IL-18（批號(hào)：R10013725）ELISA 檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；NLRP3抗體（批號(hào)：1007080-14）、ASC 抗體（批號(hào)：1031305-6），均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；Caspase-1 抗體，武漢愛博泰克（ABclonal）生物科技有限公司，批號(hào)：5500014099；β-tubulin 抗體，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)：LS20380；β-actin 抗體（批號(hào)：4970-14）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（批號(hào)：7074-27），均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；ECL 化學(xué)發(fā)光液，美國(guó)Thermo 公司，批號(hào)：UD281581。

1.3 主要儀器SBZ-2 型動(dòng)物睡眠剝奪裝置，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制；MT-200型Morris 水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；Elx800TS 型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek 公司；NanoDrop 2000 型微量紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo 公司；蛋白電泳和電轉(zhuǎn)儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；FluorChem M型Alpha 多色熒光、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)ProteinSimple公司。

1.4 分組、模型復(fù)制及給藥將SD 大鼠隨機(jī)分成正常組（8 只）、大平臺(tái)組（8 只）、睡眠剝奪組（32 只）。睡眠剝奪組采用改良多平臺(tái)水環(huán)境法進(jìn)行慢性睡眠剝奪模型復(fù)制[11-12]：將大鼠放入睡眠剝奪裝置，內(nèi)有多個(gè)小平臺(tái)，平臺(tái)直徑6.5 cm，周圍注滿水，平臺(tái)高于水面約1.0 cm；當(dāng)大鼠進(jìn)入快速眼動(dòng)（Rapid eyes movement，REM）睡眠時(shí)，因全身肌肉張力降低，出現(xiàn)垂頭觸水而覺醒，從而達(dá)到睡眠剝奪的目的。每日14∶00 至次日10∶00 進(jìn)行睡眠剝奪20 h，然后恢復(fù)睡眠4 h，連續(xù)剝奪21 d。正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，大平臺(tái)組采用與睡眠剝奪組一樣的裝置，僅把大鼠放在直徑為12 cm的大平臺(tái)上，保證動(dòng)物在大平臺(tái)上能夠進(jìn)入REM 睡眠，其他環(huán)境與睡眠剝奪組完全一致。若造模大鼠出現(xiàn)白天精神亢奮、易激惹，晝夜節(jié)律消失，與正常組比較體質(zhì)量顯著下降，則表明模型復(fù)制成功。

模型復(fù)制成功后，將睡眠剝奪組大鼠隨機(jī)分為模型組及松郁安神方高、中、低劑量組，每組8只。松郁安神方高、中、低劑量組每天分別按照34、17、8.5 g·kg-1劑量灌胃，給藥劑量按大鼠與成人給藥劑量換算[13]。正常組、大平臺(tái)組、模型組均給予同等體積蒸餾水灌胃，每天1次，連續(xù)7 d。

1.5 大鼠一般狀態(tài)觀察造模及給藥期間觀察記錄各組大鼠的活動(dòng)程度、晝夜節(jié)律、皮膚毛發(fā)、精神狀態(tài)、飲食飲水量及體質(zhì)量等一般情況。

1.6 Morris 水迷宮法測(cè)定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力造模前先進(jìn)行Morris 水迷宮訓(xùn)練，連續(xù)訓(xùn)練3 d。造模第21 天和給藥后第7 天均進(jìn)行定位航行和空間搜索試驗(yàn)。采用定位航行試驗(yàn)測(cè)試大鼠對(duì)水迷宮的學(xué)習(xí)記憶能力：將大鼠分別從4個(gè)不同象限入水，用軟件記錄大鼠找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）以及到達(dá)平臺(tái)的游泳總距離，取4次平均值。若大鼠120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則逃避潛伏期記為120 s，以此作為判斷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。采用空間搜索試驗(yàn)測(cè)試大鼠對(duì)平臺(tái)空間位置的記憶能力：定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后休息半天，撤去平臺(tái)，然后從任意選擇的一個(gè)象限入水，記錄120 s內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間和穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.7 ELISA 法檢測(cè)海馬組織中IL-1β、IL-18 含量水迷宮測(cè)試結(jié)束后，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）麻醉，冰面上迅速剝離腦組織；收集海馬組織，按照1∶9 的質(zhì)量體積比加入PBS，冰上勻漿；以4 ℃、5 000×g離心10 min，取上清；嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟操作，測(cè)定海馬組織中IL-1β、IL-18含量。

