扁蒴藤素調(diào)節(jié)ROS/ASK1/JNK信號(hào)通路對(duì)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝癌的抑制作用

劉燕 張冬華 黃渝茜 劉有順 黃驥

1贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部解剖與組胚教研室（江西贛州 341000）；2贛州市人民醫(yī)院（江西贛州 341000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最致命的癌癥之一，與肝硬化和纖維化密切相關(guān)，發(fā)展中國(guó)家的HCC病死率和發(fā)病率更高，肝癌在初始階段通常無(wú)癥狀，通常在晚期才能診斷出來(lái)，這使得手術(shù)成功變得更加困難［1］。HCC的治療策略包括化療、放療、手術(shù)和免疫治療。然而，這些治療中的大多數(shù)都伴隨著嚴(yán)重的副作用和復(fù)發(fā)?，F(xiàn)在急需開(kāi)發(fā)一種新型抗癌藥物，能夠提高治療效果［2］。二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）是一種強(qiáng)致癌的二烷基亞硝胺，存在于煙草煙霧、切達(dá)干酪、肉類(lèi)和威士忌中。DEN代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可能在癌癥發(fā)展中起重要作用［3］。扁蒴藤素（pristimeri，Pris）是一種從衛(wèi)矛科和海馬科植物中分離出來(lái)的天然生物活性成分，EL-AGAMY等［4］發(fā)現(xiàn)，Pris可以作為抗自身免疫性肝炎的新型保肝劑。Pris還具有抗腫瘤作用，Pris可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡緩解HCC［5］。ROS/ASK1/JNK信號(hào)軸是癌癥研究的常見(jiàn)通路，研究發(fā)現(xiàn)［6］，激活ROS/ASK1/JNK途徑可以誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌凋亡。ZHAO等［7］發(fā)現(xiàn)Pris激活ROS/ASK1/JNK途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬抑制乳腺癌的發(fā)生。近期，LI等［8］發(fā)現(xiàn)激活ROS/ASK1/JNK信號(hào)軸可以激活氧化應(yīng)激緩解HCC。本研究旨在探究Pris是否可以通過(guò)激活ROS/ASK1/JNK信號(hào)軸促進(jìn)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激進(jìn)而抑制HCC。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠（200 ～ 220 g）（許可證號(hào)：SCXK（浙）2022-0005）購(gòu)自杭州啟真實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，12 h的光/暗交替進(jìn)行，自由采食和飲水，溫度設(shè)置為23 ～ 27 ℃，相對(duì)濕度為40% ～ 65%。實(shí)驗(yàn)方案獲得本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2023J0017）。

1.2 主要試劑Pris、谷胱甘肽還原酶（GR）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司；ROS/ASK1/JNK信號(hào)通路抑制劑Vaccarin購(gòu)自MedChemExpress LLC；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；白介素6（IL-6）試劑盒、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（CCL2）試劑盒武漢華美生物工程有限公司；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司；Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-ASK1、ASK1、p-JNK、JNK抗體均購(gòu)自Abcam。ROS試劑盒購(gòu)自上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 模型制備及分組隨機(jī)選擇6只大鼠作為對(duì)照組，其余大鼠參照先前文獻(xiàn)［9］造模，首先按照200 mg/kg的劑量通過(guò)腹腔注射DEN，每周1次，連續(xù)注射16周誘導(dǎo)HCC大鼠模型，隨機(jī)選擇3只大鼠進(jìn)行HE染色。根據(jù)肝臟病理變化判斷是否造模成功。將造模成功大鼠隨機(jī)平分為HCC組、Pris組、Vaccarin組、Pris + Vaccarin組，每組均6只大鼠。Pris組參考先前文獻(xiàn)［4］通過(guò)腹腔注射0.8 mg/kg的Pris，連續(xù)注射1周；Vaccarin組參考先前文獻(xiàn)［10］通過(guò)腹腔注射100 mg/kg ROS/ASK1/JNK信號(hào)通路抑制劑Vaccarin，連續(xù)注射一周；Pris + Vaccarin組在注射0.8 mg/kg的Pris的基礎(chǔ)上注射100 mg/kg-Vaccarin，連續(xù)注射1周。HCC組和對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1.4 測(cè)量體質(zhì)量、肝質(zhì)量以及樣本采集藥物治療結(jié)束24 h用電子稱(chēng)測(cè)量大鼠體質(zhì)量，隨后將大鼠麻醉，用采血針通過(guò)腹主動(dòng)脈采取5 mL血液通過(guò)離心機(jī)4 000轉(zhuǎn)，離心8 min后獲取上清液，保存在-20 ℃用于ELISA試劑盒檢測(cè)。將大鼠處死解剖后取肝組織樣本稱(chēng)量質(zhì)量后，一部分固定在4%多聚甲醛用于病理變化觀察，一部分保存在-80 ℃用于Western blot檢測(cè)和ELISA檢測(cè)。肝臟體質(zhì)量比=（肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量）× 100%。

