微藻中蛋白質(zhì)的提取方法研究進展

孟丹陽,杜艷,2*,陳復生*

1(河南工業(yè)大學 糧油食品學院,河南 鄭州,450001)2(河南工業(yè)大學 小麥和玉米深加工國家工程研究中心,河南 鄭州,450001)

微藻是一類結構簡單、形態(tài)微小的水生生物,含有葉綠體,能夠進行光合作用吸收CO2,生產(chǎn)有機物。微藻的生物固碳能力較強,光合效率是陸地植物的10～50倍[1],可緩解由大氣中CO2濃度升高引起的溫室效應等環(huán)境問題,是實現(xiàn)“碳中和”的有效途徑。此外,微藻往往通過二分裂式繁殖,細胞生長周期短,在惡劣環(huán)境中的生存能力強。與傳統(tǒng)農(nóng)作物相比,微藻的養(yǎng)殖方式靈活且不占用耕地資源,是極具經(jīng)濟和環(huán)保價值的新食品原料之一,受到學者的廣泛關注。

微藻種類繁多,目前已發(fā)現(xiàn)超過15.7×104種[2],其中用于大規(guī)模養(yǎng)殖或生產(chǎn)的微藻主要分為4個藻門:藍藻門、綠藻門、紅藻門和金藻門。我國已批準可作為新食品原料的微藻及其主要成分分布如表1所示。作為一種良好的新型蛋白質(zhì)來源,微藻蛋白不僅含量豐富,且氨基酸組成全面均衡,營養(yǎng)價值極高,可添加于食品或用于營養(yǎng)補劑和保健食品的開發(fā)。此外,微藻蛋白能夠調(diào)節(jié)機體健康和預防疾病,具有抗疲勞、降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗血栓等功效[3-6],因此可被用于制作護膚品、化妝品、藥物、疫苗等。LIU等[7]研究了螺旋藻蛋白對小鼠皮膚創(chuàng)傷修復的潛在機制,證明了螺旋藻蛋白具有促進小鼠皮膚創(chuàng)傷修復的作用。此外,藻紅蛋白、藻藍蛋白等還具有良好的熒光特性和光敏特性,在分子探針、熒光染料等的研制方面應用廣泛[8-10]。

表1 我國已批準可作為新食品原料的微藻及其主要成分分布Table 1 Microalgae that have been approved as new food raw materials in China and their main components

微藻蛋白質(zhì)的提取一般包括培養(yǎng)采收、濕藻干燥、破壁提取和分離純化。由于微藻種類繁多,細胞壁結構、組成差異較大,且大都堅韌難以破壞,使得高效打破微藻細胞壁,釋放胞內(nèi)活性物質(zhì)成為微藻蛋白質(zhì)提取的關鍵。因此本文主要從破壁的角度,綜述了提取微藻蛋白質(zhì)的方法,闡明現(xiàn)有常規(guī)方法的研究進展以及各方法的優(yōu)勢與不足,旨在為高效提取微藻中的蛋白質(zhì)提供指導,促進微藻及其蛋白產(chǎn)品的高值化利用。

1 傳統(tǒng)微藻蛋白提取方法

微藻蛋白的提取方法可分為機械法和非機械法。機械方法主要是通過物理手段,打破細胞屏障,破壞植物細胞壁,使微藻蛋白從細胞中釋放出來,常用的有超聲波、球磨、高壓均質(zhì)和脈沖電場等。非機械法有反復凍融法、水酶法和離子液體提取等[11]。

1.1 機械方法

1.1.1 球磨法

球磨法是一種機械細胞破碎方法,所用設備為球磨機,小球直徑通常小于1 mm;經(jīng)過攪拌器使得微藻細胞懸液與珠子之間充分混合,通過珠子與細胞之間的互相碰撞、剪切,造成細胞壁破裂促進胞內(nèi)物質(zhì)溶出[12](圖1-a)。球磨法由于細胞破碎率高、通量高以及良好的溫度控制而備受關注,且勞動力強度低、細胞破碎連續(xù)化程度高,易于工業(yè)化實施。迄今為止,使用球磨機破碎微藻細胞壁釋放微藻蛋白等活性成分的研究多有報道。

a-球磨法;b-超聲輔助法;c-高壓均質(zhì)法;d-脈沖電場法;e-離子液體法圖1 微藻蛋白質(zhì)提取作用機理圖Fig.1 Mechanism of protein extraction from microalgae

