谷氨酸棒桿菌細(xì)胞工廠育種策略以及高通量篩選技術(shù)的研究進(jìn)展

李業(yè),孟麗虹,嚴(yán)豪,白仲虎*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)3(清華大學(xué) 深圳國際研究生院生物醫(yī)藥與健康工程研究院,廣東 深圳,518000)

依靠不可再生原料的化工、能源、醫(yī)藥等傳統(tǒng)制造業(yè)以“高排放、高污染”的加工模式對生態(tài)環(huán)境造成巨大影響,在全球倡導(dǎo)發(fā)展綠色低碳循環(huán)經(jīng)濟(jì)體系的趨勢下,傳統(tǒng)制造業(yè)面臨綠色轉(zhuǎn)型的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1]。具有原料再生、過程高效清潔優(yōu)良特征的生物制造作為生物經(jīng)濟(jì)戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向,利用生物有機(jī)體進(jìn)行高質(zhì)量的綠色生產(chǎn),有望推動生物技術(shù)融合工業(yè)制造,變革未來物質(zhì)加工和生產(chǎn)模式,實現(xiàn)綠色可持續(xù)發(fā)展[2]。

工業(yè)微生物細(xì)胞工廠是綠色生物制造的前提,其利用天然可再生原料通過自身代謝網(wǎng)絡(luò)合成“高價值、低能耗”的各類物質(zhì),也可實現(xiàn)廢棄物回收利用,提高資源利用率[3]。目前微生物細(xì)胞工廠已廣泛應(yīng)用于輕工業(yè)、化工、能源、環(huán)保、生物防治等領(lǐng)域生產(chǎn)食品、藥品、生物環(huán)保材料和生物制劑等。但是,迄今為止我國自主研發(fā)的成熟高性能工業(yè)微生物細(xì)胞工廠仍然較少,其生產(chǎn)水平距國際大公司先進(jìn)工業(yè)微生物細(xì)胞工廠仍存在一定差距。因此,開展我國自主工業(yè)微生物細(xì)胞工廠的設(shè)計創(chuàng)制研究,是保障我國生物制造產(chǎn)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵[4]。

為了建立具有優(yōu)良性狀的高效微生物細(xì)胞工廠,對微生物為底盤的工業(yè)菌株進(jìn)行多維度的改造與構(gòu)建,通過多輪“設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)”(design-build-test-learning,DBTL)循環(huán)以達(dá)到以下目的[5]:(1)提高微生物細(xì)胞的生長速率;(2)擴(kuò)大底物譜及增強(qiáng)底物轉(zhuǎn)化效率;(3)提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量;(4)增強(qiáng)微生物底盤細(xì)胞的魯棒性和耐受性;(5)優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)分離方式,減少下游產(chǎn)業(yè)成本等。對此研究人員融合“建物致知”和“建物致用”的理念開發(fā)了許多育種策略,主要包括傳統(tǒng)的誘變育種策略和新型的理性、非理性育種策略以創(chuàng)制微生物細(xì)胞工廠[6]。

由于谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)具有公認(rèn)食品安全(Generally Regarded As Safe, GRAS)的特性,已成為工業(yè)生產(chǎn)的模式微生物之一,被應(yīng)用于構(gòu)建綠色高效的微生物細(xì)胞工廠[7]。20世紀(jì)50年代后已被廣泛用于大規(guī)模生產(chǎn)L-氨基酸,隨著基因工程、代謝工程和分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,它也被用于工業(yè)生產(chǎn)高價值產(chǎn)品,包括有機(jī)酸、聚合物前體、高級醇和蛋白質(zhì)等。而該菌株的非致病性、無芽孢、迅速生長、無內(nèi)毒素,有完整的分泌途徑,胞外水解酶活性較低的優(yōu)良性狀使其備受關(guān)注[8]。近年來,基因編輯技術(shù)、代謝調(diào)控技術(shù)和高通量篩選技術(shù)的快速發(fā)展,顯著加速了工業(yè)菌種的改造提升與工業(yè)化應(yīng)用,也推動了生物制造領(lǐng)域的進(jìn)步[9]。本文針對谷氨酸棒桿菌的育種策略和高通量篩選結(jié)合實際案例進(jìn)行綜述,介紹了傳統(tǒng)及新型育種策略,并展望了生物技術(shù)與人工智能融合對未來微生物細(xì)胞工廠的潛在應(yīng)用。