1.5 ELISA法檢測(cè)肝功能、炎性因子、抗氧化指標(biāo)采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清IL-6、TNF-α、CCL-2、SOD、GR、GPx、CAT、ROS含量，以及肝臟組織ALT、AST、ALP、LDH水平。

1.6 HE染色檢測(cè)肝臟病理變化取上述4%多聚甲醛固定的肝臟組織用乙醇脫水后包埋在石蠟中，切成4 ～ 5 μm的石蠟切片，用蘇木精和伊紅（H&E）染色。最后用中性樹(shù)膠封片，用顯微鏡觀察肝臟病理變化。

1.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡標(biāo)志物（Bax、Bcl-2和cleaved-Caspase-3）以及ROS/ASK1/JNK信號(hào)通路蛋白表達(dá)使用RIPA裂解緩沖液提取肝臟組織的總蛋白，蛋白質(zhì)濃度通過(guò)BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒定量，將等量蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉膜，在4 ℃與下列一抗孵育一夜：Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶1 000）、cleaved-Caspase-3（1∶1 000）、ASK1（1∶2 000）、JNK（1∶2 000）、p-ASK1（1∶2 000）、p-JNK（1∶2 000）和GAPDH抗體（1∶1 000），TBST洗滌后，加入二抗，加ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)觀察目的條帶，目的條帶使用Image J軟件進(jìn)行半定量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均用SPSS 25軟件處理，數(shù)據(jù)在進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)后以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析比較多組間差異，SNK-q檢驗(yàn)比較兩組間差異。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pris對(duì)大鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量以及肝臟體質(zhì)量比的影響與對(duì)照組相比，HCC組體質(zhì)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），肝臟質(zhì)量、肝臟體質(zhì)量比顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與HCC組相比，Pris組體質(zhì)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），肝臟質(zhì)量、肝臟體質(zhì)量比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），而Vaccarin組趨勢(shì)相反；與Pris組相比，Pris+Vaccarin組體質(zhì)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），肝臟質(zhì)量、肝臟體質(zhì)量比顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量以及肝臟體質(zhì)量比的比較Tab.1 Comparison of body weight，liver weight，and liver weight ratio of rats in each group ±s，n = 6

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量以及肝臟體質(zhì)量比的比較Tab.1 Comparison of body weight，liver weight，and liver weight ratio of rats in each group ±s，n = 6

注：與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與HCC組比較，bP ＜ 0.05；與Pris組比較，cP ＜ 0.05

肝臟體質(zhì)量比（%）3.04 ± 0.24 8.31 ± 0.63a 3.42 ± 0.27b 17.32 ± 1.25b 7.20 ± 0.61c 296.136＜ 0.001組別對(duì)照組HCC組Pris組Vaccarin組Pris+Vaccarin組F值P值體質(zhì)量（g）410.28 ± 55.34 281.14 ± 33.54a 389.21 ± 46.83b 200.45 ± 24.37b 298.16 ± 35.36c 26.566＜ 0.001肝臟質(zhì)量（g）12.49 ± 1.28 23.35 ± 2.14a 13.34 ± 1.26b 34.73 ± 3.05b 21.46 ± 2.14c 112.499＜ 0.001

2.2 Pris對(duì)大鼠肝功能的影響與對(duì)照組相比，HCC組ALT、AST、ALP、LDH含量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與HCC組相比，Pris組ALT、AST、ALP、LDH含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），而Vaccarin組與Pris組趨勢(shì)相反；與Pris組相比，Pris+Vaccarin組ALT、AST、ALP、LDH含量顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表2。

表2 Pris對(duì)大鼠ALT、AST、ALP、LDH含量的影響Tab.2 Effect of Pris on the contents of ALT，AST，ALP，and LDH in rats ±s，n = 6

表2 Pris對(duì)大鼠ALT、AST、ALP、LDH含量的影響Tab.2 Effect of Pris on the contents of ALT，AST，ALP，and LDH in rats ±s，n = 6

