ECM1基因在膀胱癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系

肖峰 姜錫男 舒露 石家齊 陳方敏 穆毅

1貴陽市第一人民醫(yī)院泌尿外科（貴陽 550002）；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科（貴陽 550001）；3天津市第三中心醫(yī)院泌尿外科（天津 300170）

膀胱癌（bladder cancer，BLCA）是全世界常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，每年有近38.6萬新發(fā)病例和15萬死亡病例［1］。在中國和美國，膀胱癌的發(fā)病率是泌尿系統(tǒng)腫瘤第1位，死亡率居第5位［2］。膀胱癌的發(fā)病率隨著患者年齡的增加而增加，男性約是女性的4倍［3］。膀胱癌分為非肌層浸潤性和肌層浸潤性膀胱癌兩類。非肌層浸潤性膀胱癌的典型治療方法是經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)加膀胱灌注化療。肌層浸潤性膀胱癌患者通常接受根治性膀胱切除術(shù)和盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)。非肌層浸潤性膀胱癌的5年生存率超過90%，復(fù)發(fā)率高達(dá)60%，約20%的患者處于進(jìn)展期［4］。同時(shí)，大約一半的接收手術(shù)治療的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。肌層浸潤性膀胱癌患者5年死亡率約為50%，局部進(jìn)展或復(fù)發(fā)的患者預(yù)后更差。因此，尋找新型標(biāo)志物預(yù)測膀胱癌復(fù)發(fā)及預(yù)后對(duì)其管理和治療至關(guān)重要。

細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1（extracellular matrix protein 1，ECM1）是一種在上皮中表達(dá)并分泌到細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白［5］。ECM1在乳腺癌、喉癌、肝癌、膽管癌、食管鱗癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)顯著增加［6-8］。此外，ECM1參與癌細(xì)胞增殖、血管生成、遷移和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)ECM1表達(dá)增加促進(jìn)多種癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，并且ECM1過表達(dá)已被納入癌癥患者不良預(yù)后和轉(zhuǎn)移潛能的評(píng)分模型中［9］。先前研究［10］報(bào)道ECM1與膀胱癌細(xì)胞的生長、遷移和凋亡密切相關(guān)，但ECM1表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系尚未有研究報(bào)道。因此，本研究通過對(duì)收治的膀胱癌患者作為研究對(duì)象，探討膀胱癌組織中ECM的表達(dá)與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年1月至2019年12月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行根治術(shù)治療的60例膀胱癌患者的癌組織及癌旁組織樣本。其中男22例，女38例；年齡33 ～ 73歲，平均（54.56 ± 8.62）歲。所有膀胱癌患者的病理類型由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)醫(yī)生獨(dú)立診斷。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后經(jīng)病理學(xué)鑒定為膀胱尿路上皮癌；（2）患者無放化療及膀胱癌靶向治療史；（3）臨床材料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在免疫系統(tǒng)等疾病者；（2）有心肝脾腎功能障礙和驗(yàn)證反復(fù)發(fā)作者；（3）有嚴(yán)重心臟疾病及認(rèn)知功能損傷者；（4）有感染性疾病患者。

1.2 ECM1 mRNA表達(dá)檢測采用是是熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測ECM1表達(dá)。將收集的癌組織樣本和癌旁組織樣本中提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。對(duì)cDNA進(jìn)行qRT-PCR進(jìn)行定量分析，具體操作步驟設(shè)置：95 ℃ 30 s，95 ℃30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共設(shè)置40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參。ECM1mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct方法計(jì)算。ECM1引物序列F：5'-CCTGGGCTGATCCACAACAT-3'；R：5'-TTGGCGTTCTCAGTGTCTCC-3'。GAPDH引物序列F：ACCCCGTGCTGCACCGAG-3'；R：5'-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3'。