1 谷氨酸棒桿菌育種策略

從自然界中分離得到的谷氨酸棒桿菌,其性狀遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要,因此如何對微生物底盤進(jìn)行提升,以獲得高產(chǎn)高效的工業(yè)微生物細(xì)胞工廠就成為了工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵。而微生物育種的策略主要包括傳統(tǒng)育種和新型育種,傳統(tǒng)育種方式主要采用誘變育種,是指在人為條件下,利用物理、化學(xué)、生物因素,誘發(fā)生物體產(chǎn)生突變,從中選擇、培育植物和微生物新品種的方法,而隨著合成生物學(xué)、代謝工程、基因編輯技術(shù)、多種組學(xué)以及各種交叉學(xué)科的深入研究,使得微生物細(xì)胞工廠創(chuàng)制技術(shù)得到了不斷的發(fā)展和創(chuàng)新[6],發(fā)展的新型育種包括非理性的重離子輻射、常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變育種、適應(yīng)性進(jìn)化育種,理性的基因編輯等,這些技術(shù)和手段都為獲得優(yōu)質(zhì)的微生物底盤細(xì)胞提供了便利[10]。

1.1 傳統(tǒng)育種策略

誘變育種作為傳統(tǒng)的微生物育種技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域,包括物理誘變、化學(xué)誘變、生物誘變及復(fù)合誘變[11]。如圖1所示,它不需要復(fù)雜的基因操作及代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控知識,方便快捷、成本較低及成功率較高,因此為微生物選育提供了便利。

圖1 提高重組蛋白產(chǎn)量的主要方法[11]Fig.1 The main method to increase the yield of recombinant protein[11]

物理誘變主要利用電離輻射如X-射線、γ-射線和來自放射性物質(zhì)及非電離輻射如紫外線、激光、微波等物理誘變因素,加速微生物的突變率。電離輻射能量極高,能使構(gòu)成基因的化學(xué)物質(zhì)直接發(fā)生電離作用,從而形成變異。非電離輻射的能量較低,只能產(chǎn)生激發(fā)作用,其中紫外線照射是最常采用的方法之一,紫外線可使DNA分子形成嘧啶二聚體,阻礙堿基正常配對,引起突變或死亡[12]。陳曉博等[13]通過紫外線誘變谷氨酸棒桿菌出發(fā)菌株BC001,用結(jié)構(gòu)類似物D-精氨酸平板篩選獲得高產(chǎn)L-精氨酸的BC307突變株,產(chǎn)量提升至2.94 g/L。

化學(xué)誘變主要利用一些化學(xué)物質(zhì)以提高生物的突變率,其可以使DNA分子發(fā)生烷化、錯配或移碼,影響mRNA的轉(zhuǎn)錄,造成功能蛋白重組,表型改變[14]。常用的化學(xué)誘變劑如烷化劑、堿基類似物、移碼誘變劑等。例如,ZHANG等[15]先通過沉默丙酮酸脫氫酶基因復(fù)合物并敲除乳酸脫氫酶基因,然后通過硫酸二乙酯誘變獲得高產(chǎn)3-甲基-1-丁醇的谷氨酸棒桿菌突變體,其產(chǎn)量高達(dá)659 mg/L。

