人參皂苷Rg1 對(duì)膿毒癥所致心肌損傷大鼠NF-κB 磷酸化水平及炎癥相關(guān)通路的影響

荊 忻 胡 文 沈 佳 羅彩琴 楊 波 荊 忱

（深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，深圳 518000）

膿毒癥是機(jī)體對(duì)各種感染反應(yīng)失調(diào)而引起的全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙，具有發(fā)病率和病死率高、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、病情嚴(yán)重的特點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成休克［1-2］。心肌功能障礙是膿毒癥的常見(jiàn)并發(fā)癥，臨床主要表現(xiàn)為心室擴(kuò)張、舒張和收縮功能障礙［3］。但其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為可能與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、內(nèi)毒素及能量代謝等有關(guān)［4-6］。研究顯示心肌炎癥及炎癥信號(hào)持續(xù)激活是膿毒癥心功能障礙的起始環(huán)節(jié)［7］。Toll 樣受體4/核因子-κB（Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB，TLR4/NF-κB）信號(hào)通路在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)早期扮演重要角色，尤其與心肌炎癥性損傷密切相關(guān)，NF-κB 通過(guò)誘導(dǎo)促炎因子IL-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達(dá)造成心肌損傷［8］。由于膿毒癥所致心肌損傷致死率高，同時(shí)缺乏安全有效的治療藥物，因此探討膿毒癥所致心肌損傷的發(fā)病機(jī)制和尋找治療藥物至關(guān)重要。人參皂苷Rg1是人參、三七的主要活性成分，具有抗炎、抗感染、抗腫瘤及免疫功能調(diào)節(jié)等作用［9］。大量研究表明人參皂苷Rg1 對(duì)膿毒癥具有很好的治療效果［10］。如卿城等［11］發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1通過(guò)抑制IL-6、TNF-α表達(dá)保護(hù)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞損傷。張振波等［12］發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1單獨(dú)或聯(lián)合抗生素亞胺培南均能治療膿毒癥小鼠急性肺損傷，改善小鼠肺組織炎癥性浸潤(rùn)、降低肺泡灌洗液NF-κB、IL-6、IL-1β、TNF-α水平。ZOU等［13］發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1通過(guò)減弱膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)及淋巴細(xì)胞凋亡提高小鼠存活率。人參皂苷Rg1對(duì)膿毒癥所致心肌損傷的保護(hù)機(jī)制仍未闡明，能否作為膿毒癥心肌損傷的治療用藥也需進(jìn)一步研究。

因此，本研究通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and perforation，CLP）法構(gòu)建大鼠膿毒癥心肌損傷模型及LPS 構(gòu)建體外膿毒癥細(xì)胞模型，探究人參皂苷Rg1 對(duì)NF-κB 磷酸化水平及炎癥相關(guān)通路的影響，為進(jìn)一步研究人參皂苷Rg1作為心肌功能障礙的治療用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～230 g，購(gòu)自北京生物制品研究所有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（京）2020-0031。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫23～25 ℃、標(biāo)準(zhǔn)濕度55%～60%、12 h/12 h晝夜交替、正常飼料飲水、分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20201521）。