1.8 Western Blot 法檢測(cè)海馬組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)水平取大鼠海馬組織，加裂解液勻漿提取總蛋白。蛋白定量后進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。分別用一抗NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）、β-tubulin（1∶1 000）在4 ℃下孵育過(guò)夜；然后用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000）在室溫下孵育1 h；最后用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描；采用ImageJ 圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin/β-tubulin為內(nèi)參，對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD（方差齊性）檢驗(yàn)或Dunnett’s T3（方差不齊）檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 松郁安神方對(duì)慢性睡眠剝奪大鼠體質(zhì)量的影響結(jié)果見圖1。正常組和大平臺(tái)組比較，體質(zhì)量無(wú)明顯變化（P＞0.05）。造模期間，與大平臺(tái)組比較，睡眠剝奪組大鼠體質(zhì)量增加緩慢（P＜0.01）。藥物治療7 d后，與模型組比較，松郁安神方高、中、低劑量組大鼠的體質(zhì)量增加量均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 各組大鼠的體質(zhì)量變化（±s，n=8）Figure 1 Body mass changes of rats in each group（±s，n=8）

2.2 松郁安神方對(duì)慢性睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響結(jié)果見圖2、圖3、圖4。正常組和大平臺(tái)組比較，學(xué)習(xí)記憶能力無(wú)明顯變化（P＞0.05）。21 d 睡眠剝奪后，與大平臺(tái)組比較，睡眠剝奪組大鼠的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)（P＜0.01），到達(dá)平臺(tái)的總距離顯著增加（P＜0.01），穿越平臺(tái)的次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 睡眠剝奪21 d 后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化（±s，n=8）Figure 2 Changes in learning and memory ability in 21-day sleep-deprived rats（±s，n=8）

圖3 水迷宮實(shí)驗(yàn)的大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡圖Figure 3 Movement plot of rats in the water maze test

圖4 松郁安神方對(duì)慢性睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響（±s，n=8）Figure 4 Effects of Songyu Anshen Prescription on learning and memory ability of chronic sleep-deprived rats（±s，n=8）

藥物治療7 d 后，與模型組比較，松郁安神方高、中劑量組大鼠的逃避潛伏期及到達(dá)平臺(tái)的總距離明顯縮短（P＜0.05），穿越平臺(tái)的次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，慢性睡眠剝奪后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，而松郁安神方能提高慢性睡眠剝奪大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

2.3 松郁安神方對(duì)慢性睡眠剝奪大鼠海馬組織中IL-1β、IL-18 水平的影響結(jié)果見圖5。正常組和大平臺(tái)組比較，大鼠海馬組織中IL-1β、IL-18 含量無(wú)明顯變化（P＞0.05）。與大平臺(tái)組比較，模型組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-18 含量明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，松郁安神方高、中劑量組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-18 含量均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，慢性睡眠剝奪模型大鼠海馬組織中IL-1β、IL-18 含量明顯升高，而松郁安神方能降低模型大鼠海馬組織中的IL-1β、IL-18水平。

圖5 松郁安神方對(duì)慢性睡眠剝奪大鼠海馬組織中IL-1β、IL-18 水平的影響（±s，n=6）Figure 5 Effects of Songyu Anshen Prescription on levels of IL-1β and IL-18 in hippocampus of chronic sleep-deprived rats（±s，n=6）

2.4 松郁安神方對(duì)慢性睡眠剝奪大鼠海馬組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖6。正常組與大平臺(tái)組比較，大鼠海馬組織NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。與大平臺(tái)組比較，模型組大鼠海馬組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05）。與模型組比較，松郁安神方高、中劑量組大鼠海馬組織中NLRP3、Caspase-1 蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），松郁安神方高劑量組大鼠海馬組織中ASC 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)果表明，慢性睡眠剝奪模型大鼠海馬組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)量明顯增加，而松郁安神方能抑制模型大鼠NLRP3炎性小體的表達(dá)。