生物誘變通過提高基因重組頻率獲得新的遺傳型,主要包括噬菌體、DNA轉(zhuǎn)座子誘變和原生質(zhì)體融合、基因組重排等。其中原生質(zhì)體融合是一種很重要的菌種改良技術(shù),可將遺傳性狀不同的親株細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)融合,借以獲得兼有雙親優(yōu)良性狀的穩(wěn)定重組子[16]。它打破了物種間界限,實現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組,為誘變育種提供了一種有效手段。張婧芳等[17]將谷氨酸棒桿菌GS538和谷氨酸高產(chǎn)菌S9114進(jìn)行原生質(zhì)體融合,定向選育出1株高產(chǎn)L-鳥氨酸的RH169菌株,產(chǎn)量可達(dá)19.3 g/L。

復(fù)合誘變是采用2種或多種誘變劑同時處理或先后使用。因為菌株長期使用同種誘變劑后,會產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”,同時會出現(xiàn)菌株生長周期延長、代謝減慢、回復(fù)突變等問題,而研究表明復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng),較單一因子誘變有很大優(yōu)勢[11]。例如,PARK等[18]用N-甲基-N-亞硝基-N′-硝基胍和紫外線處理谷氨酸棒桿菌AR0菌株,成功獲得耐10 g/L精氨酸羥酸酯和30 g/L刀豆氨酸的AR1突變菌株,AR1經(jīng)分批補(bǔ)料培養(yǎng)后L-精氨酸產(chǎn)量達(dá)34.2 g/L,比在相同條件下培養(yǎng)的AR0菌株獲得的L-精氨酸高2倍以上。

1.2 新型育種策略

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,多種新型育種策略的出現(xiàn)為創(chuàng)制工業(yè)微生物細(xì)胞工廠注入了新的活力,主要分為非理性的育種策略和理性的育種策略。非理性的育種策略包括重離子輻射、ARTP誘變技術(shù)及適應(yīng)性進(jìn)化等策略。理性育種策略是基于合成生物學(xué)、基因編輯技術(shù)及微生物代謝網(wǎng)絡(luò)的深入研究,應(yīng)用理性設(shè)計構(gòu)建優(yōu)良的微生物細(xì)胞工廠[19]。

1.2.1 非理性育種策略

相比存在一定的安全風(fēng)險的傳統(tǒng)育種技術(shù),近年來發(fā)展的新型育種技術(shù)[20]更加安全高效。例如重離子輻射、ARTP等有無毒無害、突變率高、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點,適應(yīng)性進(jìn)化具有能夠提供足夠的遺傳多樣性,積累豐富的有益突變體等特點,這些技術(shù)加速了優(yōu)良微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建。

重離子輻射在其穿透的路徑上有較大的能量沉積,產(chǎn)生很強(qiáng)的局部電離,與傳統(tǒng)的光子輻射相比具有較高的生物學(xué)相對效應(yīng),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物育種、疾病診斷和治療[21]。繆建順等[22]通過12C6+束輻照誘變谷氨酸棒桿菌,經(jīng)篩選后獲得谷氨酸高產(chǎn)菌株GM006,其產(chǎn)量最高達(dá)121.1 g/L,比原始菌株提高10.09%。