1.3 免疫組化法檢測ECM1表達(dá)情況收集癌組織樣本和癌旁組織樣本，用10%中性多聚甲醛固定，冰凍切片。用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脫蠟，浸泡15 min。在無水乙醇中水化2次。蒸餾水沖洗后，用PBS浸泡，檸檬酸鈉修復(fù)，10%山羊血清封閉，標(biāo)一抗ECM1，洗滌后，標(biāo)二抗，添加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素液。DAB顯色后，用自來水沖洗，封片，顯微鏡下觀察，拍照。根據(jù)染色強(qiáng)度對(duì)蛋白表達(dá)陽性、陰性評(píng)分。

1.4 隨訪術(shù)后通過電話訪問、門診復(fù)查等方式對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2022年12月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析。計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組件比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；Kaplan-Meier曲線分析ECM1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系；Cox風(fēng)險(xiǎn)比列回歸模型評(píng)估膀胱癌患者預(yù)后的影響因素。P＜ 0.05為代表數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ECM1在膀胱癌組織及癌旁組織中表達(dá)的比較通過qRT-PCR檢測了60例膀胱癌患者癌組織及癌旁組織中ECM1的mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，根據(jù)ECM1表達(dá)的均值（2.03 ±0.21，P＜ 0.01），分為ECM1高表達(dá)組和ECM1低表達(dá)組，膀胱癌組織中ECM1的mRNA表達(dá)水平顯著增加。IHC染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織中ECM1蛋白陽性率56.67%，癌旁組織中陽性率為13.33%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表1、圖1。

圖1 膀胱癌和癌旁組織中ECM1的免疫組化檢測結(jié)果Fig.1 Immunohistochemical results of ECM1 in bladder cancer and paracancer tissue

表1 ECM1在膀胱癌組織和癌旁組織中表達(dá)Tab.1 Expression of ECM1 in bladder cancer and adjacent tissues ±s

表1 ECM1在膀胱癌組織和癌旁組織中表達(dá)Tab.1 Expression of ECM1 in bladder cancer and adjacent tissues ±s

組別ECM1 mRNA ECM1 蛋白陽性［例（%）］癌組織4.96 ± 0.55 34（56.67）癌旁組織1.05 ± 0.04 8（13.33）t/χ2值78.32 24.76 P值＜ 0.05＜ 0.05

2.2 ECM表達(dá)在膀胱癌患者臨床病理特征中的比較ECM1在膀胱癌病理Ⅲ級(jí)、TNMⅢ-Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達(dá)顯著高于病理Ⅰ-Ⅱ級(jí)、TNMⅠ-Ⅱ期及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜ 0.05）；ECM1表達(dá)在性別、年齡、吸煙史、肌層浸潤、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量等方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 ECM1表達(dá)在膀胱癌患者不同臨床病理參數(shù)中比較Tab.2 The expression of ECM1 was compared in different clinicopathological parameters of bladder cancer ±s

表2 ECM1表達(dá)在膀胱癌患者不同臨床病理參數(shù)中比較Tab.2 The expression of ECM1 was compared in different clinicopathological parameters of bladder cancer ±s

項(xiàng)目性別男女年齡例數(shù)ECM1表達(dá)t值P值22 38 4.71 ± 0.43 4.75 ± 0.44 0.3421 0.7335＜ 50歲≥ 50歲吸煙史是否肌層浸潤是否病理分級(jí)Ⅰ-Ⅱ級(jí)Ⅲ級(jí)TNM分期Ⅰ-Ⅱ級(jí)Ⅲ級(jí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否腫瘤大小≤ 3 cm＞ 3 cm 28 32 4.80 ± 0.40 4.78 ± 0.42 0.1881 0.8514 34 26 4.81 ± 0.46 4.86 ± 0.44 0.4507 0.6537 36 24 4.91 ± 0.50 4.89 ± 0.53 0.1482 0.8827 20 40 2.93 ± 0.51 4.95 ± 0.53 14.09 0.0010 26 34 2.74 ± 0.33 4.91 ± 0.50 19.15 0.0010 24 36 5.01 ± 0.47 2.51 ± 0.20 28.38 0.0010 30 30 4.67 ± 0.38 4.69 ± 0.39 0.2012 0.8413

