LncRNA COL11A1-208在胃癌中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

陳 沖,徐 康,童 誠(chéng),崔建華,張祖芳

(東臺(tái)市人民醫(yī)院 消化內(nèi)科,江蘇 東臺(tái)224200)

胃癌(gastric cancer,GC)是發(fā)病率較高的惡性腫瘤,是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。盡管診斷技術(shù)和手術(shù)治療方案不斷進(jìn)步、優(yōu)化,但GC患者的預(yù)后并不理想,整體5年生存率仍較低下[2-3]。因此,識(shí)別GC的分子機(jī)制并研發(fā)新的治療策略是必要的。

目前,基因治療已成為癌癥治療領(lǐng)域的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一類長(zhǎng)度不少于200個(gè)核苷酸的RNA,因缺乏開(kāi)放閱讀框而不具備編碼蛋白功能,但LncRNA可通過(guò)選擇性剪接、調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄和降解、表觀遺傳修飾等過(guò)程參與細(xì)胞分化、增殖、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、凋亡等多種生命活動(dòng),是細(xì)胞生物學(xué)的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子[5-6]。近年來(lái),研究證實(shí)LncRNA在包括GC在內(nèi)的多種癌癥患者的血清和癌組織中異常表達(dá),與癌癥的發(fā)生、進(jìn)展緊密相關(guān)[7-9]。COL11A1-208為L(zhǎng)ncRNA家族新成員,先前研究表明其在口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中高表達(dá),可促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖和侵襲,且與OSCC患者的不良預(yù)后相關(guān),是OSCC有前景的診斷、預(yù)后生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)[10-11]。然而,COL11A1-208在GC中的意義尚不清楚。本研究旨在通過(guò)觀察COL11A1-208在GC中的表達(dá)及其表達(dá)改變對(duì)GC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響,分析COL11A1-208在GC發(fā)生和進(jìn)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2019年6月至2021年12月于東臺(tái)市人民醫(yī)院行手術(shù)切除的49例GC患者的癌組織及其癌旁組織(距癌組織≥3 cm)標(biāo)本,所有組織標(biāo)本均經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),且患者在術(shù)前均簽署知情同意書。

人正常胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1)及5種人胃癌細(xì)胞(AGS、MGC-803、MKN-45、BGC-823、SGC-7901)(貨號(hào)ATCC-431、ATCC-209、H-MGC-803、ATCC-829、ATCC-274、ATCC-805)均購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰?。

1.2 主要試劑

Gibcao澳洲FBS(貨號(hào)10099141,上海吉至生化科技有限公司);100×青-鏈霉素雙抗、1%結(jié)晶紫(貨號(hào)P1400-100、G1062,北京索萊寶科技公司);Lipofectamine-2000、Trizol(貨號(hào)11668027、YB-0102c,上海鈺博生物科技公司);pcDNA3.1載體及pcDNA3.1-COL11A1-208、siRNA COL11A1-208(si-COL11A1-208)及其陰性對(duì)照(si-NC)由上海吉瑪制藥公司提供;CCK-8試劑盒(貨號(hào)A311-01/02,南京諾唯贊生物科技公司);RIPA裂解液、BCA試劑盒、兔源一抗anti-GAPDH、山羊抗兔二抗(abs9231、abs9233、abs124037、abs20002)愛(ài)必信生物科技公司;兔源一抗anti-Ki67、anti-細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、anti-基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9,MMP9)和anti-神經(jīng)型鈣黏附蛋白(N-cadherin)(貨號(hào)ab16667、ab16663、ab76003、ab245117,Abcam公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

GES-1細(xì)胞、AGS細(xì)胞、MGC-803細(xì)胞、MKN-45細(xì)胞、BGC-823細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞均采用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%FBS、1%青-鏈霉素雙抗),于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每24 h更換1次培養(yǎng)液,匯合度約90%時(shí)收集細(xì)胞。

將SGC-7901細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種至6孔板內(nèi),待細(xì)胞匯合度約80%時(shí)利用Lipofectamine-2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將SGC-7901細(xì)胞分為Ctrl組(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染)、pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1載體)、pcDNA3.1-COL11A1-208組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-COL11A1-208)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-COL11A1-208組(轉(zhuǎn)染si-COL11A1-208),繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集各組SGC-7901細(xì)胞,并通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)COL11A1-208表達(dá)