ARTP誘變是1種新近開發(fā)的安全物理誘變育種技術(shù)[23],如圖2所示,主要采用He作為誘變源,能夠在大氣壓下產(chǎn)生溫度在25～40 ℃的高活性粒子濃度的等離子體射流,包含多種化學(xué)活性粒子,如激發(fā)態(tài)的氦原子、氧原子、氮原子、·OH自由基等。這些粒子能夠改變微生物細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)及通透性,對遺傳物質(zhì)造成損傷,誘發(fā)生物細(xì)胞啟動容錯率高的SOS修復(fù)機(jī)制,從而獲得遺傳穩(wěn)定的突變菌株。與其他誘變方法相比,ARTP具有突變率高、突變頻譜廣、操作簡單、安全性高、環(huán)境友好等特點,目前已廣泛應(yīng)用于包括細(xì)菌、放線菌、真菌、酵母等在內(nèi)的100多種微生物誘變育種。例如,ZHAO等[24]通過ARTP誘變產(chǎn)生累積19.4 g/L的L-精氨酸的突變菌株,并通過發(fā)酵優(yōu)化進(jìn)一步提升L-精氨酸產(chǎn)量獲得高達(dá)71.3 g/L的突變株。LV等[25]利用ARTP誘變及高通量篩選獲得了高產(chǎn)L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌,發(fā)酵終質(zhì)量濃度為(25.7±2.7) g/L,并通過理性改造進(jìn)一步改善L-谷氨酰胺的生產(chǎn),使L-谷氨酰胺發(fā)酵終質(zhì)量濃度增加了186.0%,達(dá)到(73.5±3.1)g/L。

a-以直接作用模式使用大氣壓DBD等離子體處理生物體;b-以間接作用方式使用射頻APGD等離子體射流處理生物體圖2 ARTP誘變2種模式原理[23]Fig.2 Principle of two modes of ARTP mutagenesis[23]

對于缺乏遺傳背景或與表型特征相互影響的微生物,可以采用具有獨特優(yōu)勢的適應(yīng)性實驗室進(jìn)化(adaptive laboratory evolution,ALE)。ALE是在實驗室條件下,借助人工選擇壓力,通過微生物自發(fā)突變的不斷富集實現(xiàn)微生物的定向進(jìn)化,并從進(jìn)化群體中篩選優(yōu)良性狀個體的一種方法,其作為定向誘變已被廣泛應(yīng)用于提高微生物產(chǎn)物產(chǎn)量、生長速度、脅迫耐受力和底物利用率等研究[26]。例如TUYISHIME等[27]利用ALE成功獲得高甲醇利用率的谷氨酸棒桿菌,突變體在甲醇-木糖最小培養(yǎng)基上顯示出細(xì)胞生長增加20倍,并利用甲醇和木糖,物質(zhì)的量比達(dá)3.83∶1。KRüGER等[28]通過ALE增強(qiáng)谷氨酸棒狀桿菌的耐受性,使其適應(yīng)血紅素水平的增加,分離的菌株顯示出對濃度高達(dá)100 μmol/L的血紅素生長的高度耐受性。徐美娟等[29]還闡述了谷氨酸棒桿菌抗各種環(huán)境脅迫機(jī)制,并總結(jié)了提高谷氨酸棒桿菌魯棒性和耐受性的合成生物學(xué)新策略。

1.2.2 理性育種策略

隨著代謝工程、合成生物學(xué)及全基因組測序的發(fā)展,加速了研究人員對微生物代謝調(diào)控機(jī)制的深入了解,對微生物細(xì)胞工廠的創(chuàng)制也從非理性的育種策略轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼮槔硇缘挠N方式,其理性改造主要有以下策略[30]:

(1)生物合成元件及代謝途徑的挖掘和優(yōu)化[31]。經(jīng)典的基因表達(dá)調(diào)控元件包括5′非編碼區(qū)、啟動子、核糖體結(jié)合位點(ribosome-binding site,RBS)、終止子等能夠有效調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平,但由于細(xì)胞基因水平的調(diào)控是復(fù)雜的、多元化的過程,經(jīng)典的基因表達(dá)調(diào)控元件不能滿足精準(zhǔn)調(diào)控的強(qiáng)度,因此研究人員也開發(fā)了多種新型基因調(diào)控元件,如核糖開關(guān)、核酸適配體等,在調(diào)控蛋白表達(dá)水平、改變細(xì)胞物質(zhì)代謝等過程中發(fā)揮了重要作用。例如,WEN等[32]將谷氨酸棒桿菌S9114進(jìn)行代謝工程改造,并調(diào)節(jié)基因odhA的RBS序列以減弱α-氧戊二酸脫氫酶復(fù)合物活性,實現(xiàn)谷氨酸在生物素過量的玉米秸稈水解物中的高效積累,使谷氨酸積累量升高6倍以上。