1.1.2 主要試劑和儀器 人參皂苷Rg1（寶雞市晨光生物科技有限公司）；瑞沙托維（TAK-242，上海源葉生物科技有限公司）；LPS（北京索萊寶生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI雙染色法凋亡檢測(cè)試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponin Ⅰ，cTnⅠ）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）ELISA 試劑盒（默沙克生物科技有限公司）；TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK）、p-p38MAPK、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）抗體（美國(guó)Selleck 公司）；二抗（北京博爾西科技有限公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Thermo 酶標(biāo)儀（上海熱電儀器有限公司）；組織包埋機(jī)（德國(guó)Leica公司）；臺(tái)式冰凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman 公司）；Bio-Rad蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及模型制作 60 只大鼠隨機(jī)分為6 組：假手術(shù)組（sham 組）、膿毒癥模型組（CLP 組）、人參皂苷Rg1 低劑量組（CLP+Rg1L組）、人參皂苷Rg1 中劑量組（CLP+Rg1M組）、人參皂苷Rg1 高劑量組（CLP+Rg1H組）、TLR4 信號(hào)通路抑制劑瑞沙托維（TAK-242）組（CLP+TAK-242 組），每組10 只。各組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，固定后沿腹白線切開(kāi)約2 cm，打開(kāi)腹腔并找到盲腸，用3-0 絲線結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端，22 號(hào)針頭穿刺兩處，輕輕擠壓盲腸將少量糞便擠至腹腔，還納盲腸，逐層縫合腹壁切口。sham 組僅探查盲腸不進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔。各組大鼠術(shù)后腹腔注射30 ml/kg 生理鹽水進(jìn)行復(fù)蘇。48 h后大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、食欲減退，解剖發(fā)現(xiàn)腸腔粘連、水腫、出血，即為造模成功。CLP+Rg1L組、CLP+Rg1M組、CLP+Rg1H組腹腔注射5、10、20 mg/kg 人參皂 苷Rg1［14］，CLP+TAK-242 組腹腔注射3 mg/kg TAK-242；sham 組、CLP 組腹腔注射等量生理鹽水，于造模2 h、26 h、50 h 各給藥1 次，各組于末次給藥2 h 后麻醉大鼠測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，隨后處死大鼠，檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

1.2.2 細(xì)胞分組及模型制作 將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為6 組：對(duì)照組（control 組）、心肌細(xì)胞損傷組（LPS組）、LPS+Rg1L組、LPS+Rg1M組、LPS+Rg1H組、LPS+TAK-242 組。LPS+Rg1L組、LPS+Rg1M組、LPS+Rg1H組、LPS+TAK-242 組細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入終濃度為25、50、100 μmol/L 的人參皂苷Rg1 及10 μg/ml TAK-242預(yù)處理12 h，隨后與LPS組同時(shí)加入10 mg/L LPS 共培養(yǎng)6 h。control 組不進(jìn)行藥物干預(yù)。培養(yǎng)結(jié)束后各組分別收集細(xì)胞和上清，檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

1.2.3 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 各組大鼠麻醉處理，右頸總動(dòng)脈插管，PowerLab 系統(tǒng)測(cè)定平均動(dòng)脈壓（mean arterial blood pressure，MABP）、左心室發(fā)展壓（left ventricular development pressure，LVDP）、心率（heart rate，HR）、左心室壓力最大上升/下降速率（maximal increase/decrease rate of left ventricular pressure，±dp/dtmax）。

1.2.4 HE 染色觀察大鼠心肌組織病理學(xué)改變

取出4%多聚甲醛固定的心肌組織，石蠟包埋，切3 μm 片，二甲苯脫蠟、蘇木精-伊紅染色、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性膠封固，顯微鏡（×400）下觀察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及排列情況。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)大鼠心肌組織和H9C2 細(xì)胞凋亡 取大鼠心肌組織和H9C2 細(xì)胞，加入適量胰蛋白酶消化，70 μm 濾網(wǎng)過(guò)濾制成單細(xì)胞懸液，加入500 μl Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，再各加入10 μl Annexin V-FITC 和PI避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，NovoExpressTM軟件分析。

1.2.6 ELISA檢測(cè)大鼠血清和H9C2細(xì)胞心肌酶指標(biāo)及炎癥因子含量 取各組大鼠腹主動(dòng)脈血和H9C2細(xì)胞，腹主動(dòng)脈血離心后分離上清，H9C2細(xì)胞中加入1.0 ml PBS 冰上研磨，離心取上清，按ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行包被、加樣、加抗體、顯色、終止反應(yīng)，同時(shí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶標(biāo)儀于450 nm 處檢測(cè)吸光度，代入曲線計(jì)算CK、LDH、AST、cTnⅠ、TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.2.7 CCK-8 及EdU 染色檢測(cè)H9C2 細(xì)胞增殖能力 分別于24 h、48 h、72 h 取出培養(yǎng)的H9C2 細(xì)胞，10 μl/孔加入 CCK-8 溶液，每孔設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀于450 nm 處檢測(cè)吸光度。調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/孔并接種于24孔板，培養(yǎng)24 h，按照EdU 染色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色、固定、封片，LAS AF Lite圖像處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.8 RT-qPCR 檢測(cè)心肌組織TLR4、NF-κB p65、p38MAPK mRNA 表達(dá) 取大鼠心肌組織，采用Trizol法提取總RNA。將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SBRY super Mix 進(jìn)行擴(kuò)增，β-actin 作為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，共40 個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt計(jì)算TLR4、NF-κB p65、p38MAPK mRNA相對(duì)表達(dá)。PCR 引物序列TLR4 F：5′-ACTGCTCTGATATGATCGATAGCTAT-3′；TLR4 R：5′-TCGATAGCTAGATCGATTAGCTATGATCTAG-3′；NF-κB p65 F：5′-TGTTTCCCCTCATCTTTCC-3′，NF-κB p65 R：5′-GTGGTATCTGTGCTTCTCTCC-3′。p38MAPK F：5′-TACGCTAGATTTAGCTATAGCTAGGCGAACTC-3′，p38MAPK R：5′-ATCGCTAGATCGATATATCGATCGTAGCTAGCTA-3′。β-actin F：5′-GGAGATTACTGTTAGGCTCCTA-3′；β-actin R：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。

