劉宜嵩,張欣怡,2,鈕成拓,2,鄭飛云,2,王金晶,2,許鑫,2,李崎,2,劉春鳳,2*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 釀酒科學(xué)與工程研究室,江蘇 無錫,214122)

醛類是酒類中的主要羰基化合物,其中乙醛是酒類中質(zhì)量濃度最高的揮發(fā)性醛類,質(zhì)量濃度在總?cè)┑?0%以上[1-4]。乙醛的質(zhì)量濃度影響著酒類的風(fēng)味和老化,乙醛質(zhì)量濃度低時有水果香,質(zhì)量濃度高會產(chǎn)生辛辣的刺激性氣味并給酒類帶來惡劣的青草味,縮短酒類風(fēng)味的保鮮期,甚至飲用后會引起人體的不良反應(yīng)[5]。同時,2009年乙醛被列為I類致癌物[6]。

常見的酒類樣品中乙醛含量檢測方法為GC和HPLC法,為了提高準(zhǔn)確性通常會結(jié)合固相微萃取或衍生化處理技術(shù)[7-8]。GC和HPLC法檢測乙醛涉及昂貴儀器的使用而且程序復(fù)雜,相比之下,近年來涌現(xiàn)的熒光探針檢測方法展示出其簡便、廉價且高效等優(yōu)勢。熒光探針已經(jīng)成功應(yīng)用于水、飲料以及生物系統(tǒng)中金屬離子、甲醛和酶的檢測[9-15],同時也包含空氣中羰基類化合物檢測[9,16]等諸多領(lǐng)域。但是在酒類檢測分析領(lǐng)域應(yīng)用較少[17-18],而且尚無一種應(yīng)用于酒類樣品中乙醛檢測的熒光探針。

目前熒光探針的主要設(shè)計方法是依據(jù)響應(yīng)機理尋找合適的反應(yīng)基團(tuán)和熒光基團(tuán)[19]。為了建立一種高效分析和檢測酒類樣品中乙醛的方法,本研究報道了一種基于4-硝基苯呋咱為熒光基團(tuán)[20],肼基作為反應(yīng)基團(tuán)的熒光探針,作用原理為光電子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移(photoinduced electron transfer,PET)過程。本研究通過蒸餾法去除酮酸類物質(zhì)等的干擾在熒光探針檢測實際樣品的應(yīng)用中屬于首次,結(jié)果表明本研究開發(fā)的熒光探針可以成功用于啤酒、白酒、黃酒和葡萄酒等酒類的乙醛質(zhì)量濃度的檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 熒光探針

圖1中展示了熒光探針的合成路線。稱取500 mg 4-氯-7-硝基苯并呋咱于燒瓶中,外壁包裹錫紙避光。加入50 mL氯仿使4-氯-7-硝基苯并呋咱充分溶解。加入50 mL體積分?jǐn)?shù)5%水合聯(lián)氨(3.125 mL體積分?jǐn)?shù)80%水合聯(lián)氨+46.875 mL甲醇),N2吹掃后封口攪拌5 h,靜置1 h,析出黃褐色沉淀并抽濾,用二氯甲烷清洗濾餅,得到固體461.61 mg。

圖1 熒光探針合成途徑Fig.1 Synthesis of the fluorescent probe

1.1.2 實驗試劑

二甲亞砜、水合肼、甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、氯仿和乙腈(均為色譜純)、鹽酸和N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)(均為分析純),中國國藥集團(tuán)。4-氯-7-硝基苯并呋咱、乙醛、糠醛、5-羥甲基糠醛、乙偶姻、2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、2,3-己二酮、丙酮酸、丙酮、羥基丙酮、α-酮戊二酸、甲基乙二醛、丙醛、丁醛、異丁醛、異戊醛、己醛、苯乙醛、乙二醛、L-天冬酰胺、L-谷氨酸酸、1-丙醇、1-丁醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇、乙酸、乳酸、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、乳酸乙酯和3-庚酮(均為分析純),Aladdin公司。