基因編輯技術(shù)的發(fā)展使研究人員能夠更為理性的改善微生物底盤的自身性能,可以挖掘內(nèi)源性物質(zhì)代謝途徑,并利用過表達(dá)代謝途徑中的關(guān)鍵基因,消除產(chǎn)物反饋抑制等方式進(jìn)行優(yōu)化,也可以通過對代謝網(wǎng)絡(luò)的解析,構(gòu)建異源代謝的最佳途徑,從而提高目標(biāo)產(chǎn)物合成路徑的精確性[7]。例如WANG等[33]通過敲除ltbR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,過表達(dá)L-亮氨酸合成途徑的關(guān)鍵基因,包括ilvC、leuDH、rocG,從而獲得L-亮氨酸產(chǎn)量達(dá)(23.31±0.24) g/L的高產(chǎn)菌株。

(2)代謝流量動態(tài)調(diào)控

細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,對微生物底盤進(jìn)行單一調(diào)控元件或代謝途徑的改造可能會引起代謝失衡,不利于構(gòu)建高效的工業(yè)化微生物細(xì)胞工廠,因此對微生物底盤進(jìn)行全局性的代謝流量動態(tài)調(diào)控是必要的。常用的代謝流量動態(tài)調(diào)控策略包括調(diào)控關(guān)鍵酶、強(qiáng)化底物利用過程中的能量供給、優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物合成過程中的碳通量和氧化還原平衡等[34]。

細(xì)胞的代謝通過“基因-酶-反應(yīng)”組成了基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型,多種酶參與的代謝途徑普遍存在代謝失衡,導(dǎo)致中間代謝物積累,影響目標(biāo)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率。因此,可以通過強(qiáng)化關(guān)鍵酶的性能和產(chǎn)量、削弱支路副產(chǎn)物的關(guān)鍵酶,來提高代謝途徑的整體催化效率。優(yōu)化底物利用過程中能量供給以提高利用率,也可以通過構(gòu)建廉價碳或氮源底物利用途徑來降低能源成本。細(xì)胞在代謝過程中會產(chǎn)生和消耗能量,若供給量小于需求量,會影響目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率,因此需要對代謝途徑中碳通量和氧化還原平衡進(jìn)行優(yōu)化[35],實現(xiàn)動態(tài)調(diào)控。例如XU等[36]通過理性改造依賴于NAD(P)H的二氫二吡啶酸還原酶,改變了其氧化還原通量,從而提高了谷氨酸棒桿菌中L-賴氨酸的產(chǎn)量[2.93 g/(L·h)],其碳產(chǎn)量從0.35 g/g葡萄糖提高到0.44 g/g葡萄糖。

(3)大規(guī)?；蚓庉?/p>

隨著基因編輯技術(shù)、高通量篩選及生物信息學(xué)的發(fā)展,為創(chuàng)制綠色高效的微生物細(xì)胞工廠提供了更多有力工具。傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)基于同源重組以實現(xiàn)目的基因的敲除、敲入和突變,但由于其低效率限制了底盤細(xì)胞改造的效率和通量,不能滿足全基因組范圍大量基因編輯的需求。近年來,新一代基因編輯技術(shù) CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)展迅速,因其具有效率高、操作便捷、成本低等優(yōu)點,已廣泛應(yīng)用于多種真核和原核生物的基因組編輯。迄今為止,NCBI數(shù)據(jù)庫已經(jīng)收錄了79株全基因組測序的谷氨酸棒桿菌,且研究人員開發(fā)了完備的基因組編輯系統(tǒng),如CRISPR-Cas9系統(tǒng)、CRISPR-Cpf1/dCpf1系統(tǒng)及RE-CRISPR系統(tǒng)等,推動了谷氨酸棒桿菌底盤細(xì)胞的優(yōu)化改造[37]。目前主要通過“自上而下的基因組精簡”和“自下而上的基因組合成”2種策略進(jìn)行底盤細(xì)胞構(gòu)建。LIU等[38]通過優(yōu)化谷氨酸棒桿菌的CRISPR系統(tǒng)并利用CRISPR輔助的染色體編輯和CRISPRi陣列篩選用于工程關(guān)鍵酶,微調(diào)代謝通量和提高L-脯氨酸產(chǎn)量,最終獲得L-脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到142.4 g/L的高產(chǎn)菌株。SUN等[39]建立了基于人工合成sRNA的基因表達(dá)沉默技術(shù),實現(xiàn)了染色體基因表達(dá)的快速下調(diào),單基因弱化效率達(dá)到80%以上。