注：與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與HCC組比較，bP ＜ 0.05；與Pris組比較，cP ＜ 0.05

組別對(duì)照組HCC組Pris組Vaccarin組Pris+Vaccarin組F值P值LDH（U/mL）311.57 ± 36.18 591.08 ± 63.12a 421.44 ± 45.16b 930.61 ± 95.07b 501.17 ± 53.12c 86.871＜ 0.001 ALT（U/mL）105.35 ± 11.82 279.58 ± 30.97a 134.57 ± 21.57b 416.46 ± 54.64b 210.21 ± 21.13c 93.460＜ 0.001 AST（U/mL）136.23 ± 18.64 354.14 ± 40.42a 186.07 ± 20.63b 532.48 ± 57.26b 304.57 ± 38.43c 101.324＜ 0.001 ALP（U/mL）140.89 ± 17.09 313.43 ± 38.46a 191.34 ± 20.11b 436.56 ± 49.69b 283.01 ± 30.32c 70.912＜ 0.001

2.3 Pris對(duì)大鼠炎性因子、抗氧化指標(biāo)的影響與對(duì)照組相比，HCC組IL-6、TNF-α、CCL-2含量、SOD、GR、GPx和CAT含量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與HCC組相比，Pris組IL-6、TNF-α、CCL-2含量、SOD、GR、GPx和CAT含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），而Vaccarin組結(jié)果相反；與Pris組相比，Pris+Vaccarin組IL-6、TNF-α、CCL-2含量、SOD、GR、GPx和CAT含量顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表3、4。

表3 Pris對(duì)大鼠IL-6、TNF-α、CCL-2含量的影響Tab.3 Effects of Pris on IL-6，TNF-α，and CCL-2 contents in rats ±s，n = 6

表3 Pris對(duì)大鼠IL-6、TNF-α、CCL-2含量的影響Tab.3 Effects of Pris on IL-6，TNF-α，and CCL-2 contents in rats ±s，n = 6

注：與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與HCC組比較，bP ＜ 0.05；與Pris組比較，cP ＜ 0.05

TNF-α（pg/mL）0.76 ± 0.10 3.47 ± 0.44a 1.27 ± 0.16b 6.57 ± 0.68b 3.00 ± 0.35c 193.237＜ 0.001組別對(duì)照組HCC組Pris組Vaccarin組Pris+Vaccarin組F值P值CCL-2（pg/mL）103.64 ± 14.15 251.35 ± 25.37a 123.98 ± 13.26b 368.48 ± 47.58b 205.24 ± 24.24c 88.266＜ 0.001 IL-6（pg/mL）22.32 ± 2.73 54.34 ± 5.54a 33.59 ± 3.37b 69.57 ± 6.37b 49.34 ± 4.29c 93.392＜ 0.001

表4 Pris對(duì)大鼠SOD、GR、GPx和CAT含量的影響Tab.4 Effect of Pris on SOD，GR，GPx，and CAT contents in rats ±s，n = 6

表4 Pris對(duì)大鼠SOD、GR、GPx和CAT含量的影響Tab.4 Effect of Pris on SOD，GR，GPx，and CAT contents in rats ±s，n = 6

注：與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與HCC組比較，bP ＜ 0.05；與Pris組比較，cP ＜ 0.05

組別對(duì)照組HCC組Pris組Vaccarin組Pris+Vaccarin組F值P值CAT（U/mL）31.14 ± 2.42 46.23 ± 6.64a 33.07 ± 4.63b 61.48 ± 7.26b 43.57 ± 4.43c 84.278＜ 0.001 SOD（U/mL）14.35 ± 2.37 23.64 ± 3.15a 16.48 ± 1.58b 33.98 ± 5.26b 19.24 ± 2.04c 15.618＜ 0.001 GR（U/mL）16.35 ± 1.63 28.78 ± 2.91a 18.21 ± 1.78b 37.45 ± 4.75b 24.67 ± 2.56c 72.724＜ 0.001 GPx（U/mL）9.58 ± 0.97 15.35 ± 1.82a 10.46 ± 1.24b 34.57 ± 4.57b 13.21 ± 1.56c 84.278＜ 0.001

