圈養(yǎng)孟加拉虎脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性

冼偉杭，張?zhí)煊?，賴健儀，王丙云，董貴信，3，陳志勝，陳勝鋒，白銀山，劉璨穎，張 暉，計(jì)慧琴

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山，528200；2.廣東長(zhǎng)隆集團(tuán)有限公司，廣州，511430；3.廣東華南珍稀野生動(dòng)物物種保護(hù)中心，珠海，519031）

孟加拉虎（Panthera tigris tigris）是一種珍稀野生動(dòng)物，保護(hù)這一珍稀動(dòng)物除恢復(fù)棲息地外，還可通過(guò)圈養(yǎng)維持物種數(shù)量。目前圈養(yǎng)的孟加拉虎常發(fā)腎炎［1］，常規(guī)治療方法是使用抗菌消炎藥物以及調(diào)節(jié)電解質(zhì)和水鹽平衡，但并不能修復(fù)受損器官組織結(jié)構(gòu)，即不能完全恢復(fù)腎臟功能，可能導(dǎo)致孟加拉虎死亡。因此，為保護(hù)孟加拉虎，需要找到一種新型且有效地用于孟加拉虎腎炎治療的方法。在這種情況下，一種涉及間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的療法——再生療法逐漸進(jìn)入人們的視野。從中胚層起源的干細(xì)胞稱為間充質(zhì)干細(xì)胞，具備自我更新和多向分化潛能［2-4］。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs）來(lái)源于脂肪，大量研究發(fā)現(xiàn)其在腎損傷治療上具有療效［5-12］，并且具有來(lái)源豐富、操作簡(jiǎn)便、容易獲取、體外增殖能力強(qiáng)等特征［13-15］，目前已經(jīng)從人、馬、豬和牛等物種中成功分離［16-23］。ADMSCs 能通過(guò)分化途徑分化為受損組織細(xì)胞［5，7-10］及通過(guò)旁分泌途徑分泌因子發(fā)揮干細(xì)胞募集、血管再生、減輕炎癥反應(yīng)和抗細(xì)胞凋亡等作用［5-10，12］，促進(jìn)受損組織的修復(fù)，進(jìn)而起到有效治療腎損傷的效果［5-12］。

基于AD-MSCs 在治療腎損傷方面的作用，認(rèn)為其具備治療虎腎病的潛能，但目前缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的分離、培養(yǎng)和鑒定虎AD-MSCs 的方法。本試驗(yàn)擬研究虎AD-MSCs 的分離方法、培養(yǎng)體系以及生物學(xué)特性，為虎的腎病等疾病治療提供種子細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

長(zhǎng)隆野生動(dòng)物園1歲雌性孟加拉虎。

1.2 脂肪采集及原代AD-MSCs的分離和培養(yǎng)

對(duì)孟加拉虎進(jìn)行腹部增生物切除手術(shù)時(shí)，在距離患處5 cm 處采集脂肪，然后結(jié)節(jié)縫合，將采集到的脂肪儲(chǔ)存在含有10%雙抗的1×phosphate buffered saline（PBS）中，冷藏保存運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。用含10%雙抗的PBS 洗去組織上的血液，清洗干凈后將組織放進(jìn)50 mL 離心管中，用無(wú)菌器械將組織剪碎，加入0.1%Ⅰ型膠原酶消化1 h 至無(wú)明顯組織塊后終止消化；將消化好的組織過(guò)濾并離心，棄上清，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸；進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后將細(xì)胞密度調(diào)整到1×106個(gè)/mL 并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，放置于培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，24 h 后觀察細(xì)胞貼壁情況。

1.3 細(xì)胞傳代培養(yǎng)、生長(zhǎng)特性觀察及生長(zhǎng)曲線的繪制

待細(xì)胞在培養(yǎng)皿生長(zhǎng)面積達(dá)到80%，吸去上清，用PBS 清洗。加入胰酶消化，40 s 后加入終止液終止消化。離心棄上清，傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和活性，拍照記錄。依次選取P3、P6、P9 代孟加拉虎AD-MSCs，調(diào)整細(xì)胞密度并接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 后，每天同一時(shí)間段選取5 孔，加入CCK8 孵育30 min，利用酶標(biāo)儀測(cè)量并記錄對(duì)應(yīng)OD 值，每孔測(cè)量3 次取平均值，持續(xù)8 d。以橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間，縱坐標(biāo)為OD 值繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

