LncRNA SNHG16靶向調控miR-516a-5p對結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響

楊豐帥 邱東達 楊運泉 龔雙喜 陳石林 汪欣宇

長沙市第一醫(yī)院胃腸外科（長沙 410005）

結直腸癌為消化道常見惡性腫瘤，臨床發(fā)病率逐年升高，發(fā)病早期，患者無明顯癥狀，多數患者確診時已為晚期，可造成患者不良預后。結直腸癌臨床發(fā)病機制復雜，故對其分子機制進行分析，尋找治療結直腸癌新途徑具有重要意義。臨床研究顯示，在結直腸癌發(fā)展過程中，LncRNA、miRNAs可作為促癌、抑癌基因，對細胞的增殖、侵襲、凋亡進行調控［1］。lncRNA可對基因的轉錄進行調節(jié)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中作用較為重要，lncRNA SNHG16可促進多種腫瘤發(fā)展，且與腫瘤的分期、耐藥具有一定相關性，可對機體內相關信號通路進行調節(jié)［2］。miR-516a-5p在肝癌、肺癌、結直腸癌等多種腫瘤中表達下降，可對多種蛋白進行調節(jié)，進而控制細胞的增殖、遷移［3］。臨床研究中，暫未有研究顯示lncRNA SNHG16可靶向調控miR-516a-5p對結直腸癌細胞的增殖、遷移進行調節(jié)，基于此，本研究分析干擾lncRNA SNHG16調控miR-516a-5p對結直腸癌細胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑人結直腸癌細胞系（HCT116、SW620、SW480）購自于上海撫生實業(yè)有限公司，結直腸上皮細胞FHC購自上海澳音生物科技有限公司。DMEM完全培養(yǎng)液（北京信生元生物醫(yī)學科技有限公司）；培養(yǎng)箱（杭州諾丁科學器材有限公司）；電化學發(fā)光試劑盒（上海聯碩生物科技有限公司）；全蛋白提取試劑盒（昆山遠慕生物科技有限公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒（武漢益普生物科技有限公司）；四甲基聯苯胺（TMB）溶液（上?；钌锟萍加邢薰荆籶cDNA、lncRNA SNHG16、anti-miR-NC、anti-miRNA-516a-5p、si-NC、si-SNHG16、miRNC、miRNA-516a-5p購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；CyclinD1、MMP-2、MMP-9、GADTH抗體購自上海延慕實業(yè)有限公司。

1.2 標本來源選取2022年3月至2023年3月在醫(yī)院進行手術治療的20例結直腸癌患者，取患者結直腸癌組織、癌旁組織，該研究經患者、家屬知情同意，經我院倫理委員會審核批準。

1.3 細胞培養(yǎng)將FHC、HCT116、SW620、SW480細胞，均置于含1%雙抗、10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中予以培養(yǎng)，此培養(yǎng)基內含10%的滅活的FBS，在CO25% 37 ℃的培養(yǎng)箱內予以培育，當細胞的融合度至80%時，選取胰蛋白酶（0.25%）對細胞進行消化，后對其實施傳代培育，選用3次以上傳代的對數生長期的細胞予以后續(xù)的試驗。

1.4 細胞轉染取SW480細胞，作為NC組，對SW480細胞轉染si-NC，作為si-NC組，對SW480細胞做SNHG16抑制劑轉染，作為si-SNHG16組，miR-NC組為SW480細胞轉染miR-NC，miR-516a-5p組為SW480細胞轉染miR-516a-5p模擬物，si-SNHG16+anti-miR-NC組為SW480細胞做SNHG16抑制劑轉染+anti-miR-NC，si-SNHG16+anti-miR-516a-5p組SW480細胞做SNHG16抑制劑轉染+miR-516a-5p抑制劑，分組后，繼續(xù)對細胞培養(yǎng)，細胞融合度為80%后，進行轉染，連續(xù)轉染24 h。

1.5 檢測方法

1.5.1 lncRNA SNHG16、miR-516a-5p表達水平檢測提取癌組織、癌旁組織，放入液氮中研磨，根據試劑盒說明書提取總RNA，后轉錄為cDNA，采用RT-PCR對lncRNA SNHG16、miR-516a-5p表達量進行鑒定，反應條件：95 ℃預變性3 min、95 ℃變性5 s、56 ℃退火10 s，72 ℃ 25，進行40個循環(huán)，72 ℃ 10 min，采用2-△△Ct方法計算出lncRNA SNHG16、miR-516a-5p的表達量。引物序列見表1。