2.4 Pris對(duì)大鼠肝臟病理變化的影響對(duì)照組大鼠表現(xiàn)出正常的肝臟組織結(jié)構(gòu)；HCC組可以觀察到部分肝細(xì)胞壞死，出現(xiàn)局灶性結(jié)節(jié)性增生現(xiàn)象；Pris組改善了肝細(xì)胞壞死以及局灶性結(jié)節(jié)性增生現(xiàn)象，而Vaccarin組出現(xiàn)大片肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞體積增大；Pris+Vaccarin組與HCC組結(jié)構(gòu)相似，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肝臟病理變化（× 200）Fig.1 Pathological changes in liver of rats in each group（× 200）

2.5 Pris對(duì)大鼠凋亡標(biāo)志蛋白的影響與對(duì)照組相比，HCC組Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著下調(diào)（P＜ 0.05），Bcl-2蛋白水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與HCC組相比，Pris組Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），Bcl-2蛋白水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），而Vaccarin組與Pris組蛋白水平相反；與Pris組相比，Pris+Vaccarin組Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），Bcl-2蛋白水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)圖2，表5。

圖2 Western blot法檢測(cè)凋亡標(biāo)志蛋白水平Fig.2 Western blot method for detecting the level of apoptosis marker protein

表5 Pris對(duì)大鼠Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3蛋白水平的影響Tab.5 Effect of Pris on Bax，Bcl-2，and cleaved-Caspase-3 protein levels in rats ±s，n = 6

表5 Pris對(duì)大鼠Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3蛋白水平的影響Tab.5 Effect of Pris on Bax，Bcl-2，and cleaved-Caspase-3 protein levels in rats ±s，n = 6

注：與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與HCC組比較，bP ＜ 0.05；與Pris組比較，cP ＜ 0.05

cleaved-Caspase-3/GAPDH 1.37 ± 0.16 0.96 ± 0.10a 1.31 ± 0.14b 0.48 ± 0.05b 1.00 ± 0.12c 80.433＜ 0.001組別Bax/GAPDH Bcl-2/GAPDH對(duì)照組HCC組Pris組Vaccarin組Pris+Vaccarin組F值P值1.26 ± 0.13 0.68 ± 0.05a 1.13 ± 0.09b 0.39 ± 0.02b 0.71 ± 0.06c 120.314＜ 0.001 0.74 ± 0.08 1.33 ± 0.15a 0.89 ± 0.17b 1.82 ± 0.09b 1.30 ± 0.15c 55.055＜ 0.001

2.6 Pris對(duì)大鼠ROS及ROS/ASK1/JNK信號(hào)通路蛋白水平的影響與對(duì)照組相比，HCC組ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與HCC組相比，Pris組ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而Vaccarin組ROS、ASK1、JNK水平顯著下降；與Pris組相比，Pris+Vaccarin組ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3、4，表6。

圖3 Western blot法檢測(cè)ROS/ASK1/JNK通路蛋白水平Fig.3 Western blot method for detecting ROS/ASK1/JNK pathway protein levels

表6 Pris對(duì)大鼠ROS/ASK1/JNK通路蛋白水平的影響Table 6 Effect of Pris on ROS/ASK1/JNK pathway protein levels in rats ±s，n = 6

表6 Pris對(duì)大鼠ROS/ASK1/JNK通路蛋白水平的影響Table 6 Effect of Pris on ROS/ASK1/JNK pathway protein levels in rats ±s，n = 6

注：與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05；與HCC組比較，bP ＜ 0.05；與Pris組比較，cP ＜ 0.05

p-JNK/JNK 0.78 ± 0.09 0.44 ± 0.05a 0.72 ± 0.09b 0.27 ± 0.04b 0.50 ± 0.06c 54.753＜ 0.001組別對(duì)照組HCC組Pris組Vaccarin組Pris+Vaccarin組F值P值ROS（mg/mL）25.00 ± 2.89 10.66 ± 1.05a 21.91 ± 2.07b 5.34 ± 0.52b 13.70 ± 1.46c 116.200＜ 0.001 p-ASK1/ASK1 0.95 ± 0.05 0.52 ± 0.04a 0.83 ± 0.07b 0.38 ± 0.03b 0.66 ± 0.05c 158.283＜ 0.001