使用倒置顯微鏡對(duì)原代及傳代細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察并記錄。

1.5 AD-MSCs成脂誘導(dǎo)分化試驗(yàn)

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3 代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度接種到24 孔板中培養(yǎng)，各選取3 個(gè)孔作為對(duì)照組和試驗(yàn)組。對(duì)照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，試驗(yàn)組加入誘導(dǎo)分化A 液，誘導(dǎo)分化A 液由88.5%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10.0%胎牛血清、1.4%成脂誘導(dǎo)分化添加物A-Ⅰ和0.1%成脂誘導(dǎo)分化添加物A-Ⅱ構(gòu)成。培養(yǎng)3 d后加入B 液培養(yǎng)1 d 為1 個(gè)循環(huán)，誘導(dǎo)分化B 液由90.0%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、9.8%胎牛血清和成脂誘導(dǎo)分化添加物B構(gòu)成。試驗(yàn)組在培養(yǎng)3個(gè)循環(huán)后，棄上清，清洗，用多聚甲醛固定30 min，棄去多聚甲醛并清洗。用油紅O 染色30 min，染色結(jié)束清洗多余染液，利用倒置顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.6 AD-MSCs成骨誘導(dǎo)分化試驗(yàn)

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3 代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度接種到24 孔板中培養(yǎng)，各選取3 個(gè)孔作為對(duì)照組和試驗(yàn)組。對(duì)照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，試驗(yàn)組用成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)14～21 d可見細(xì)胞表面有明顯粗糙樣物質(zhì)，棄上清并清洗細(xì)胞，用多聚甲醛固定30 min，棄多聚甲醛并清洗，加入茜素紅染液染色30 min，染色結(jié)束清洗多余染液置于倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.7 總RNA提取及cDNA合成

將虎AD-MSCs 接種于6 孔板上，待細(xì)胞長(zhǎng)滿棄上清并用DEPC-H2O 清洗，然后按照以下步驟進(jìn)行：（1）用TRIzol 液裂解細(xì)胞后離心。（2）離心結(jié)束棄上清加入氯仿，混合靜置離心。（3）離心結(jié)束吸取上層水層至新的EP 管中，加入異丙醇混合離心。（4）離心結(jié)束后棄上清，加入乙醇，混合離心。（5）離心結(jié)束棄上清，沉淀室溫干燥后加入RNase-free ddH2O溶解沉淀并檢測(cè)濃度，結(jié)果顯示A260/A280值為1.867，可用于cDNA 合成。（6）cDNA 合成使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作，-20 ℃保存合成的cDNA。

1.8 PCR基因檢測(cè)

將cDNA 全組基因作為模板進(jìn)行PCR 體系擴(kuò)增，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，引物設(shè)計(jì)見表1。因產(chǎn)物大小在200～3 000 bp，所以需配制1.5% 的電泳膠，取0.75 g 瓊脂粉加熱溶解在60 mL 的1×TAE 緩沖液中，然后加入4 μL 核酸染液攪拌均勻，倒板并冷卻30 min，冷卻后依次加入DL2000 DNA Marker及PCR 產(chǎn)物，在電壓120 V、電流200 mA 的條件下電泳20 min，電泳結(jié)束后在照膠儀下觀察記錄電泳結(jié)果。

表1 MSCs相關(guān)基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of MSCs related genes

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

通過(guò)Ⅰ型膠原酶消化法得到原代培養(yǎng)的細(xì)胞呈圓形，部分貼壁細(xì)胞呈梭狀，胞體透亮（圖1A）；培養(yǎng)48 h 后，大量細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形，胞質(zhì)較大，折光性強(qiáng)（圖1B）；培養(yǎng)72 h 后，細(xì)胞生長(zhǎng)面積為70%～80%，可進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)（圖1C）；傳代細(xì)胞形態(tài)為均勻梭形（圖1D）；傳代培養(yǎng)至P6代細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定（圖1E）；細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生改變（圖1F）。