ALAVIJEH等[13]為了提取小球藻蛋白質(zhì),采用球磨機對小球藻的細胞壁進行破碎處理,結果表明,僅0.5 min后,大約10%的可溶性蛋白質(zhì)被釋放出來。隨著接觸時間的增加,微珠與微藻細胞的接觸面增加,導致更多的細胞破碎,8 min后可溶性蛋白的釋放率達到40%。對球磨后得到的微藻蛋白進行了SDS-PAGE結果顯示蛋白質(zhì)組成并未發(fā)生變化,保留了蛋白質(zhì)原有功能活性。該結果證實了球磨處理破壞微藻細胞壁的有效性,同時,球磨過程可以通過控制操作條件,保證微藻蛋白的結構不被破壞,保留其功能活性。SAFI等[14]在微擬球藻細胞破碎能耗及水溶性蛋白溶出的研究表明,球磨法在20 min內(nèi)細胞破碎率達到95%以上,蛋白質(zhì)提取率為53%,能量消耗小于0.5 kWh/kg微藻生物量。類似的效果在SUAREZ GARCIA等[15]的研究中也有體現(xiàn),在0.433 kWh/kg微藻生物量的中低等能耗條件下,球磨8 min可在可溶性相中釋放近95%的蛋白質(zhì)。

球磨過程所用能耗較大,如何降低能耗,提高蛋白回收率是球磨過程的一大難題,往往需要大量的優(yōu)化試驗確定最佳的提取條件,珠料和尺寸、腔填充率、懸浮液濃度、攪拌速度、停留時間和喂料率都是重要的影響因素。LIU等[16]對球磨、離心和微過濾回收小球藻蛋白質(zhì)的工藝條件進行了優(yōu)化實驗,得出球磨過程懸浮液濃度為60 g/L,溫度10 ℃,離心裂解稀釋液濃度為30 g/L,pH為7,溫度20 ℃,微濾體積減小率為3時,蛋白回收率為12%,回收每克蛋白質(zhì)的能量消耗為10 kWh。在球磨懸浮液濃度為90 g/L,pH為7,稀釋液濃度為30 g/L,添加0.1 mol/L NaCl,溫度20 ℃,微濾體積減小率為20時,蛋白回收率可達25%。POSTMA等[17]研究了珠子尺寸與蛋白質(zhì)提取率的關系,顆粒越小,動力學速率越高,比能耗最小。此外,球磨過程的比能耗還與微藻的種類、干細胞質(zhì)量濃度和微藻的培養(yǎng)條件有關[11]。珠磨處理具有溫和高效的特點,但需冷卻裝置控制珠磨的溫度,溫度對微藻蛋白的功能活性有顯著的影響[18]。

1.1.2 超聲輔助提取

超聲波處理技術由于在處理低劑量樣品時操作簡便、損失較少,在實驗室已普遍應用于細胞破碎處理。超聲波能用于破碎細胞壁歸功于超聲波產(chǎn)生的微尺度渦流和高效傳質(zhì),以及氣泡的生成、變大到最后的破碎形成的空化效應。超聲波通過將微藻暴露于高強度的超聲波而引起細胞破裂,致使液體介質(zhì)細胞產(chǎn)生微小的不穩(wěn)定的空化氣泡,由于空化效應,氣泡爆炸產(chǎn)生沖擊波和能量,形成的高剪切力最終破壞剛性細胞壁并釋放胞內(nèi)物質(zhì)(圖1-b)[19]。

MITTAL等[20]首次報道了利用超聲波法對大型海洋藻類中的藻紅蛋白(R-phycoerythrin,R-PE)和藻藍蛋白(R-phycocyanin,R-PC)進行初步提取。對超聲處理進行優(yōu)化后,其單獨使用的蛋白提取率并不理想,因此考慮與其他方法聯(lián)合使用。結果表明,當超聲與其他常規(guī)一次提取方法聯(lián)合使用時,觀察到協(xié)同效應。與超聲聯(lián)合均質(zhì)比單獨均質(zhì)可提高9.3%的效率。同樣,浸軟結合超聲波處理比單獨浸軟處理的效率提高了31%。在所有提取方法中,浸軟結合超聲的提取效率最高,R-PE和R-PC的提取率分別為77%和93%,其次是超聲均質(zhì)(R-PE和R-PC的提取率分別為69.6%和74.1%)。采用高效液相色譜法分析,以確保提取物中存在R-PE,并在處理后仍保持完整。顯微研究表明,在給定的初步提取方法中,藻膽蛋白的提取效率與細胞破壞程度之間存在明顯的關系。這些組合方法可有效地從大藻中提取藻膽蛋白,類似的規(guī)律在微藻蛋白的提取中也同樣適用。張會香等[21]比較了反復凍融法、超聲波破碎法和超聲結合反復凍融提取地木耳藻藍蛋白的效果,當超聲波輔助反復凍融法時,藻藍蛋白的提取率是反復凍融法的3.8倍,超聲波法的1.1倍。表明了超聲波輔助的有效性。余佳等[22]通過比較直接水提法和超聲波輔助水提法,證實了超聲波輔助有助于葛仙米藻膽蛋白的提取。HILDEBRAND等[23]在超聲輔助下,用0.4 mol/L NaOH溶液和4 mol/L HCl溶液連續(xù)溶劑萃取小球藻蛋白,蛋白回收率為(79.1±5.3)%,比未超聲處理的對照組提高了1.32倍。同樣,YOSHIDA 等[24]也證實了超聲處理能夠提高鹽溶液對紅藻中藻藍蛋白的提取效率。劉習軍[25]以超聲輔助球磨機對微擬球藻進行破壁,超聲波輔助使得球磨細胞破碎率達到95%的時間從35 min減少到了20 min,并降低了破壁過程的能耗。TAVAKOLI等[26]在試驗中發(fā)現(xiàn)超聲輔助溶劑提取藻藍蛋白,相比于未經(jīng)超聲處理的對照組具有顯著優(yōu)勢。并且,增加超聲時間會提高藻藍蛋白的濃度,但超聲時間超過20 min,可能會造成藻藍蛋白的降解,使產(chǎn)物含量下降。SOMMER等[27]在相同能耗下比較了反復凍融、脈沖電場、超聲處理和火花放電提取微藻蛋白的效率,結果表明超聲處理后的藻蛋白粗提液中濃度最高,達到53 mg/g。