3 討論

HCC是肝細(xì)胞的原發(fā)性惡性腫瘤，根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的SEER數(shù)據(jù)庫(kù)，美國(guó)HCC患者的平均5年生存率為19.6%，但晚期轉(zhuǎn)移性患者生存率可低至2.5%。當(dāng)在早期階段確診時(shí)，可以進(jìn)行局部治療，包括手術(shù)切除、射頻消融、經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞或肝移植。然而，HCC通常在腫瘤不可切除的晚期被診斷出來(lái)，使得這些治療無(wú)效［11-12］。DEN是一種成熟的肝癌物質(zhì)，它會(huì)引發(fā)肝損傷，并經(jīng)常用于在動(dòng)物模型中引發(fā)肝癌發(fā)生［13］。據(jù)報(bào)道［14］，DEN誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的病理過(guò)程與人類(lèi)肝癌更相似。因此，DEN誘導(dǎo)的肝癌動(dòng)物模型被廣泛用于肝癌研究。本研究通過(guò)注射DEN構(gòu)建HCC大鼠模型，HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠表現(xiàn)出正常的肝臟組織結(jié)構(gòu)；HCC組可以觀察到部分肝細(xì)胞壞死，出現(xiàn)局灶性結(jié)節(jié)性增生現(xiàn)象，提示HCC大鼠造模成功。Pris可以通過(guò)影響細(xì)胞凋亡、自噬、遷移、侵襲、血管生成等腫瘤相關(guān)過(guò)程起到抗癌作用［15］。近期研究［5］發(fā)現(xiàn)，Pris可以通過(guò)抑制細(xì)胞活力、遷移和血管生成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制HCC發(fā)展。在本研究中，HCC組較對(duì)照組大鼠體質(zhì)量顯著下降，肝臟質(zhì)量、肝臟體質(zhì)量比顯著升高，而Pris處理改善了肝細(xì)胞壞死以及局灶性結(jié)節(jié)性增生現(xiàn)象，Pris組較HCC組體質(zhì)量顯著升高，肝臟質(zhì)量、肝臟體質(zhì)量比顯著下降，表明Pris可以對(duì)HCC大鼠產(chǎn)生積極影響。

細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激在HCC發(fā)展過(guò)程中起重要作用。Bcl-2、Bax及cleaved-Caspase-3是參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白［16-18］。而氧化應(yīng)激抑制HCC的發(fā)生［19］。AST、ALT、ALP、LDH可用作診斷化學(xué)物質(zhì)和藥物引發(fā)的肝功能改變的生物標(biāo)志物［20］。研究報(bào)道稱(chēng)，DEN誘導(dǎo)的HCC大鼠血清AST、ALT、ALP、LDH水平顯著升高［21］。KUMAR等［22］發(fā)現(xiàn)，HCC大鼠體內(nèi)IL-6、TNF-α水平顯著升高，加重了炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果與先前研究一致顯示，HCC組較對(duì)照組Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著下降，ALT、AST、ALP、LDH含量、IL-6、TNF-α、CCL-2含量、SOD、GR、GPx、CAT含量、Bcl-2蛋白水平顯著增加，表明DEN處理后大鼠炎癥反應(yīng)升高、肝損傷加重，細(xì)胞凋亡較低。而Pris治療后促進(jìn)了氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡，減輕了肝損傷，從而抑制HCC。

通過(guò)調(diào)控ROS/ASK1/JNK信號(hào)軸促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制癌癥的發(fā)展已多有報(bào)道。例如，MHONE等［23］發(fā)現(xiàn)激活ROS/ASK1/JNK信號(hào)軸可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制肺腺癌的發(fā)生。且已有研究［8］發(fā)現(xiàn)，Pris可以通過(guò)激活ROS/ASK1/JNK信號(hào)軸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡制乳腺癌的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，HCC組較對(duì)照組ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平顯著下降，而Pris治療后ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平顯著升高，提示Pris可能通過(guò)激活ROS/ASK1/JNK信號(hào)軸抑制HCC的發(fā)生，為了進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論，我們用ROS/ASK1/JNK信號(hào)軸抑制劑Vaccarin處理HCC大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Vaccarin逆轉(zhuǎn)了Pris對(duì)HCC大鼠的抗癌效果。

綜上所述，Pris可能通過(guò)上調(diào)ROS/ASK1/JNK信號(hào)通路促進(jìn)氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善HCC大鼠肝損傷。本文的新穎之處是首次研究了ROS/ASK1/JNK信號(hào)軸在HCC上的影響，進(jìn)一步研究了Pris在HCC上的作用機(jī)制，本研究為治療HCC提供實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)以及潛在治療藥物。本文不足時(shí)，缺少對(duì)Pris治療的最適劑量的探究以及Pris是否可以調(diào)控其它通路起到相同效果，這將是后續(xù)研究的方向。