圖1 孟加拉虎AD-MSCs生長(zhǎng)狀況Fig.1 Growth of AD-MSCs in Bengal tiger

2.2 AD-MSCs生長(zhǎng)曲線

圖2顯示，P3、P6和P9代虎AD-MSCs的生長(zhǎng)曲線均為S型，P3、P6和P9培養(yǎng)至第4天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，P3、P6代細(xì)胞培養(yǎng)至第7天進(jìn)入平臺(tái)期，P9代細(xì)胞培養(yǎng)至第8天進(jìn)入平臺(tái)期。與P3、P6代細(xì)胞比，P9代細(xì)胞增殖能力下降。符合MSCs生長(zhǎng)曲線規(guī)律。

圖2 孟加拉虎AD-MSCs生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of AD-MSCs of Bengal tiger

2.3 AD-MSCs成脂誘導(dǎo)分化

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3 代細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)上沒有明顯變化，試驗(yàn)組細(xì)胞在加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基4 d 后，胞體變大變圓，部分細(xì)胞發(fā)生融合，且可見胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不一的脂質(zhì)顆粒，培養(yǎng)6 d 后脂滴增多變大。培養(yǎng)8 d，脂滴明顯，用油紅O 染色結(jié)果顯示試驗(yàn)組的脂滴能紅染（圖3B），對(duì)照組不被染色（圖3A），表明虎AD-MSCs具有脂向分化能力。

圖3 孟加拉虎AD-MSCs成脂誘導(dǎo)分化結(jié)果（100×）Fig.3 Adipogenic differentiation of Bengal tiger AD-MSCs（100×）

2.4 AD-MSCs成骨誘導(dǎo)分化

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3 代細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化鑒定，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)上沒有發(fā)生明顯變化。試驗(yàn)組加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，由長(zhǎng)梭狀變?yōu)轺[片狀，細(xì)胞成片狀堆積；誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d 細(xì)胞表面可見粗糙樣物質(zhì)，此時(shí)利用茜素紅進(jìn)行成骨染色。顯微鏡下觀察試驗(yàn)組可見細(xì)胞融合生長(zhǎng)，視野內(nèi)可見明顯紅染區(qū)域（圖4B），表明成骨誘導(dǎo)條件下細(xì)胞形成鈣結(jié)節(jié)。對(duì)照組視野下無(wú)明顯紅染區(qū)域（圖4A）。

圖4 孟加拉虎AD-MSCs成骨誘導(dǎo)分化結(jié)果（100×）Fig.4 Bone induced differentiation of Bengal tiger AD-MSCs（100×）

2.5 AD-MSCs表面標(biāo)記物基因檢測(cè)

PCR 基因檢測(cè)結(jié)果如圖5 所示，表面標(biāo)記物CD90、CD105、CD29 和CD44 在相應(yīng)范圍有明顯條帶，CD34 在相應(yīng)范圍無(wú)條帶，表明該細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD90、CD105、CD29 和CD44，不表達(dá)CD34，結(jié)果符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物特性。

圖5 孟加拉虎AD-MSCs表面標(biāo)記物基因檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Detection results of AD-MSCs surface marker genes in Bengal tiger

3 討論

圈養(yǎng)孟加拉虎常發(fā)腎炎疾病［1］，恢復(fù)受損組織的再生療法成為新的治療選擇。再生療法是以MSCs 為基礎(chǔ)的治療方式［24］。MSCs 是一種起源于中胚層的干細(xì)胞，具有自我更新能力和多向分化能力［2-4］，在體外培養(yǎng)能連續(xù)傳代且保持細(xì)胞的形態(tài)和特性。誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，能分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞。MSCs 具有免疫原性低、趨化歸巢、旁分泌和免疫調(diào)節(jié)等能力［2-3］，因此廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)的研究。AD-MSCs 與其他來(lái)源的MSCs 相比，具有來(lái)源豐富、供體創(chuàng)傷輕、易獲得和體外增殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)［13-15］。目前已經(jīng)成功從多種動(dòng)物上分離培養(yǎng)AD-MSCs，但虎脂肪來(lái)源的MSCs分離培養(yǎng)沒有研究報(bào)道。在多種疾病的治療上，ADMSCs被大量使用，其中在腎損傷治療的研究中也取得進(jìn)展，如犬、貓及小鼠的急性腎損傷、缺血性灌注腎損傷模型的治療中具備效果［5-12］。不同種屬的同種MSCs能表達(dá)相同表面標(biāo)記物，相同表面標(biāo)記物表達(dá)表明細(xì)胞具有相似的潛能［25-26］，因此虎AD-MSCs的分離方法、培養(yǎng)體系的建立具有重要意義，為后續(xù)虎AD-MSCs 的應(yīng)用建立基礎(chǔ)，為虎腎病的治療提供新式療法。