1.2.9 Western blot 檢 測(cè)心肌 組織TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38MAPK、p-p38MAPK、NLRP3蛋白表達(dá) 取凍存的心肌組織，加入RIPA 裂解液，超聲勻漿提取總蛋白，BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白沸水浴變性，取等量變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38MAPK、p-p38MAPK、NLRP3（1∶2 000）4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析發(fā)光結(jié)果灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，Graphpad5.0 軟件制圖，計(jì)量資料以表示，數(shù)據(jù)間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1對(duì)心肌損傷大鼠的保護(hù)作用

2.1.1 各組大鼠MABP 和心功能變化 心功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，與sham 組相比，CLP 組大鼠MABP、LVDP×HR 和±dp/dtmax絕對(duì)值明顯降低（P<0.05）；與CLP 組相比，CLP+Rg1L組、CLP+Rg1M組、CLP+Rg1H組和CLP+TAK-242 組大鼠MABP、LVDP×HR 和±dp/dtmax絕對(duì)值均明顯升高（P<0.05，圖1、表1），且呈劑量依賴性。

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（，n=10）Tab.1 Comparison of hemodynamic parameters of rats in each group（，n=10）

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（，n=10）Tab.1 Comparison of hemodynamic parameters of rats in each group（，n=10）

Note：Compared with sham group，1）P<0.05；compared with CLP group，2）P<0.05.

圖1 各組大鼠心功能變化比較Fig.1 Comparison of changes in cardiac function of rats in each group

2.1.2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)比較 HE 染色結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞染成紫紅色，細(xì)胞核染成藍(lán)色。sham 組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，組織結(jié)構(gòu)分布正常，未見(jiàn)間質(zhì)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；CLP組心肌纖維排列紊亂、斷裂，束間隔增寬，細(xì)胞腫脹及壞死，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；CLP+Rg1L組、CLP+Rg1M組、CLP+Rg1H組和CLP+TAK-242 組上述病理?yè)p傷明顯減輕，心肌纖維排列稍紊亂，存在少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且人參皂苷Rg1劑量越高，心肌損傷緩解越明顯（圖2）。

圖2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)比較（×400）Fig.2 Histopathological comparison of myocardial tissues of rats in each group（×400）

2.1.3 各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡比較 Annexin V-FITC/PI 雙染法結(jié)果顯示，與sham 組相比，CLP 組大鼠細(xì)胞凋亡水平明顯升高（P<0.05）；與CLP 組相比，CLP+Rg1L組、CLP+Rg1M組、CLP+Rg1H組和CLP+TAK-242 組大鼠細(xì)胞凋亡水平明顯降低（P<0.05，圖3），且呈劑量依賴性。

圖3 各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡比較Fig.3 Comparison of apoptosis in cardiomyocytes of rats in each group

2.1.4 各組大鼠血清心肌酶及肌鈣蛋白水平比較 ELISA結(jié)果顯示，與sham組相比，CLP組大鼠血清CK、LDH、AST 活力、cTn Ⅰ水平明顯升高（P<0.05）；與CLP 組相比，CLP+Rg1L組、CLP+Rg1M組、CLP+Rg1H組和CLP+TAK-242組大鼠血清CK、LDH、AST 活力、cTnⅠ水平明顯降低（P<0.05，表2），且呈劑量依賴性。

表2 各組大鼠心肌酶及肌鈣蛋白比較（，n=10）Tab.2 Comparison of myocardial enzymes and troponin of rats in each group（，n=10）

表2 各組大鼠心肌酶及肌鈣蛋白比較（，n=10）Tab.2 Comparison of myocardial enzymes and troponin of rats in each group（，n=10）

Note：Compared with sham group，1）P<0.05；compared with CLP group，2）P<0.05.