超聲處理的高效性已被廣泛證實,然而超聲過程會產(chǎn)生熱效應,對微藻蛋白的穩(wěn)定性有一定影響,同時,超聲處理所需能耗高,常用于實驗室少量樣品的處理,實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還需解決能量消耗的問題。

1.1.3 高壓均質(zhì)

高壓均質(zhì)是工業(yè)上常用的細胞破壁技術之一,其破壁主要是依靠細胞受到高速撞擊力和高壓剪切力,在突變壓差及產(chǎn)生的氣泡空化效應作用下最終使得細胞破裂[28](圖1-c)。目前,高壓均質(zhì)技術具有較為成熟的工業(yè)設備,得到廣泛應用。

ZHANG等[29]研究超聲及高壓均質(zhì)對凱氏擬小球藻的破壁效率,超聲處理后的微藻細胞體中出現(xiàn)了空隙、孔洞和微小裂縫,但該變化在掃描電鏡圖像中并不明顯,而超聲后再對微藻進行高壓均質(zhì),可從掃描電鏡圖像中明顯看出大多數(shù)細胞發(fā)生破裂,細胞壁喪失完整性,表明了高壓均質(zhì)破壁的高效性。此外,ZHANG等[30]比較了高壓放電與高壓均質(zhì)對釋放凱氏擬小球藻胞內(nèi)化合物的影響,高壓放電技術能有效提取微藻離子細胞組分及碳水化合物,但對蛋白的提取率不超過15%,而高壓均質(zhì)有利于所有組分的釋放,其蛋白提取率是高壓放電處理的4.9倍。該結論在證實高壓均質(zhì)的高效性同時,也顯示出了高壓均質(zhì)技術對目標產(chǎn)物不具備選擇性,因此可能會造成蛋白產(chǎn)品純度不足,需要進一步純化操作。

在CANELLI等[31]研究中,微藻細胞經(jīng)高壓均質(zhì)(high pressure homogenization,HPH)處理后,平均直徑由(5.1±0.1) μm減少到(2.0±0.1) μm,表明了該處理使微藻細胞發(fā)生解體,進一步支持了HPH是最有效的破壁方法之一,而且與酶處理相比,高壓均質(zhì)能獲得更高的蛋白回收率以及脂質(zhì)回收率。但是,高壓均質(zhì)獲得的產(chǎn)品其氧化穩(wěn)定性較差,因此如何獲得穩(wěn)定性更高的產(chǎn)品是高壓均質(zhì)需解決的問題。

高壓均質(zhì)的蛋白提取率與壓力的選擇有很大關系,在RUIZ-DOMNGUEZ等[32]研究中發(fā)現(xiàn),隨著壓力增加,極大螺旋藻中藻藍蛋白的提取率升高,但壓力從1 400 bar增加到1 600 bar過程中藻藍蛋白含量下降,在壓力1 400 bar時獲得藻藍蛋白含量最高(291.9 mg/g)的粗提液。

高壓均質(zhì)法與多數(shù)傳統(tǒng)方法相比具有易于擴大的顯著優(yōu)勢,利于工業(yè)化大規(guī)模樣品的處理。但是該法也存在對產(chǎn)物不具有選擇性、只適用于低濃度藻液、高能耗以及對細胞壁堅固的微藻破壁效果差等問題。與其他方法聯(lián)合使用可改善當前的不足,如ZHANG等[29]使用超聲處理和高壓均質(zhì)聯(lián)合可以提高提取效率并降低能耗。