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組SGC-7901細(xì)胞增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn):將收集的1.3各組SGC-7901細(xì)胞接種至96孔板中(1×104個(gè)/孔),培養(yǎng)24 h后加入CCK-8溶液并繼續(xù)培養(yǎng)2 h,借助SKSW-KC酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)。細(xì)胞增殖率(%)=(OD轉(zhuǎn)染處理組-OD空白組)/(OD Ctrl組-OD空白組)×100%。

克隆形成實(shí)驗(yàn):將收集的1.3各組SGC-7901細(xì)胞接種至6孔板中(1×103個(gè)/孔),培養(yǎng)24 h后置于4%多聚甲醛中固定20 min,而后置于1%結(jié)晶紫中染色10 min,于Olympus CKX31倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)≥50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組SGC-7901細(xì)胞侵襲

預(yù)先于Transwell小室底膜包被Matrigel,將收集的1.3各組SGC-7901細(xì)胞用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基調(diào)成濃度為5×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液,取200 μL接種至Transwell小室中,24孔板(下室)中加入600 μL含有10%FBS的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室,置于甲醛中固定30 min,用棉簽輕輕拭去上層細(xì)胞,風(fēng)干后置于1%結(jié)晶紫中染色10 min,借助Olympus CKX31倒置顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量,即為侵襲數(shù)量。

1.7 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組SGC-7901細(xì)胞遷移

將收集的1.3各組SGC-7901細(xì)胞接種至24孔板中(5×104個(gè)/孔),培養(yǎng)24 h后用100 μL槍頭在孔中間豎著劃1條直線,PBS清洗去除劃下的細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,而后于Olympus CKX31倒置顯微鏡下拍照,借助Image J軟件計(jì)算細(xì)胞劃痕面積愈合率。

1.8 Western Blot檢測(cè)各組SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白

收集1.3各組SGC-7901細(xì)胞,加入RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法測(cè)定濃度后進(jìn)行定量、變性,隨后進(jìn)行凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉,孵育兔源一抗anti-GAPDH、anti-Ki67、anti-Cyclin D1、anti-MMP9和anti-N-cadherin(4℃過(guò)夜),次日室溫孵育山羊抗兔二抗2 h,滴加ECL發(fā)光液后置于BJ75-JY04S-3C凝膠成像分析系統(tǒng)中拍照,借助Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 COL11A1-208在GC癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況

與癌旁組織比較,GC癌組織中COL11A1-208表達(dá)增加(P<0.05);與GES-1細(xì)胞比較,AGS細(xì)胞、MGC-803細(xì)胞、MKN-45細(xì)胞、BGC-823細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞中COL11A1-208表達(dá)均增加(P<0.05),且SGC-7901細(xì)胞增加更多。見(jiàn)表1,表2。

表1 COL11A1-208在GC癌組織中的表達(dá)情況

表2 COL11A1-208在GC細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.2 SGC-7901細(xì)胞成功過(guò)表達(dá)或敲低COL11A1-208

與Ctrl組、pcDNA3.1組、si-NC組比較,pcDNA3.1-COL11A1-208組SGC-7901細(xì)胞中COL11A1-208表達(dá)增加(P<0.05),與上述4組相比,si-COL11A1-208組SGC-7901細(xì)胞中COL11A1-208表達(dá)減少(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 SGC-7901細(xì)胞成功過(guò)表達(dá)或敲低

2.3 過(guò)表達(dá)或敲低COL11A1-208對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

與Ctrl組、pcDNA3.1組、si-NC組比較,pcDNA3.1-COL11A1-208組SGC-7901細(xì)胞增殖率、克隆數(shù)、侵襲數(shù)、劃痕面積愈合率均增加(P<0.05),與上述4組相比,si-COL11A1-208組SGC-7901細(xì)胞增殖率、克隆數(shù)、侵襲數(shù)、劃痕面積愈合率均減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1、2、3,表4。

圖1 過(guò)表達(dá)或敲低COL11A1-208對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

圖2 過(guò)表達(dá)或敲低COL11A1-208對(duì)SGC-7901細(xì)胞侵襲的影響(×400)

圖3 過(guò)表達(dá)或敲低COL11A1-208對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移的影響

表4 過(guò)表達(dá)或敲低COL11A1-208對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

2.4 過(guò)表達(dá)或敲低COL11A1-208對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白的影響

與Ctrl組、pcDNA3.1組、si-NC組比較,pcDNA3.1-COL11A1-208組SGC-7901細(xì)胞中Ki67、Cyclin D1、MMP9、N-cadherin表達(dá)均增加(P<0.05),與上述4組相比,si-COL11A1-208組SGC-7901細(xì)胞中Ki67、Cyclin D1、MMP9、N-cadherin表達(dá)均減少(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表5。