2.1.5 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 ELISA結(jié)果顯示，與sham 組相比，CLP 組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高（P<0.05）；與CLP 組相比，CLP+Rg1L組、CLP+Rg1M組、CLP+Rg1H組 和CLP+TAK-242 組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平明顯降低（P<0.05，表3），且呈劑量依賴性。

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（，n=10，pg/ml）Tab.3 Comparison of serum inflammatory factors levels of rats in each group（，n=10，pg/ml）

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（，n=10，pg/ml）Tab.3 Comparison of serum inflammatory factors levels of rats in each group（，n=10，pg/ml）

Note：Compared with sham group，1）P<0.05；compared with CLP group，2）P<0.05.

2.2 人參皂苷Rg1對(duì)損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

2.2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 CCK-8結(jié)果顯示，與control組相比，LPS組細(xì)胞存活能力明顯降低（P<0.05）；與LPS 組相比，LPS+Rg1L組、LPS+Rg1M組、LPS+Rg1H組和LPS+TAK-242 組細(xì)胞存活能力明顯升高（P<0.05，圖4A）。EdU 染色結(jié)果（圖4B）顯示，與control 組相比，LPS 組細(xì)胞EdU 陽(yáng)性比例明顯降低（P<0.05）；與LPS 組相比，LPS+Rg1L組、LPS+Rg1M組、LPS+Rg1H組和LPS+TAK-242組細(xì)胞EdU 陽(yáng)性比例明顯升高（P<0.05），且呈劑量依賴性。

圖4 各組細(xì)胞存活能力比較Fig.4 Comparison of cell viability in each group

2.2.2 各組細(xì)胞凋亡能力比較 Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示，與control 組相比，LPS 組細(xì)胞凋亡水平明顯升高（P<0.05）；與LPS 組相比，LPS+Rg1L組、LPS+Rg1M組、LPS+Rg1H組和LPS+TAK-242組細(xì)胞凋亡水平明顯降低（P<0.05，圖5），且呈劑量依賴性。

圖5 各組細(xì)胞凋亡能力比較Fig.5 Comparison of cell apoptosis ability in each group

2.2.3 各組細(xì)胞炎癥因子水平比較 ELISA 結(jié)果顯示，與control 組相比，LPS 組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6 水平明顯升高（P<0.05）；與LPS 組相比，LPS+Rg1L組、LPS+Rg1M組、LPS+Rg1H組和LPS+TAK-242組TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低（P<0.05，表4），且呈劑量依賴性。

表4 各組細(xì)胞炎癥因子水平比較（，n=10，pg/ml）Tab.4 Comparison of inflammatory factors levels in cells of each group（，n=10，pg/ml）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05.

2.3 人參皂苷Rg1 對(duì)大鼠心肌組織NF-κB 磷酸化水平及炎癥相關(guān)通路的影響 RT-qPCR 檢測(cè)各組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65、p38MAPK mRNA表達(dá)，Western blot 檢測(cè)TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38MAPK/p38MAPK、NLRP3 蛋白水平發(fā)現(xiàn)，與sham 組相比，CLP 組TLR4、NF-κB p65、p38MAPK mRNA和TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38MAPK/p38MAPK、NLRP3 蛋白水平明顯上調(diào)（P<0.05）；與CLP 組相比，CLP+Rg1L組、CLP+Rg1M組、CLP+Rg1H組和CLP+TAK-242 組TLR4、NF-κB p65、p38MAPK mRNA和TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38MAPK/p38MAPK、NLRP3蛋白水平明顯下調(diào)（P<0.05，表5、表6、圖6），且呈劑量依賴性。

表5 各組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65、p38MAPK mRNA表達(dá)比較（，n=10）Tab.5 Comparison of TLR4，NF-κB p65，p38MAPK mRNA expressions in myocardial tissues of rats in each group（，n=10）

表5 各組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65、p38MAPK mRNA表達(dá)比較（，n=10）Tab.5 Comparison of TLR4，NF-κB p65，p38MAPK mRNA expressions in myocardial tissues of rats in each group（，n=10）

Note：Compared with sham group，1）P<0.05；compared with CLP group，2）P<0.05.