1.1.4 脈沖電場

脈沖電場處理是依靠外部電場,使細胞壁達到臨界電勢,誘導細胞壁形成電穿孔,增加了細胞通透性,從而促進胞內(nèi)物質(zhì)的溶出[33](圖1-d)。脈沖電場并不會破壞細胞結構。其作用效果與溫度、介質(zhì)電導率、電場強度等有關。CARULLO等[34]研究了處理強度、脈沖極性和入口溫度對鈍頂螺旋藻細胞中蛋白質(zhì)和藻藍蛋白等水溶性化合物的損傷和萃取效率的影響。當場強為20 kV/cm,能量輸入從60 kJ/kg微藻懸浮液增加到100 kJ/kg微藻懸浮液時,上清液中蛋白質(zhì)的含量增加了2.7倍。當能量輸入為100 kJ/kg微藻懸浮液時,電場強度從10 kV/cm增加到20 kV/cm,蛋白質(zhì)含量也會顯著增加。這表明了蛋白質(zhì)的釋放與電場強度和能量輸入強相關。這與張若兵等[35]的結論一致。

脈沖電場處理是一種溫和的提取方式,只增加了細胞通透性,并未對細胞造成破壞,因此蛋白質(zhì)提取率往往不高,但蛋白純度較高。脈沖電場處理的提取效率與微藻種類有關。在CHITTAPUN等[36]的研究中,脈沖電場處理僅對念珠藻提取蛋白有效,而對顫藻無效。這與微藻的細胞壁結構有關,顫藻的細胞壁強度更大,因此脈沖處理的溫和條件不能使蛋白質(zhì)釋放。LEONHARDT等[37]也證實了這一點,脈沖電場對具有剛性細胞壁結構的微藻,提取作用微乎其微。

為了提高產(chǎn)率,將脈沖電場與其他方法結合是一種有效的途徑。CARULLO等[38]證實了高剪切均質(zhì)與脈沖電場聯(lián)合處理提取鈍頂螺旋藻的蛋白質(zhì),其水溶性蛋白和藻藍蛋白的提取率均比單獨使用脈沖電場時要高。在CARULLO等[34]此前的研究中發(fā)現(xiàn)溫和加熱也有助于提高脈沖電場處理的提取率。KFERB?CK等[39]報告了凍融和脈沖電場的協(xié)同作用,藻藍蛋白的釋放量是未脈沖電場處理3倍,藻藍蛋白的回收率為90%,純度達2.45,為高效提取提供了一種有效的選擇。也有研究在脈沖電場處理前加入酶降解細胞壁,去除細胞壁后的蛋白質(zhì)產(chǎn)量與僅脈沖電場處理相比增加了2倍以上[40]。

目前關于脈沖電場在微藻蛋白質(zhì)提取方面的應用尚處于初步階段,主要優(yōu)勢是處理條件溫和,可選擇性釋放水溶性蛋白質(zhì),獲得蛋白質(zhì)的純度高,節(jié)省了純化步驟。然而該法存在提取率低,不適合大量樣品的提取等問題,需要進一步研究脈沖電場處理的條件,以及考慮與其他方法的結合。

1.2 非機械法

1.2.1 反復凍融法

反復凍融法會使細胞內(nèi)形成冰晶,剩余細胞液鹽濃度增高,使細胞破裂,損壞細胞結構,釋放細胞內(nèi)目的產(chǎn)物。GHOSH等[41]在磷酸鹽緩沖液中對螺旋藻分別進行反復凍融、超聲波和人工破碎處理,其中凍融法獲得的藻紅蛋白回收率和純度均最高,總蛋白回收率也最高。采用反復凍融法提取微藻蛋白時,不同浸泡時間、料液比、凍融時間以及不同凍融次數(shù)都會對微藻蛋白提取率產(chǎn)生影響。俞建峰等[42]在研究中發(fā)現(xiàn)反復凍融次數(shù)為4次時,藻藍蛋白得率最高達到8.26%。羅愛國等[43]以鈍頂螺旋藻藻粉為試驗材料,采用反復凍融法提取藻藍蛋白。結果表明4個因素影響效果為:凍融時間最大,其次是凍融次數(shù)、浸泡時間,最后是料液比,最優(yōu)提取工藝條件為料液比1∶20(g∶mL)、浸泡時間22 h、凍融時間6 h、凍融次數(shù)6次。最優(yōu)條件下藻藍蛋白提取率可達近30%。CHITTAPUN等[36]用反復凍融法對2種不同的藍藻進行處理,結果表明緩沖液濃度和凍融循環(huán)次數(shù)均對蛋白質(zhì)提取率有顯著影響,細胞壁結構較為簡單的藍藻僅需3次循環(huán)釋放蛋白質(zhì)的濃度和純度即達最高值,而細胞壁結構更復雜的種類則需18個循環(huán)周期才可達最高濃度和純度。凍融循環(huán)次數(shù)過高還會造成蛋白質(zhì)的降解。因此對不同物種的微藻,凍融條件要具體考慮。類似的,GHOSH等[41]對反復凍融法提取螺旋藻藻紅蛋白進行了響應面優(yōu)化實驗,證實了低摩爾濃度的緩沖液有利于藻紅蛋白的提取,并且在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液,pH為8,凍融循環(huán)7次時得到藻紅蛋白回收率最高。朱孝晨[3]在螺旋藻藻粉中加入磷酸鹽緩沖溶液浸提,經(jīng)反復凍融后得到純度為0.56的藻藍蛋白粗提液,經(jīng)純化后,藻藍蛋白回收率為83.81%,純度1.08。