1.1.2.1 選擇性分析物

稱取乙醛、糠醛、5-羥甲基糠醛、乙偶姻、2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、2,3-己二酮、丙酮酸、丙酮、羥基丙酮、羥基丙酮、α-酮戊二酸、甲基乙二醛、正丙醛、正丁醛、異丁醛、異戊醛、己醛、壬醛、苯乙醛、乙二醛、天冬氨酸、谷氨酸、乙醇、丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇、乙酸、乳酸、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯和乳酸乙酯各100 mg溶于10 mL純水中得到10 g/L母液并儲存在-20 ℃下,稀釋至15 mg/L用于選擇性分析。

1.1.2.2 抗干擾性分析物

根據(jù)報道的啤酒、白酒、黃酒和葡萄酒中羰基化合物和醇酯類化合物的質(zhì)量濃度,配制模擬樣品來證明其他干擾物存在的條件下乙醛的響應(yīng)情況,各樣品的干擾物質(zhì)量濃度如下:

啤酒:乙醛10 mg/L;干擾物:乙縮醛 25 mg/L、丙醛 0.3 mg/L、正丁醛 0.3 mg/L、異丁醛 0.3 mg/L、異戊醛 0.1 mg/L、庚醛 0.2 mg/L、辛醛 0.2 mg/L、糠醛 2 mg/L、5-羥甲基糠醛 8 mg/L、2,3-丁二酮 0.1 mg/L、2,3-戊二酮 0.5 mg/L、乙偶姻 5 mg/L、丙酮醛 0.1 mg/L、正丙醇 25 mg/L、異戊醇 100 mg/L、乙酸 20 mg/L、乙酸乙酯 50 mg/L、乙酸異戊酯 10 mg/L、丙酮酸 100 mg/L。

白酒:乙醛300 mg/L;干擾物:乙縮醛 800 mg/L、丙醛 20 mg/L、異丁醛 10 mg/L、異戊醛 100 mg/L、糠醛 20 mg/L、苯甲醛 400 mg/L、苯乙醛 440 mg/L、5-羥甲基糠醛 600 mg/L、2,3-丁二酮 230 mg/L、正丙醇 2 250 mg/L、異戊醇 460 mg/L、乳酸 1 000 mg/L、乙酸 1 000 mg/L、己酸 500 mg/L、乙酸乙酯 5 000 mg/L、己酸乙酯 3 000 mg/L、乳酸乙酯 2 000 mg/L、四甲基吡嗪 5 mg/L。

黃酒:乙醛50 mg/L;干擾物:乙縮醛 50 mg/L、丙醛5 mg/L、異丁醛5 mg/L、異戊醛5 mg/L、糠醛 10 mg/L、苯甲醛150 mg/L、5-羥甲基糠醛 500 mg/L、乙酸乙酯 100 mg/L、丙醇 80 mg/L、異丁醇 100 mg/L、異戊醇 300 mg/L、3-甲基丁醇 200 mg/L、乳酸 5 000 mg/L、乙酸 1 500 mg/L、乳酸乙酯 500 mg/L、β-苯乙醇 100 mg/L、單乙基琥珀酸酯 180 mg/L、丙酮酸 50 mg/L。

葡萄酒:乙醛100 mg/L;干擾物:乙縮醛100 mg/L、丙醛10 mg/L、異丁醛10 mg/L、異戊醛10 mg/L、2,3-丁二酮 2 mg/L、乙偶姻 5 mg/L、糠醛 20 mg/L、異丁醇 150 mg/L、異戊醇 150 mg/L、乳酸 500 mg/L、乙酸 2 000 mg/L、乙酸乙酯 100 mg/L、乳酸乙酯 100 mg/L、丙酮酸 20 mg/L。

1.1.3 酒類樣品

啤酒樣品由當(dāng)?shù)爻匈徺I的成品酒以及實驗室自制的發(fā)酵液組成,白酒、黃酒和紅酒樣品是從當(dāng)?shù)爻匈徺I的。發(fā)酵液按參考文獻(xiàn)[21]的方法進(jìn)行制備。成品啤酒、啤酒發(fā)酵液、白酒、黃酒和葡萄酒的信息如表1和表2所示。