表6 各組大鼠心肌組織TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38MAPK/p38MAPK、NLRP3蛋白表達(dá)比較（，n=10）Tab.6 Comparison of protein expressions of TLR4，p-NF-κB p65/NF-κB p65，p-p38MAPK/p38MAPK and NLRP3 in myocardial tissues of rats in each group（，n=10）

表6 各組大鼠心肌組織TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38MAPK/p38MAPK、NLRP3蛋白表達(dá)比較（，n=10）Tab.6 Comparison of protein expressions of TLR4，p-NF-κB p65/NF-κB p65，p-p38MAPK/p38MAPK and NLRP3 in myocardial tissues of rats in each group（，n=10）

Note：Compared with sham group，1）P<0.05；compared with CLP group，2）P<0.05.

圖6 各組大鼠心肌組織TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38MAPK/p38MAPK、NLRP3蛋白表達(dá)Fig.6 Expressions of TLR4，p-NF-κB p65/NF-κB p65，pp38MAPK/p38MAPK，NLRP3 protein in myocardial tissues of rats in each group

2.4 人參皂苷Rg1 對(duì)膿毒癥所致心肌損傷的作用機(jī)制 給予CLP處理的心肌組織和LPS處理的心肌細(xì)胞不同劑量人參皂苷Rg1，觀察人參皂苷Rg1 對(duì)心肌組織細(xì)胞凋亡、心功能、心肌酶及炎癥相關(guān)通路的影響，分析人參皂苷Rg1 治療膿毒癥所致心肌損傷的可能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1 能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖并抑制凋亡；通過(guò)升高M(jìn)ABP、LVDP×HR和±dp/dtmax絕對(duì)值改善心臟功能；降低心肌酶CK、LDH、AST 活力及cTnⅠ水平減輕心肌損傷；降低TNF-α、IL-1β、IL-6、NLRP3水平抑制炎癥反應(yīng)；同時(shí)NF-κB p65、p38MAPK 磷酸化水平降低。推斷人參皂苷Rg1 通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB、p38MAPK 信號(hào)通路緩解膿毒癥所致心肌損傷（圖7）。

圖7 人參皂苷Rg1對(duì)膿毒癥所致心肌損傷的作用機(jī)制Fig.7 Mechanism of action of ginsenoside Rg1 on sepsisinduced myocardial injury

3 討論

膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)，導(dǎo)致危及生命的組織損傷和器官功能障礙，其中心肌損傷是膿毒癥的常見(jiàn)器官功能障礙，但其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、免疫功能障礙及線粒體功能障礙等［15-17］。目前臨床常用腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、cTnⅠ水平及超聲心動(dòng)圖識(shí)別膿毒癥所致心肌功能障礙，尚無(wú)抑制心肌損傷的靶向藥物。人參皂苷Rg1 具有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能及促進(jìn)組織和血管再生等功效，廣泛用于各種心肌損傷疾病治療［18］。如重癥肺炎中，人參皂苷Rg1通過(guò)抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)大鼠心肌組織［14］。心肌缺血再灌注損傷中，人參皂苷Rg1 通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)能量代謝減輕心肌損傷和改善心臟功能［19］。糖尿病心肌病中，人參皂苷Rg1 通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)改善糖尿病大鼠心肌功能［20］。本研究通過(guò)CLP 法構(gòu)建大鼠膿毒癥心肌損傷模型及LPS 構(gòu)建體外細(xì)胞膿毒癥模型，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1能阻斷心肌細(xì)胞凋亡，減輕細(xì)胞炎癥水平，增強(qiáng)心功能，從而改善心肌損傷。說(shuō)明人參皂苷Rg1 對(duì)膿毒癥所致心肌損傷具有積極意義。