然而凍融法提取胞內(nèi)蛋白耗時長,且不適用于大規(guī)模生產(chǎn),只適合實驗室小部分產(chǎn)品的處理。因為大量的藻類樣品無法在短時間內(nèi)凍融。在邱月[44]的研究中凍融法提取雨生紅球藻蛋白時,耗時約36 h,提取率為30%,提取時間顯著高于研磨法和高速勻漿法達到同等提取率的時長。使用凍融法提取蛋白時,為了提高得率,通常需要消耗大量溶劑。張文怡[8]通過研究發(fā)現(xiàn),采用凍融法提取紅毛菜藻紅蛋白,達到與雙酶法相同提取率時,凍融法需要消耗酶法10倍的溶劑量。此外,在SOMMER等[27]的研究中發(fā)現(xiàn),凍融細胞密度較低時凍融法更為有效,而在實際生產(chǎn)中,低細胞密度往往不現(xiàn)實,高能耗也是阻礙實際應用的原因之一。

1.2.2 水酶法提取

水酶法最初應用于植物細胞油脂的提取,由于該法提取油脂后廢水中存在大量蛋白質(zhì)會造成環(huán)境污染,之后越來越多研究者們開始應用水酶法提取蛋白質(zhì)。水酶法可以直接從濕藻中提取蛋白質(zhì),省去了干燥微藻的過程,減少了大量的能耗。此外,與傳統(tǒng)的堿提法相比,酶法反應條件溫和,而且不易引入雜質(zhì),且能更好地維持蛋白質(zhì)的構型、構象和光學特性,具有專一性。例如,趙麗[45]用纖維素酶提取藻紅蛋白,處理時長15 h,純度可達0.37。

酶制劑的成本高是水酶法應用的一個主要問題,除了依靠固定化酶技術的發(fā)展,還可以與其他方法聯(lián)合,減少酶的用量,從而降低酶制劑成本。TAVANANDI等[46]比較了酶法和表面活性劑提取藻藍蛋白的效率,并分別結合超聲處理,結果顯示采用超聲輔助溶菌酶提取藻藍蛋白得率最高,為92.73 mg/g干物質(zhì),提取率為77.92%,純度為1.09。FERREIRA-SANTOS等[47]采用歐姆加熱和酶法聯(lián)合提取可高效打破螺旋藻細胞壁,選擇性地回收藻膽蛋白,與常規(guī)熱提法相比,其產(chǎn)率提高了100%以上。

由于不同植物細胞壁組成不同,因此選用不同的酶提取微藻植物蛋白質(zhì)時,效果也不相同。SIERRA等[48]比較了自溶酶、胰蛋白酶、溶菌酶和膠原蛋白酶4種酶對萊茵衣藻的破壁效果,通過顯微分析得出自溶酶對萊茵衣藻細胞壁的破壞效果最好。溶菌酶也有一定的活性,但不如對富含糖蛋白的細胞壁有專一性的自溶酶效果顯著。此外,研究還證實了自溶酶聯(lián)合超聲處理可以使蛋白質(zhì)完全溶解。且自溶酶是由萊茵衣藻原位產(chǎn)生,極大降低了酶的成本。為了更高效地提取萊茵衣藻胞內(nèi)蛋白質(zhì),SOTO-SIERRA等[49]做了進一步試驗,選用原位產(chǎn)生的自溶酶打破萊茵衣藻細胞壁提取胞內(nèi)蛋白質(zhì),經(jīng)自溶酶處理后可釋放50%的蛋白質(zhì),再經(jīng)二級胰蛋白酶處理,蛋白質(zhì)釋放率達64%。該方法酶的專一性更高,降低了酶的成本,省去了能量消耗大的機械處理過程。