2.3 ECM1表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系所有患者隨訪3年，60例膀胱癌患者死亡22例，生存38例，總生存率為63.33%。ECM1高表達(dá)這3年生存率為47.06%（16/34），低于低表達(dá)者的84.62%（22/26）；ECM1高表達(dá)和低表達(dá)患者總生存率比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.262，P＜ 0.01），ECM1高表達(dá)的膀胱癌患者預(yù)后更差，生存曲線見圖2。

圖2 ECM1高表達(dá)及低表達(dá)的生存曲線Fig.2 Survival curve of ECM1 with high and low expression

接下來，我們分析了TCGA-BLAC數(shù)據(jù)集中ECM1表達(dá)與患者的預(yù)后關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ECM1高表達(dá)組的膀胱癌患者預(yù)后較ECM1低表達(dá)組的預(yù)后生存時(shí)間短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見圖3。

圖3 基于GEPIA 在線數(shù)據(jù)庫分析 ECM1高表達(dá)及低表達(dá)的生存曲線Fig.3 Survival curve of ECM1 with high and low expression based on GEPIA

2.4 Cox回歸分析影響膀胱癌患者預(yù)后的因素以膀胱癌患者預(yù)后為因變量，以ECM1高表達(dá)、病理分級(jí)Ⅲ、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為自變量，進(jìn)行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，ECM1高表達(dá)是影響膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜ 0.001），見表3。

表3 影響膀胱癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析Tab.3 Multivariate Cox regression analysis of prognostic factors in patients with bladder cancer

3 討論

膀胱癌是全球第十大常見惡性腫瘤之一，每年導(dǎo)致約15萬例死亡。膀胱癌給各國社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來負(fù)擔(dān)，發(fā)病率和死亡率非常高。盡管在過去的幾十年里進(jìn)行了大量的研究，取得了很大的進(jìn)步，但5年生存率仍然不理想。因此，尋找與膀胱癌密切相關(guān)的生物標(biāo)志物對(duì)其早期診斷及個(gè)體化治療具有重要意義。

ECM1最初于1994年被鑒定為一種大小為85 kDa的糖蛋白。目前，研究［11］表明ECM1參與多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、血管生成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移等過程。在大多數(shù)癌癥中，ECM1被發(fā)現(xiàn)促進(jìn)癌癥的進(jìn)展和侵襲，ECM1過表達(dá)被認(rèn)為是不良預(yù)后的標(biāo)志物，然而，關(guān)于ECM1在膀胱癌中的研究很少。本研究中，分析了60例旁觀癌患者癌組織和癌旁組織中ECM1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ECM1在膀胱癌癌組織中表達(dá)顯著增加。這一結(jié)果與之前報(bào)道［12］的結(jié)果一致。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)ECM1在膀胱癌患者病理Ⅲ級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期后期表達(dá)顯著增加，這結(jié)果說明ECM1表達(dá)與臨床病理相關(guān)。ECM1發(fā)揮癌基因的功能，與在肺癌和肝癌的研究結(jié)果［13］相似。因此，筆者認(rèn)為ECM1是膀胱癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

先前的研究［14］顯示ECM1高表達(dá)與乳腺癌及肝細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后相關(guān)；這提示ECM1高表達(dá)在膀胱癌患者是否影響患者的預(yù)后。本研究分析結(jié)果顯示：60例膀胱癌患者死亡22例，生存38例，總生存率為63.33%。ECM1高表達(dá)這3年生存率為47.06%（16/34），低于低表達(dá)者的84.62%（22/26）；ECM1高表達(dá)和低表達(dá)患者總生存率比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.262，P＜ 0.01），ECM1高表達(dá)的膀胱癌患者預(yù)后更差。進(jìn)一步進(jìn)行Cox多因素回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ECM1可以作為膀胱癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

本研究存在一些局限性，僅僅分析了膀胱癌組織中的表達(dá)差異，沒有收集患者及健康人血液樣本進(jìn)行分析。在未來的研究中將進(jìn)行大樣本的分析及血液樣本中的研究。

綜上所述，膀胱癌組織中ECM1表達(dá)水平升高，與膀胱癌患者病理分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，同時(shí)ECM1為膀胱癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。