圖6 松郁安神方對(duì)慢性睡眠剝奪大鼠海馬組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=5）Figure 6 Effects of Songyu Anshen Prescription on protein expressions of NLRP3，ASC and Caspase-1 in hippocampus of chronic sleepdeprived rats（±s，n=5）

3 討論

多平臺(tái)水環(huán)境法是剝奪大鼠睡眠的常用方法，該方法可完全剝奪大鼠快速眼動(dòng)（REM）睡眠，有效阻止其進(jìn)入深睡眠。研究[14-15]表明，睡眠對(duì)學(xué)習(xí)記憶有重要作用，睡眠剝奪可引起大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多平臺(tái)水環(huán)境法建立了慢性睡眠剝奪失眠大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪21 d 后，大鼠晝夜節(jié)律消失，毛發(fā)枯槁，體質(zhì)量明顯下降；進(jìn)一步通過(guò)水迷宮測(cè)試發(fā)現(xiàn)，模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，表現(xiàn)為逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，找到安全平臺(tái)的距離顯著增加，穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯減少。上述結(jié)果表明，該模型能較好地模擬失眠疾病的病理狀態(tài)。

睡眠是鞏固學(xué)習(xí)記憶以及維持免疫系統(tǒng)平衡的重要生理過(guò)程。睡眠剝奪可誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，增加腦內(nèi)促炎性細(xì)胞因子1L-1β 分泌，引起神經(jīng)元損傷，造成學(xué)習(xí)和記憶能力下降[14-15]。海馬組織是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的重要腦區(qū)，也是應(yīng)激激素作用的主要靶區(qū)，同時(shí)參與學(xué)習(xí)和記憶的優(yōu)化、鞏固。有研究[16-17]提示，睡眠剝奪能夠通過(guò)不同途徑損害神經(jīng)突觸可塑性，尤其是海馬區(qū)神經(jīng)元的可塑性，進(jìn)而損害海馬依賴性的學(xué)習(xí)記憶功能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪后，模型組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-18 含量明顯升高，而給予松郁安神方治療后IL-1β、IL-18含量明顯下降。結(jié)果提示，松郁安神方可能通過(guò)影響促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18 表達(dá)，調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性，從而改善學(xué)習(xí)記憶能力。

近年來(lái)研究[18]發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體在機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)中具有重要作用，其由胞內(nèi)固有免疫受體NLRP3、ASC 和Caspase-1 的前體組成，其中NLRP3 通過(guò)識(shí)別配體和危險(xiǎn)信號(hào)，ASC 募集和激活效應(yīng)蛋白，并與Caspase-1前體結(jié)合。Caspase-1是炎性小體的重要組成物質(zhì)，參與下游促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18 的成熟和釋放，誘導(dǎo)炎癥及免疫反應(yīng)[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪后模型大鼠海馬組織中NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，提示睡眠剝奪與大鼠海馬組織炎癥反應(yīng)相關(guān)。而給予松郁安神方治療后，NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，提示松郁安神方可能通過(guò)抑制NLRP3炎性小體激活，減輕海馬組織炎癥反應(yīng)。

綜上所述，松郁安神方可能通過(guò)抑制NLRP3炎性小體通路來(lái)調(diào)控促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18 的合成釋放，從而減輕睡眠剝奪大鼠的海馬組織炎性反應(yīng)，從而改善其學(xué)習(xí)記憶能力。本研究結(jié)果部分揭示了松郁安神方改善睡眠剝奪引起學(xué)習(xí)記憶障礙可能的分子機(jī)制，可為臨床治療睡眠障礙引起的認(rèn)知功能障礙提供科學(xué)依據(jù)，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。但松郁安神方是否還通過(guò)其他信號(hào)通路共同發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用仍有待進(jìn)一步深入研究。