復合酶比單一酶在藻體組織細胞壁降解效果上更有優(yōu)勢[50],為微藻蛋白的規(guī)?；a(chǎn)提供了新思路。施瑛等[51]比較了纖維素酶、果膠酶對紫菜藻紅蛋白的提取效果,研究發(fā)現(xiàn)纖維素酶和果膠酶的最佳酶配比為7∶3的復合酶液提取效果更好,得率可達2.26%,純度可達1.66。COELHO等[52]篩選了大量碳水化合物酶和硫酸鹽酶,評估它們單獨和聯(lián)合使用時對鈍頂螺旋藻的破壁能力,結果證實了溶菌酶和α-淀粉酶的混合酶處理破壁效果最顯著,能夠提高蛋白質(zhì)的釋放。CANELLI等[31]選用幾丁質(zhì)酶、鼠李糖水解酶和半乳糖酶組合對小球藻進行酶解,酶促處理釋放的蛋白質(zhì)由對照組的(49.2±3.9)%增加到(58.7±3.5)%。說明了復合酶解能夠高效釋放胞內(nèi)蛋白,并且酶法能夠保持細胞完整性,從而保證胞內(nèi)化合物的穩(wěn)定性。

水酶法在應用時,酶解效率受諸多因素的影響,如酶解時間、溫度、pH等。溫度和pH通過影響酶的活性進一步影響蛋白質(zhì)的回收率。孫媛媛等[53]通過單因素試驗,確定了蛋白酶酶解螺旋藻的最佳工藝條件:酶解pH為8,酶解時間24 h,溫度100 ℃,此時蛋白回收率最高,為51.78%。

1.2.3 離子液體提取

離子液體是由有機陽離子和無機或有機陰離子構成的在室溫下呈液態(tài)的有機鹽,離子液體作為萃取溶劑相比于傳統(tǒng)有機揮發(fā)性溶劑的主要優(yōu)點是揮發(fā)性低,可重復使用,化學穩(wěn)定性好。

離子液體有良好的溶解性能,會與蛋白質(zhì)形成多種強相互作用,特別是氫鍵,使蛋白質(zhì)在離子液體中的溶解度升高,從而增加蛋白質(zhì)提取率(圖1-e)。然而該方法離子液體成本高,反應時間長,因此有必要同其他預處理方式結合如球磨、超聲波輔助提取、高壓均質(zhì)等,來降低提取時間和成本。MOTLAGH等[54]評估了6種離子液體對微擬球藻蛋白質(zhì)提取的影響,與蒸餾水處理的對照組相比,添加離子液體能顯著提高蛋白質(zhì)的提取率。其中[Ch][Ac]效果最佳。為了解決離子液體成本高的問題,該研究在水介質(zhì)中使用離子液體,同時增加了微波輔助提取,在最優(yōu)條件下獲得的蛋白質(zhì)提取率為65.06%。RODRIGUES等[55]在試驗中采用合成的質(zhì)子離子液體對藻膽蛋白進行提取,其提取率比采用磷酸鈉緩沖液和非質(zhì)子離子液體更高,加以超聲波輔助提取,在2-HEAA+2-HEAF為溶劑,萃取頻率為25 kHz,pH為6.5,溶劑與生物量比為7.93 mg/L,提取時間為30 min時,得率最佳。LEE等[56]采用超聲輔助離子液體提取小球藻蛋白質(zhì),并探索了離子液體濃度、超聲時間、超聲功率和藻漿濃度對得率的影響,在最優(yōu)條件下蛋白質(zhì)提取率為25.3%,釋放率達到95%。

離子液體的回收再利用也是降低成本的方法之一。并且在FUJITA等[57]的研究中已證實回收再利用的離子液體對細胞的破碎能力不會下降。然而在RODRIGUES等[55]的研究中,采用(NH4)2SO4沉淀回收離子液體,回收后的離子液體再用于藻膽蛋白提取時,藻藍蛋白和別藻藍蛋白的得率受到了很大的影響,而對藻紅蛋白幾乎無影響,原因是由于回收溶劑中殘留的(NH4)2SO4會使藻藍蛋白沉淀,而只有在(NH4)2SO4飽和度高于80%時藻紅蛋白才會受到影響[55]。因此,如何回收離子液體溶劑是亟待解決的問題。

2 新型微藻蛋白提取方法

除傳統(tǒng)方法之外,超臨界流體法、微射流處理法和陽離子聚合物涂膜法等新型細胞破碎方法具有環(huán)保、高效等優(yōu)點,已被用于微藻油脂、葉黃素、β-胡蘿卜素及其他生物活性成分的提取,在微藻蛋白提取方面也具有很大潛力。