2 高通量篩選技術(shù)

微生物細(xì)胞工廠通過理性/非理性的改造,會產(chǎn)生大量非目標(biāo)性的個體,尤其是非理性改造會產(chǎn)生大型突變文庫,需要從其中篩選出理想性狀的底盤細(xì)胞具有很大挑戰(zhàn)性。傳統(tǒng)的瓊脂平板篩選法、搖瓶篩選方法和微孔板篩選方法是目前最常用的篩選方法,其作為簡單易行的初篩方法,可用于排除大量無活性和極低活性的微生物。但由于微生物改造所產(chǎn)生的巨大文庫,通過傳統(tǒng)篩選方式不僅通量低、效率低下且成本昂貴。為克服以上問題,近年來已開發(fā)了多種高通量篩選技術(shù)及設(shè)備[40],如自動化液體處理平臺、熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)(fluorescence-activated cell sorting,FACS)、液滴微流控分選技術(shù)(droplet-based microfluidic sorting,DMFS)和基于生物傳感器篩選策略等,用于高效篩選具有目標(biāo)性狀的微生物底盤細(xì)胞。

2.1 高通量自動化液體處理平臺

早期的高通量篩選主要采用多孔板進(jìn)行微生物細(xì)胞的檢測篩選,可以實現(xiàn)樣品與試劑的添加、培養(yǎng)和檢測,包括24、48、96和384孔板。多孔板培養(yǎng)結(jié)合自動化液體處理平臺,每天處理樣品高達(dá)104個,顯著提升篩選速率。目前已經(jīng)開發(fā)了多種全自動處理工作站,利用軟件程序推動自動化液體處理平臺與多種檢測儀器組合的無縫集成[41],包括微孔板檢測儀、細(xì)胞成像系統(tǒng)、洗板機(jī)、分液器、自動培養(yǎng)箱和儲板器等,極大縮短了手動操作時間,通過更高效的工作流程提高實驗室生產(chǎn)率,這些系統(tǒng)已應(yīng)用于微生物工程菌株選育、藥物篩選、微生物高內(nèi)涵分析等,是不可或缺的初期醫(yī)藥研發(fā)工具。例如RAJ等[42]開發(fā)了一種環(huán)保的高通量自動化篩選平臺,能夠快速有效地建立表型酶和微生物菌株的微孔板篩選實驗,加速實現(xiàn)DBTL循環(huán),研究者成功利用該平臺在厭氧條件下生產(chǎn)烯酸還原酶,并進(jìn)行了烯酸還原酶最大活性的最佳pH值篩選,發(fā)現(xiàn)其在pH 5～6下工作最佳。

2.2 熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)