表1 成品啤酒和發(fā)酵液樣品信息表Table 1 Basic information of the samples of beer

表2 白酒、黃酒和葡萄酒信息表Table 2 Basic information of the samples of Baijiu, wine and Huangjiu

在乙醛模擬體系中:分別向100 mL乙醛標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品(10 mg/L)中加入100、200、400 μL乙醛儲備溶液(1 g/L),每個加標(biāo)量制備3個平行樣品;在真實酒類體系中,分別向100 mL啤酒中加入100、200、400 μL乙醛儲備溶液(1 g/L),向100 mL白酒中加入1 000、2 000、4 000 μL乙醛儲備溶液(1 g/L),向100 mL黃酒和葡萄酒中加入500、1 000、2 000 μL乙醛儲備溶液(1 g/L)。每個加標(biāo)量制備3個平行樣品,用于回收率的驗證。

1.2 實驗儀器

全波長酶標(biāo)儀 Synergy H4,美國Biotek儀器有限公司;頂空氣相色譜儀 HS-10/GC-2010,日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 熒光探針檢測方法

目前被普遍接受的檢測方法如圖2-a所示,通用檢測方法將酒類樣品適當(dāng)稀釋后,取微量滴入探針溶液中進(jìn)行檢測[22]。本研究使用的熒光探針檢測方法如圖2-b所示,與通用方法最大的不同在于,酒類樣品在檢測前需進(jìn)行蒸餾收集,檢測方法如下:

a-通用方法;b-本研究使用的方法圖2 熒光探針檢測方法示意圖Fig.2 Schematic diagram of the fluorescent probe detection method

使用雙乙酰蒸餾裝置對酒樣進(jìn)行蒸餾。取酒樣100 mL,啤酒等含氣樣品需滴加一滴消泡劑,白酒用蒸餾水稀釋25倍,黃酒和葡萄酒樣品用蒸餾水稀釋10倍。當(dāng)餾出液接近20 mL時停止接收,并用蒸餾水補足到20 mL,得到餾出液A。蒸餾過程在2 min中內(nèi)完成,餾出液在冰浴下使用25 mL具塞比色管接收。

在5 mL離心管中加入250 μL鹽酸溶液(體積分?jǐn)?shù)8%,溶劑為乙腈),10 μL蒸餾后的酒類樣品(10 μL純水作為空白對照),740 μL熒光探針溶液(40 mg/L,溶劑為乙腈),置于5 ℃培養(yǎng)箱中低溫反應(yīng)20 min,取200 μL反應(yīng)液于96孔酶標(biāo)板中并在熒光光譜儀上檢測,將除去空白的熒光強度帶入線性回歸方程F553 nm=79.25Cs+134.49(R2=0.998 3)中,得到乙醛質(zhì)量濃度Cs。樣品中乙醛的質(zhì)量濃度計算如公式(1)。

C=Cs/N

(1)

式中:C,樣品中乙醛的質(zhì)量濃度;N,蒸餾的濃縮倍數(shù),樣品為啤酒時N=5,樣品為白酒時N=0.2,樣品為黃酒或葡萄酒時N=0.5。

1.3.2 熒光探針與乙醛的紫外吸收光譜和熒光光譜

在V(乙腈)∶V(DMSO)=9∶1(pH 2.1)的體系中測試熒光探針(40 mg/L)與不同質(zhì)量濃度乙醛(0、1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/L)反應(yīng)完全后的紫外吸收光譜圖。

在V(乙腈)∶V(DMSO)=9∶1(pH 2.1)體系中測試熒光探針(40 mg/L)與不同質(zhì)量濃度乙醛(0、1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/L)反應(yīng)完全后,在熒光光譜儀上得到512～700 nm的熒光光譜圖。激發(fā)波長485 nm;狹縫寬度2 nm、2 nm;檢測溫度25 ℃。