心肌纖維損傷壞死可增強(qiáng)心肌細(xì)胞膜通透性，大量釋放心肌酶進(jìn)入血液，使CK、LDH、AST、cTnⅠ等心肌損傷標(biāo)志物水平升高，其中CK、LDH 常作為反映心肌損傷程度的敏感指標(biāo)，cTnⅠ是心肌收縮的調(diào)節(jié)蛋白，是檢測(cè)心肌損傷的重要指標(biāo)；MABP、LVDP×HR 和±dp/dtmax等功能性指標(biāo)水平降低，MABP 反映血管張力變化，HR×LVDP 代表心臟做功，±dp/dtmax絕對(duì)值大小反映心臟收縮和舒張功能強(qiáng)弱［21-22］。如李賡等［23］研究表明人參皂苷Rg1 能夠降低D-半乳糖所致小鼠心肌梗死面積和CK-MB、LDH 水平，有效防止心肌損傷。陳延勛等［24］發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1通過(guò)平衡血管舒縮功能提高機(jī)體抗氧化酶活性，改善冠狀動(dòng)脈粥樣硬化大鼠心功能。本研究中人參皂苷Rg1 能降低大鼠血清CK、LDH、AST活力、降低cTnⅠ水平，升高M(jìn)ABP、LVDP×HR 和±dp/dtmax水平，且呈劑量依賴性。說(shuō)明人參皂苷Rg1能減輕心肌損傷，改善心功能。

膿毒癥中/晚期，大量炎癥因子釋放導(dǎo)致免疫細(xì)胞活性降低，其中TLR 通路研究最為廣泛，TLR4/NF-κB信號(hào)通路是膿毒癥致心肌損傷的重要通路之一。TLR4 受病原微生物攜帶的LPS 等物質(zhì)刺激后可激活I(lǐng)L-1 受體相關(guān)激酶、TNF 受體相關(guān)因子6，進(jìn)一步激活NF-κB 誘導(dǎo)酶使活化的NF-κB 發(fā)生核位移，誘導(dǎo)細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎因子。TNF-α、IL-6 能夠抑制Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)、降解cTnⅠ、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、影響線粒體功能等，在心肌組織炎癥反應(yīng)中扮演重要角色。另外，TLR4也可激活下游炎癥反應(yīng)指標(biāo)p38MAPK 磷酸化，活化的p38MAPK 不但能夠促進(jìn)白細(xì)胞聚集、活化，促進(jìn)細(xì)胞因子合成，還能調(diào)控炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終參與膿毒癥介導(dǎo)的心肌損傷［25］。國(guó)內(nèi)外也有大量報(bào)道證實(shí)TLR4/NF-κB、p38MAPK 信號(hào)通路活化參與膿毒癥肺損傷、心肌損傷及腎損傷等疾病發(fā)生［26-27］。如劉杰等［28］發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮調(diào)控TLR4/p38MAPK 通路抑制心肌炎癥反應(yīng)，減輕心肌病理改變，從而緩解膿毒癥大鼠心肌損傷。趙俊泉等［29］發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯通過(guò)抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)輔助性T 細(xì)胞1/2（helper T cell 1/2，Th1/Th2）平衡，減少炎癥介質(zhì)釋放，改善膿毒癥大鼠急性肺損傷。ZHONG 等［30］發(fā)現(xiàn)TNF 超家族成員LIGHT 通過(guò)激活TLR4 Myd88 NF-κB 信號(hào)通路加重LPS誘導(dǎo)的膿毒癥相關(guān)急性腎損傷炎癥并促進(jìn)腎臟損傷。本研究中人參皂苷Rg1能降低大鼠受損心肌組織和細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及NLRP3 水平，同時(shí)抑制NF-κB p65、p38MAPK 蛋白磷酸化水平，說(shuō)明人參皂苷Rg1 通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB、p38MAPK 信號(hào)通路減輕損傷心肌組織和細(xì)胞炎癥程度。

綜上，人參皂苷Rg1 能夠抑制心肌組織細(xì)胞凋亡及炎癥水平，提高心功能，從而減輕膿毒癥所致心肌損傷，其機(jī)制可能與TLR4/NF-κB、p38MAPK 信號(hào)通路有關(guān)。