FACS是流式細(xì)胞術(shù)的一種特殊技術(shù)[43],如圖3所示,它是利用激光束激發(fā)將基因型和表型偶聯(lián)的微生物細(xì)胞中的熒光標(biāo)記物,通過光學(xué)系統(tǒng)收集并分析每個細(xì)胞的光散射和熒光信號,再根據(jù)設(shè)定的參數(shù)將細(xì)胞按照特定的性質(zhì)進(jìn)行分選,分選速率高達(dá)107克隆/h,是一種高效分析和分選微生物細(xì)胞的工具,也是目前最常用和成熟的細(xì)胞高通量篩選技術(shù),已廣泛應(yīng)用于新藥研發(fā)、醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷等多種領(lǐng)域中。例如ZHANG等[44]通過ARTP誘變提高谷氨酸ΔSSAAI菌株的L-絲氨酸產(chǎn)率,構(gòu)建了基于NCgl0581響應(yīng)L-絲氨酸的濃度的生物傳感器,利用FACS從大型誘變庫中成功分選出高產(chǎn)L-絲氨酸的谷氨酸C36-pDser菌株,累積量為34.78 g/L,蔗糖產(chǎn)量為0.35 g/g,分別比親本菌株高35.9%和66.7%。

圖3 流式細(xì)胞分選原理簡圖[43]Fig.3 Schematic diagram of flow cell sorting[43]

2.3 液滴微流控分選技術(shù)

近年來,DMFS發(fā)展迅速,已成為強(qiáng)大的超高通量篩選工具[45],其通過液滴生成、液滴培養(yǎng)及液滴檢測分選,從大量的液滴中分離出目標(biāo)液滴,獲得高效的微生物底盤細(xì)胞。納升至皮升級液滴作為微反應(yīng)器,常采用油包水的形式做區(qū)室化反應(yīng),同時適用胞內(nèi)表達(dá)和胞外分泌,具有通量高、速度快、體積微小、均一性好、單分散性良好等特點,為醫(yī)藥、食品、環(huán)保研究等搭建了一個全新的平臺。目前液滴微流控技術(shù)已經(jīng)在生命科學(xué)研究中有不同的應(yīng)用[46],例如高通量篩選細(xì)胞藥物、單細(xì)胞組學(xué)研究,并結(jié)合細(xì)胞測序形成單細(xì)胞高通量液滴測序技術(shù),以繪制整個細(xì)胞亞群的基因組圖譜、適應(yīng)性進(jìn)化、開發(fā)藥物輸送系統(tǒng)等。

基于不同的分選參數(shù)開發(fā)了有多種檢測技術(shù),典型的檢測技術(shù)如熒光激活液滴分選技術(shù)(fluorescence-activated droplet sorting,FADS),它的應(yīng)用最為廣泛,已成為微生物工程菌株液滴分選的主要方式。JIANG等[47]綜述了不同分析物質(zhì)利用FADS研究的最新進(jìn)展,并根據(jù)熒光偶聯(lián)策略原理,將其分為4大類,包括熒光底物分析策略、酶聯(lián)熒光分析策略、基于生物傳感器熒光偶聯(lián)策略以及基于抗體親和力熒光偶聯(lián)策略。然而,有許多天然酶或代謝物是非熒光的,因此限制了FADS的適用性。為了克服這些問題,其他檢測技術(shù)也被開發(fā),例如吸光度激活液滴分選技術(shù)、吸光度激活液滴分選技術(shù)、質(zhì)譜液滴分選技術(shù)等。

目前基于DMFS開發(fā)了微型化、自動化、智能化的全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)儀(microbial microdroplet culture system,MMC),可用于單細(xì)胞微生物篩選,進(jìn)行生長曲線測定、壓力富集、適應(yīng)性進(jìn)化及菌種耐藥性研究等[48]。鄧?yán)诘萚49]利用ARTP誘變技術(shù)及MMC選育組氨酸結(jié)構(gòu)類似物的抗性突變株,成功從耐受3-氨基-1,2,4-三氮唑10 g/L和D-組氨酸8 g/L的抗性突變株中篩選得到谷氨酸棒桿菌Cg-F4,其L-組氨酸產(chǎn)量為0.561±0.016 g/L。YU等[50]建立第一個谷氨酸棒桿菌基因組規(guī)模CRISPRi干擾文庫,同時集成了FlAsH-四半胱氨酸驅(qū)動的FADS技術(shù),如圖4所示,開發(fā)了一個工程化高通量的CRISPRi-微流體篩選平臺,并成功應(yīng)用該平臺增強(qiáng)了谷氨酸棒狀桿菌中多種重組蛋白分泌產(chǎn)量。