測試熒光探針在DMSO、MeOH、純水、乙腈、DMF和PBS共6種溶劑中的紫外吸收光譜和熒光光譜,探針質(zhì)量濃度均為40 mg/L,在5 ℃下反應(yīng)20 min。

1.3.3 頂空氣相色譜法(headspace gas chromatography,HS-GC)

用純水將乙醛標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 g/L)按照質(zhì)量濃度梯度依次稀釋為1～100 mg/L的乙醛標(biāo)準(zhǔn)溶液,白酒樣品需稀釋10倍。取4 mL乙醛標(biāo)準(zhǔn)溶液或4 mL酒類樣品于頂空進(jìn)樣瓶中,并加入1 mL 3-庚酮內(nèi)標(biāo)工作溶液(30 mg/L)和2.0 g NaCl,蓋好橡膠蓋并壓緊鋁帽。HS-GC分析條件:平衡溫度70 ℃;平衡時間30 min;傳輸線溫度130 ℃;進(jìn)樣時間0.04 min;進(jìn)樣口溫度200 ℃;檢測器溫度250 ℃;程序升溫40～180 ℃(10 ℃/min);柱流量1.2 mL/min;載氣(N2)流量30 mL/min;燃?xì)?H2)流量47 mL/min;助燃?xì)饬髁?400 mL/min。將酒類樣品的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為y值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.231 3x-0.001 3,R2=0.999 7中得到酒類樣品中乙醛的質(zhì)量濃度x。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光探針的合成

苯并呋咱屬于一類較為常見的熒光基團(tuán),改變4位和7位的取代基會產(chǎn)生不同的發(fā)射特點。本研究將4位取代基設(shè)計為硝基作為強吸電子基團(tuán),7位取代基設(shè)計為肼基作為反應(yīng)基團(tuán),形成PET效應(yīng)。反應(yīng)基團(tuán)與乙醛結(jié)合后,乙醛爭奪了肼基向硝基轉(zhuǎn)移的電子,PET過程被破壞,引起熒光發(fā)射增強。利用這一原理可以實現(xiàn)對酒類樣品中乙醛含量的檢測,熒光響應(yīng)示意圖如圖3所示。

圖3 熒光探針響應(yīng)機理Fig.3 Response mechanism of the fluorescent probe

2.2 紫外吸收光譜及熒光性質(zhì)研究

熒光探針與乙醛的紫外吸收光譜如圖4-a所示,熒光探針主要吸收峰在450～550 nm,最大吸收峰為485 nm。加入乙醛后吸收強度增加,在485 nm處有最強吸收峰。因此熒光光譜的激發(fā)波長的參數(shù)應(yīng)選擇485 nm。

a-熒光探針與不同濃度乙醛的紫外吸收光譜;b-熒光探針與不同濃度乙醛的熒光光譜;c-熒光探針在不同溶劑下的紫外吸收光譜;d-熒光探針在不同溶劑下的熒光光譜圖4 紫外吸收光譜及熒光光譜Fig.4 Spectra of UV absorption and fluorescence

熒光探針與乙醛的熒光光譜如圖4-b所示,熒光探針在512～600 nm處顯示出主要吸收帶,而且在553 nm表現(xiàn)出不斷增強的最大吸收峰,表明熒光探針與乙醛反應(yīng)后生成新物質(zhì)并釋放熒光信號。

如圖4-c所示,熒光探針在DMSO、MeOH、純水、乙腈、DMF和PBS溶劑最大吸收波長集中在436～492 nm。同時可以觀察到,隨著溶劑極性的增加,熒光探針的最大吸收波長發(fā)生了紅移,當(dāng)溶劑為純水和PBS時最大吸收波長為436 nm,溶劑為MeOH時最大吸收波長為448 nm,而當(dāng)乙腈、DMF和DMSO作為溶劑時最大吸收波長則在464～492 nm,屬于正溶劑效應(yīng)。