2.1 超臨界流體法

超臨界流體是指流體處于超臨界狀態(tài),此時流體具有類似于氣體的黏度和擴散率,以及類似于液體的密度和溶解性[58]。CO2是一種惰性、無毒、環(huán)保、價廉的流體,其臨界溫度(31.3 ℃)和臨界壓力(72.9 bar)都較低,被廣泛用作超臨界流體[59]。超臨界流體法破碎細胞是利用CO2等通過高壓將其滲透入細胞內(nèi),再瞬時降壓,利用細胞內(nèi)外的突變壓差使細胞發(fā)生破裂[18]。由于在降壓過程中,流體體積增大,溫度降低,因此避免了類似于超聲、球磨等傳統(tǒng)細胞破碎技術的局部過熱現(xiàn)象,有效保護了胞內(nèi)化合物的穩(wěn)定。

在微藻生物分子的提取中,超臨界流體法由于其萃取時間短、萃取效率高、綠色安全等優(yōu)點被廣泛應用于多不飽和脂肪酸[60]、維生素[61]等的回收。但對于極性化合物的提取,由于CO2的極性較低,提取率往往不理想,可以使用少量的CO2極性添加劑,例如,乙醇、正己烷等。在CHRONOPOULOU等[61]的研究中,用檸檬烯和甲醇作為超臨界流體CO2共溶劑,從斜生柵藻中提取類胡蘿卜素,可以提取到16.14%角黃素和1.25%葉黃素,而在僅使用CO2的條件下無法獲得如此高的提取率。

在超臨界流體法提取胞內(nèi)活性物質(zhì)過程中,溫度、壓力、處理時間、流體與生物量的比值以及共溶劑的增加等,均會影響目標產(chǎn)物的提取率。LORENZEN等[62]研究發(fā)現(xiàn),在壓力12 MPa、20 ℃和CO2與生物量的比值為100時,可從柵藻中獲得高達92%油脂回收率。MORADI-KHEIBARI等[63]研究了不同萃取時間、壓力、增加乙醇對小球藻脂質(zhì)提取率的影響,結果表明,隨著萃取壓力的增加、萃取時間的延長和乙醇的增加,總脂質(zhì)得率增加。然而,乙醇和溫度的升高會導致蛋白質(zhì)變性并轉(zhuǎn)化為二級結構,這對于蛋白質(zhì)的提取不利。因此利用超臨界流體法提取微藻蛋白時,溫和的萃取條件或有利于蛋白質(zhì)的提取。

研究已證實了超臨界流體法從微藻中回收活性物質(zhì)的有效性,但較低的提取率需要進一步考慮操作條件的優(yōu)化以及與其他方法的聯(lián)合使用。此外,該法應用于微藻蛋白質(zhì)的提取還需進一步探究。由于高成本和規(guī)?；瘑栴},超臨界流體法的商業(yè)化應用仍有待發(fā)展。

2.2 微射流處理法

微射流處理是一種新型的均質(zhì)技術,與傳統(tǒng)高壓均質(zhì)不同,該技術綜合了水射流技術、沖擊流技術和傳統(tǒng)高壓均質(zhì)技術的優(yōu)點,在微射流處理過程中,生物質(zhì)受到強剪切、湍流、高速沖擊、高頻振動、瞬時降壓和流體動力空化力的綜合作用從而發(fā)生變化[64]。微射流處理方法采用微射流器,利用高壓和細胞懸浮液在幾何形狀的相互作用腔內(nèi)碰撞實現(xiàn)細胞結構的破裂。在破壞細胞結構時,常常選用相互作用腔為Z型結構的微射流器[65]。

微射流處理技術通過破壞細胞結構、減小顆粒尺寸、增加比表面積、提高液體物質(zhì)的擴散速率等途徑增加了多糖、多酚和黃酮類等化合物的釋放,提高了提取效率,被認為是一種有效的提取胞內(nèi)活性物質(zhì)的方法[66-67]。CHA等[68]在模擬消化模型中,采用微射流處理法增加小球藻中類胡蘿卜素的生物可及性,在20 000 psi的高壓下進行微射流處理后,小球藻的平均粒徑從2 463 nm顯著降低至361 nm,可釋放32.60%玉米黃素和18.19%β-胡蘿卜素,與未處理組相比,類胡蘿卜素的生物可及性增加了10倍以上。該結果證實了微射流處理技術能夠有效地破壞小球藻細胞,有利于胞內(nèi)化合物的釋放。XIA等[69]利用微射流技術從碎米中提取蛋白質(zhì),加以酶輔助提取,可獲得81.87%的蛋白回收率,且純度高達87.89%,同時蛋白結構不發(fā)生改變。實驗數(shù)據(jù)表明酶輔助微射流處理技術是一種溫和有效的蛋白質(zhì)提取方法,但目前尚未在微藻蛋白質(zhì)的提取中應用,為后續(xù)提取微藻蛋白工藝研究提供了新的方向。