AD-MSCs分離方法主要為膠原酶消化法。本研究采?、裥湍z原酶消化法從脂肪組織分離得到虎的AD-MSCs。在顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形，生長(zhǎng)方式為旋渦狀生長(zhǎng)，與已有研究［16-23］分離的ADMSCs 形態(tài)描述結(jié)果相符。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)保持不變，均為長(zhǎng)梭形，P3、P6 和P9 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線符合MSCs 生長(zhǎng)曲線規(guī)律。P3、P6 代細(xì)胞增殖能力差異小，與P3、P6代細(xì)胞比，P9代細(xì)胞增殖能力下降。有研究表明，MSCs 在體外培養(yǎng)條件下，P3 至P6 MSCs 增殖速度快、形態(tài)良好、活性強(qiáng)。MSCs傳代至P9后，MSCs會(huì)出現(xiàn)空泡化、胞體變大及增殖緩慢等細(xì)胞老化現(xiàn)象［27］。根據(jù)MSCs 體外培養(yǎng)的特點(diǎn)可以為后續(xù)臨床應(yīng)用細(xì)胞代數(shù)的選擇提供參考，同時(shí)也要求完善體外培養(yǎng)體系，延緩細(xì)胞老化。

本研究使用PCR 檢測(cè)AD-MSCs 表面標(biāo)志物，通過(guò)PCR 擴(kuò)增得到相應(yīng)MSCs 特定表面標(biāo)記物基因片段。結(jié)果顯示在區(qū)間范圍內(nèi)有CD90、CD44、CD105及CD29條帶，無(wú)CD34條帶。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下，AD-MSCs 可向脂肪、骨和軟骨等方向分化。本試驗(yàn)分別對(duì)孟加拉虎AD-MSCs 進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)分化，檢測(cè)虎AD-MSCs 的多向分化能力。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基主要成分為地塞米松、抗壞血酸和β-甘油磷酸，其中地塞米松和抗壞血酸有利于骨成熟和細(xì)胞外基質(zhì)膠原的合成，而β-甘油磷酸鈉有利于細(xì)胞內(nèi)鈣鹽沉積和鈣化形成。沉積的鈣鹽可用茜素紅染液染成深紅色以便在顯微鏡下觀察。成脂誘導(dǎo)分化液中主要誘導(dǎo)因子有胰島素、IBMX、羅格列酮和地塞米松，能夠促進(jìn)MSCs 向脂肪方向誘導(dǎo)分化。上述結(jié)果均符合國(guó)際MSCs 標(biāo)準(zhǔn)定義，即：表達(dá)CD44、CD90、CD105和CD29等MSCs表面標(biāo)記物，不表達(dá)CD34等造血細(xì)胞表面標(biāo)志物；在特定條件下可誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞［16-23，28-29］。

本研究不提供細(xì)胞流式鑒定結(jié)果，原因是目前可以獲取的流式抗體因種屬特異性，無(wú)法在虎ADMSCs 上表達(dá)，不適用于虎AD-MSCs 的流式細(xì)胞術(shù)鑒定。

綜上所述，本研究成功建立虎AD-MSCs 原代分離培養(yǎng)方法，該方法操作簡(jiǎn)單方便，具有獲得大量虎AD-MSCs的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)通過(guò)誘導(dǎo)分化、表面標(biāo)記物表達(dá)等鑒定試驗(yàn)，表明所獲取細(xì)胞為虎AD-MSCs，為虎AD-MSCs的后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供穩(wěn)定的細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法。