如圖4-d所示,熒光探針在不同溶劑中的最大發(fā)射波長在552～568 nm,斯托克斯位移的范圍在68～132 nm。熒光探針在乙腈、DMF和MeOH中幾乎具有相同的最大發(fā)射波長,為553 nm。而熒光探針在DMSO(最大發(fā)射波長560 nm)、純水(最大發(fā)射波長564 nm)和PBS(最大發(fā)射波長568 nm)中的最大發(fā)射波長都出現(xiàn)了不同程度的紅移,但紅移范圍都在15 nm之內(nèi),差異并不明顯。值得注意的是,在乙腈中可以觀察到較為強烈的熒光增強,熒光探針在乙腈中表現(xiàn)出的熒光強度要遠(yuǎn)高于其他5種溶劑。

2.3 選擇性和抗干擾性分析

測試多種分析物來證實熒光探針的選擇性,結(jié)果如圖5所示。測試相同質(zhì)量濃度(10 mg/L)的選擇性分析物。結(jié)果表明,在相同質(zhì)量濃度下,探針對乙醛的響應(yīng)值最高,啤酒中部分微克級別羰基化合物如正丙醛、正丁醛和異丁醛的熒光強度為乙醛的4%～26%,而啤酒中毫克級別羰基化合物響應(yīng)值較低,僅為乙醛響應(yīng)值的1%～14%,同時可以發(fā)現(xiàn)探針對醇酯類物質(zhì)幾乎沒有響應(yīng),對白酒、黃酒以及葡萄酒中除乙醛外的主要風(fēng)味物質(zhì)響應(yīng)值微乎其微。

圖5 選擇性分析Fig.5 Selectivity analysis

本研究合成的熒光探針也曾被用作熒光衍生劑,并結(jié)合高效液相色譜儀和熒光檢測器檢測羰基化合物,涉及的羰基化合物包括乙醛、丙醛、丁醛、戊醛、苯甲醛、茴香醛、丙酮、苯乙酮和苯丙酮等,這些羰基化合物經(jīng)過一定的預(yù)處理都可以和熒光探針完全反應(yīng)[23-24]。但從報道的結(jié)果來看,乙醛的響應(yīng)值要遠(yuǎn)高于其他羰基化合物,且預(yù)處理時間最短。酒類中其他羰基化合物可以和熒光探針上的肼基相結(jié)合,但在乙醛與熒光探針反應(yīng)結(jié)束時,活性不高的羰基化合物尚未與熒光探針完全反應(yīng),響應(yīng)值極低。

因此,本研究合成的熒光探針在實際檢測應(yīng)用中具有明顯的優(yōu)勢。為了進(jìn)一步證明熒光探針的實用性,還需要進(jìn)行抗干擾分析。

抗干擾性能分析如圖6所示,證實探針的抗干擾性需要模擬真實酒類樣品,這種模擬真實樣品質(zhì)量濃度的方式在以往的研究中有過實例[25]。干擾物質(zhì)應(yīng)包含羰基化合物以及酒類樣品中含量豐富的醇酯類化合物,質(zhì)量濃度的選擇以報道過的最高質(zhì)量濃度作為依據(jù)[1-4]。

a-啤酒模擬樣品;b-白酒模擬樣品;c-黃酒模擬樣品;d-葡萄酒模擬樣品圖6 抗干擾性分析Fig.6 Anti-interference analysis

結(jié)果表明,丙酮酸的干擾較強,尤其會影響啤酒中乙醛含量的檢測。在100 mg/L丙酮酸的存在下,會導(dǎo)致啤酒中乙醛檢測值偏高約30%。在50 mg/L丙酮酸的存在下, 會導(dǎo)致黃酒中乙醛檢測值偏高約10%。在20 mg/L丙酮酸的存在下,會導(dǎo)致葡萄酒中乙醛檢測值偏高約5%。丙酮酸對白酒中乙醛檢測的干擾可忽略不計。丙酮酸是啤酒發(fā)酵液中的重要代謝產(chǎn)物,由選擇性分析可知,熒光探針對丙酮酸的響應(yīng)值為乙醛的10%以下,但丙酮酸在發(fā)酵液中的質(zhì)量濃度有時會超過100 mg/L,作為啤酒發(fā)酵液中高濃度的羰基化合物,對熒光探針檢測啤酒中乙醛的影響較大,嚴(yán)重限制了熒光探針檢測方法的應(yīng)用。