微射流的處理效率受相互作用腔流道設計、處理壓力、循環(huán)次數(shù)、溫度等的影響,可通過優(yōu)化工藝參數(shù)有效地破裂細胞。STUPAK等[70]優(yōu)化了微射流處理提取反硝化奈瑟氏菌胞內(nèi)產(chǎn)物的工藝,對預處理時間、pH、細胞濃度等進行研究,發(fā)現(xiàn)在最佳條件下,細胞破壞率提高了2倍,胞內(nèi)化合物產(chǎn)量提高了26%,1 g細胞可產(chǎn)生(113.2±8.2) mg蛋白質(zhì)、(12.1±0.7) mg核酸以及(21.0±1.2) mg多糖等其他化合物。結果表明,將已知的預處理方法與破碎方法進行優(yōu)化組合,可顯著提高細胞破碎效率。

微射流處理技術耗時短,提取效率高,條件溫和,不會造成生物活性物質(zhì)的降解,同時不引入外源化學物質(zhì),可連續(xù)操作,安全環(huán)保,在細胞破碎方面有良好的前景。但該法設備成本高,處理量小,耗能高,目前較難實現(xiàn)工業(yè)化。此外,微射流處理技術在微藻蛋白提取方面的應用仍需探究,與酶法、預處理等其他方法聯(lián)合使用或是一種有效提高產(chǎn)率、降低成本與能耗的途徑。

2.3 陽離子聚合物涂膜法

陽離子聚合物涂膜法是一種新型細胞破碎技術,通過擾亂細胞的局部靜電平衡使細胞發(fā)生破裂,該法溫和高效,且聚合物可重復利用降低成本,在破裂微藻復雜的細胞壁方面已有應用。YOO等[71]使用涂有陽離子聚合物的功能膜,直接從濕微藻中提取細胞內(nèi)脂質(zhì)。使用一種涂有帶正電荷的含叔胺聚合物的膜,擾亂微藻磷脂雙分子層的靜電平衡,誘導帶負電荷的磷脂雙分子層發(fā)生局部重排,引起細胞破裂,細胞破碎率達(25.6±2.2)%。陽離子聚合物涂膜法與其他方法聯(lián)合使用,也是一種提高細胞破壁率的有效途徑。在ZHENG等[72]的研究中,使用熱聚合物協(xié)助酶裂解小球藻細胞壁,細胞破碎率高達68%。

GEJJI等[73]采用羧基功能化纖維素顆粒和雞蛋清蛋白模擬藻細胞和藻蛋白,在不同pH條件下利用聚二烯丙基二甲基氯化銨(poly diallyl dimethyl ammonium chloride,polyDADMAC)在水-有機溶劑兩相體系中,從藻細胞模型中選擇性分離蛋白。實驗結果顯示,在水-己烷兩相體系中,當pH值為4.5(接近蛋白質(zhì)等電點)時,約75%的蛋白質(zhì)被分離到水相中。此外,GEJJI等[74]還成功地利用polyDADMAC從小球藻濕藻中分理出蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和色素。研究發(fā)現(xiàn),懸浮粒子的等電點是決定各組分分離效率的關鍵,當水-正己烷體系的pH調(diào)整到接近大多數(shù)微藻蛋白質(zhì)的等電點4時,可使80%的蛋白質(zhì)保留在水相中。隨著pH值接近堿度,微藻細胞碎片上的負電荷增加,使得95%的小球藻細胞碎片遷移到己烷相,同時脂質(zhì)也被提取到正己烷相。該過程證實了polyDADMAC通過水-有機相從微藻中分離化合物的能力,說明了陽離子聚合物從微藻細胞碎片中選擇性分離微藻蛋白質(zhì)是一種有前景的技術,但目前相關研究不足,仍需進一步探究。

3 結論與展望

微藻蛋白質(zhì)是一種新型蛋白質(zhì)資源,且它們具有營養(yǎng)、調(diào)節(jié)機體健康等特性,在食品、化妝品、醫(yī)療保健方面有諸多應用。此外,微藻養(yǎng)殖周期短,不占用土地資源,同時微藻光合作用吸收CO2,對環(huán)境十分友好。因此,微藻的開發(fā)利用越來越深入。獲取微藻胞內(nèi)蛋白質(zhì)的方法就是要打破細胞屏障,破壞微藻細胞壁。在破壁方法選擇時,要綜合考慮到蛋白質(zhì)回收率、產(chǎn)品純度、能量消耗以及活性物質(zhì)在提取過程中不遭到破壞等問題。本文介紹的微藻蛋白提取方法各有優(yōu)缺點(表2),但物理方法、化學方法、生物法之間的聯(lián)合使用可能會提高破壁效率、產(chǎn)品得率和蛋白質(zhì)純度,降低能耗,減少成本,如超聲輔助有機溶劑萃取,珠磨聯(lián)合酶解等。隨著微藻生物的開發(fā)利用,微藻蛋白質(zhì)的提取有望取得更大突破。