2.4 基于生物傳感器的高通量篩選策略

生物傳感器是合成生物學(xué)和代謝工程的重要組成部分,可以將生物物質(zhì)濃度轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枴⒐庑盘柕纫子跈z測的信號,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析速度快的特點,因此被認(rèn)為是動態(tài)調(diào)控、篩選理想表型的強(qiáng)大裝置。常用的生物傳感器主要包括基于熒光蛋白的生物傳感器、基于核酸的生物傳感器、基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的生物傳感器和基于雙組分系統(tǒng)的生物傳感器等[51]。近年來生物傳感器已應(yīng)用于目標(biāo)化合物濃度檢測、高通量篩選、定向進(jìn)化和代謝動態(tài)控制等方面,為加快構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠提供了有力工具。STELLA等[52]開發(fā)了一種基于轉(zhuǎn)錄因子的生物傳感器,通過整合pfkA和Lrp,將谷氨酸棒狀桿菌的生長與支鏈氨基酸的細(xì)胞內(nèi)濃度耦合,從而增強(qiáng)氨基酸的產(chǎn)生。TAN等[53]利用L-異亮氨酸生物傳感器篩選得到對L-異亮氨酸響應(yīng)增強(qiáng)的突變啟動子PbrnFE7,獲得高產(chǎn)4-羥基-L-異亮氨酸谷氨酸棒桿菌ST17,產(chǎn)量達(dá)到135.3 mmol/L。

3 展望

微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建以滿足工業(yè)需求為導(dǎo)向加快市場應(yīng)用,經(jīng)過多年的研究積累,谷氨酸棒桿菌從誘變育種到基于先驗知識和模擬計算理性設(shè)計,利用新型技術(shù)對微生物底盤進(jìn)行改造,達(dá)到“建物致用”的目標(biāo),應(yīng)用基因型-表型關(guān)聯(lián)技術(shù),通過高通量篩選獲得不同特性的工業(yè)微生物細(xì)胞工廠,極大提高了谷氨酸棒桿菌細(xì)胞工廠的創(chuàng)制效率,然而細(xì)胞工廠物質(zhì)和能量代謝受時空的影響及復(fù)雜多元化的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍然是制約其工業(yè)應(yīng)用的瓶頸[54]。盡管目前的改造和檢測手段眾多,能夠從多方面獲取不同優(yōu)良性狀的微生物底盤,但目前的技術(shù)和日益增長的微生物細(xì)胞工廠需求依然存在巨大差異,缺乏對多層次信息的理解和應(yīng)用。

隨著合成生物學(xué)、生物信息學(xué)及人工智能的發(fā)展,有望克服這些難題,使得包括先進(jìn)的人工智能輔助設(shè)計、復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)動態(tài)調(diào)控、基因組編輯、超高通量篩選、智能檢測、智能自動化生物平臺在內(nèi)的前沿技術(shù)的結(jié)合將合成生物推向下一個階段[55],實現(xiàn)生物制造到生物智造的變革,突破合成生物學(xué)科技創(chuàng)新,開發(fā)出更為經(jīng)濟(jì)、高效、可持續(xù)發(fā)展的工業(yè)微生物細(xì)胞工廠,加快推動生物智造在輕化工、醫(yī)藥、能源等領(lǐng)域的規(guī)?；瘧?yīng)用,完善生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系,使生物經(jīng)濟(jì)實現(xiàn)高質(zhì)量發(fā)展。