乙縮醛對乙醛的檢測干擾也較為明顯,尤其影響啤酒和白酒中乙醛的檢測,乙縮醛在酸性條件下會水解為乙醛,乙醛和熒光探針FPN1作用后促進(jìn)乙縮醛進(jìn)一步水解,進(jìn)而導(dǎo)致檢測值偏高。在25 mg/L乙縮醛的存在下,會導(dǎo)致啤酒中乙醛檢測值偏高約17%。在800 mg/L乙縮醛的存在下,會導(dǎo)致白酒中乙醛檢測值偏高16%。由選擇性分析可知,熒光探針對乙縮醛的響應(yīng)值為乙醛的15%,而啤酒和白酒中乙縮醛質(zhì)量濃度約為乙醛質(zhì)量濃度的2～3倍,會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高,同樣限制了對酒類中乙醛檢測的應(yīng)用。

本研究提出的熒光探針檢測方法則可以通過蒸餾的方式將乙縮醛和丙酮酸留在蒸餾室內(nèi),達(dá)到去除干擾物的目的。

2.4 熒光探針檢測方法的實際應(yīng)用

熒光探針和乙醛濃度的線性關(guān)系如圖7所示,線性范圍為0.12～200 mg/L,檢測限為0.12 mg/L。熒光探針檢測方法的回收率和RSD如表3所示?；厥章蕿?1.50%～111.14%,回收率效果較好。RSD在1.12%～5.95%,檢測方法的穩(wěn)定性較優(yōu)。

表3 熒光探針檢測方法的有效性Table 3 The validity of the fluorescent probe detection method

圖7 熒光強度和乙醛質(zhì)量濃度的線性關(guān)系圖Fig.7 Linear relationship between fluorescence intensity and acetaldehyde concentration

用熒光探針檢測方法和HS-GC法對啤酒、白酒、黃酒和葡萄酒樣品中的乙醛質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測,結(jié)果如表4所示。結(jié)果經(jīng)顯著性差異分析,P=0.632>0.05,說明2種方法的檢測結(jié)果無顯著性差異。

表4 基于熒光探針檢測方法和HS-GC法檢測酒類樣品中的乙醛Table 4 Determination of acetaldehyde concentrations in the samples of alcoholic beverages by fluorescent probe method and HS-GC method

3 結(jié)論與討論

本研究提出了基于熒光探針的酒類樣品中乙醛的新型快速檢測方法。通過蒸餾排除酒類中酮酸類物質(zhì)等的干擾具有實際應(yīng)用價值。熒光探針檢測方法的線性范圍和回收率分別為0.12～200 mg/L和91.50%～111.14%。尚有進(jìn)一步開發(fā)試紙法的潛力,可以從試紙的選擇、探針質(zhì)量濃度的選擇、表面活性劑的選擇以及穩(wěn)定性驗證對試紙法進(jìn)行開發(fā),制備熒光標(biāo)準(zhǔn)比色卡,將樣品檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)比色卡進(jìn)行比較可以快速高效地判斷酒類樣品中乙醛的濃度范圍。乙醛在酒類釀造過程中主要由生物途徑和化學(xué)途徑產(chǎn)生,實時監(jiān)測乙醛含量對酒類質(zhì)量管控具有重要意義,熒光探針檢測方法在保證準(zhǔn)確度的同時,避免了昂貴的大型檢測儀器的使用,簡便快捷,節(jié)約成本。本研究開發(fā)的熒光探針成功地應(yīng)用于啤酒、白酒、黃酒和葡萄酒等酒類樣品中乙醛含量的檢測。