圖4 過(guò)表達(dá)或敲低COL11A1-208對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白的影響

表5 過(guò)表達(dá)或敲低COL11A1-208對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白的影響

3 討論

GC是最常見(jiàn)的癌癥類型之一,在中國(guó)每年約有38萬(wàn)GC新發(fā)病例,占全球每年癌癥診斷總數(shù)的40%[12]。GC早期癥狀隱匿,侵襲轉(zhuǎn)移較快,加之現(xiàn)有血清學(xué)腫瘤指標(biāo)的敏感性和特異性都不高,導(dǎo)致GC患者預(yù)后較差,生存期較短[13]。因此,尋找新的腫瘤標(biāo)志物,對(duì)GC患者的早期診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)具有重要意義。

近年來(lái),從基因?qū)用鎸ふ夷[瘤標(biāo)志物深受研究者青睞。人類基因組計(jì)劃顯示,編碼蛋白質(zhì)的基因只占整個(gè)基因組的2%,其余98%的基因被稱為非編碼RNA,根據(jù)轉(zhuǎn)錄本大小,可分為短非編碼RNA和LncRNA,其中LncRNA占總RNA的68%以上[14]。LncRNA通過(guò)與多種蛋白及核酸相互作用參與細(xì)胞功能調(diào)控,已有大量研究表明LncRNA是諸多癌癥的關(guān)鍵性調(diào)控因子,其異常表達(dá)與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等各種生物學(xué)行為有關(guān),被認(rèn)為是很有前景的診斷、預(yù)后生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)[15-16]。以GC為例,如LOC285194通過(guò)抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路抑制GC細(xì)胞增殖、侵襲,促進(jìn)其凋亡[17];LINC00974通過(guò)上調(diào)細(xì)胞分裂蛋白激酶6促進(jìn)GC細(xì)胞周期進(jìn)展而加速GC細(xì)胞增殖[18];LINC00641通過(guò)海綿吸附微小RNA-429以Notch-1表達(dá)而促進(jìn)GC的惡性進(jìn)展[19];NR027113通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路促進(jìn)GC細(xì)胞侵襲和遷移,同時(shí)與GC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良呈正相關(guān)[20-21]。

COL11A1-208為L(zhǎng)ncRNA家族新成員,有研究發(fā)現(xiàn)其在OSCC的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著重要的腫瘤促進(jìn)作用,有望成為OSCC的一個(gè)潛在生物標(biāo)志物[10-11]。而COL11A1-208在GC中的確切作用仍未可知。本研究結(jié)果顯示,COL11A1-208在GC癌組織中及GC細(xì)胞(AGS、MGC-803、MKN-45、BGC-823、SGC-7901)中均高達(dá),且在GC細(xì)胞中以SGC-7901細(xì)胞表達(dá)最高,提示COL11A1-208可能作為一種致癌基因參與GC的癌變過(guò)程。腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展是一個(gè)多因素、多步驟、漸進(jìn)的過(guò)程,伴隨著一系列基因表達(dá)異常,其中Ki67和Cyclin D1為評(píng)估細(xì)胞增殖狀況關(guān)鍵的兩個(gè)指標(biāo),二者的表達(dá)水平與細(xì)胞增殖活力呈正相關(guān)[22-23];MMP9是一種基質(zhì)金屬蛋白酶,可降解血管基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)而增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲、遷移能力,N-cadherin是一種廣泛存在于上皮組織中的鈣黏附蛋白,主要通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附而促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移[24-25]。本研究選取COL11A1-208表達(dá)量最高的SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)COL11A1-208后SGC-7901細(xì)胞增殖率、克隆數(shù)、侵襲數(shù)、劃痕面積愈合率及Ki67、Cyclin D1、MMP9、N-cadherin表達(dá)均增加,即過(guò)表達(dá)COL11A1-208可促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,而敲低COL11A1-208表達(dá)后SGC-7901細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力下降,證實(shí)COL11A1-208作為一種致癌基因參與GC的癌變過(guò)程,但其具體的調(diào)控分子機(jī)制和臨床潛力仍有待進(jìn)一步探索。

綜上所述,COL11A1-208在GC中高表達(dá),其可促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,COL11A1-208有望成為GC一個(gè)有前景的診斷、預(yù)后生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。