1.5.2 細胞增殖檢測采用MTT比色法對細胞的增殖情況進行檢測，對細胞的濃度進行調整，后將其接種于96孔板，加入0.2 mL細胞懸液，在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，分別于24、48、72 h在其中添加0.01 mL MTT試劑，孵育4 h，后采用酶標儀測定490 nm處細胞OD值，對細胞增殖率進行計算，試驗重復進行5次，結果取平均值。

1.5.3 細胞凋亡檢測細胞凋亡情況通過TUNEL法進行測定，將所培養(yǎng)細胞做洗滌、DAPI染色封片后的細胞核分別呈現為藍色熒光（陰性細胞數）、綠色熒光（陽性細胞數），之后細胞凋亡情況采用熒光顯微鏡進行觀察，細胞凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%。試驗重復測量3次。

1.5.4 細胞遷移情況檢測細胞遷移能力通過進行劃痕試驗進行檢測，選取SW480用胰蛋白酶分解，獲取細胞懸液接種到6孔板上，所有單層細胞采用1.60 mL移液器槍頭自上而下做一條劃痕，刮下細胞用PBS緩沖液洗滌，向干凈培養(yǎng)基中加入4 mL溶液，37 ℃下培育29 h，棄去培養(yǎng)液，在顯微鏡下觀察并記錄視野平均值，重復3次，取細胞遷移數平均值。

1.5.5 細胞侵襲能力檢測細胞侵襲能力通過Transwell實驗進行檢測，在Transwell小室鋪基質膠，24孔板中加入600 μL 10%胎牛血清培養(yǎng)基，上室分別接種100 μL各組細胞懸液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。濾膜用4%多聚甲醛固定20 min。棉簽擦去濾膜表面細胞，結晶紫染色，光鏡下隨機選5個視野，計算細胞總數，以穿過Matrigel基質膠的細胞數來表示SW480的侵襲能力。循環(huán)3次，計算出SW480侵襲數總均值。

1.5.6 CyclinD1、MMP-2、MMP-9檢測采用Western Blot法檢測，將培養(yǎng)的SW480細胞放入離心管，將RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑加入，以12 000 r/min離心處理10 min，制作組織勻漿，取上層清液，使用BCA法對蛋白濃度測定，后取相同質量蛋白，放入10% SDS-PAGE凝膠中，進行電泳、轉膜處理，后采用5%脫脂奶粉進行封管處理，放入4 ℃冰箱中，過夜處理，后進行清洗。加入CyclinD1、MMP-2、MMP-9抗體，孵育2 h，進行清洗，加入HRP標記二抗，室溫下孵育3 h，凝膠成像系統下觀察成像情況，計算恢復值，以GAPDH為內參，對蛋白表達情況分析。

1.5.7 雙熒光素酶報告試驗采用starBase網站對預測lncRNA SNHG16表靶基因，結果顯示，lncRNA SNHG16中含有與miR-516a-5p互補核苷酸序列，包括WT-lncRNA SNHG16、MUT-lncRNA SNHG16，將WT-lncRNA SNHG16、MUT-lncRNA SNHG16、miR-NC、miR-516a-5p轉入SW480細胞，進行雙熒光素酶檢測。試驗重復進行5次，結果取平均值。

1.6 統計學方法采用SPSS 26.0軟件分析，計量資料采用均值±標準誤表示，符合正態(tài)分布的兩組間比較采用t檢驗，多組間進行比較采用F檢驗，計數資料以率（%）表示，P＜ 0.05表示其差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA SNHG16、miR-516a-5p在結直腸癌組織中的表達與癌旁組織相比，結直腸癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG16表達水平升高，miR-516a-5p表達水平降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 LncRNA SNHG16、miR-516a-5p在結直腸癌組織中的表達Tab.2 Expression of LncRNA SNHG16，miR-516a-5p in colorectal cancer tissues ±s

表2 LncRNA SNHG16、miR-516a-5p在結直腸癌組織中的表達Tab.2 Expression of LncRNA SNHG16，miR-516a-5p in colorectal cancer tissues ±s

組別癌旁組織結直腸癌組織t值P值SNHG16 1.00 ± 0.21 3.58 ± 0.42 17.375 0.001 miR-516a-5p 1.00 ± 0.36 0.45 ± 0.05 4.785 0.001

2.2 結直腸癌細胞系中LncRNA SNHG16、miR-516a-5p表達水平與FHC組相比，HCT116組、SW620組、SW480組細胞中l(wèi)ncRNA SNHG16表達水平升高，miR-516a-5p表達水平較低，且SW480組lncRNA SNHG16水平最高、miR-516a-5p水平最低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表3。

表3 結直腸癌細胞系中LncRNA SNHG16、miR-516a-5p表達水平Tab.3 Expression levels of LncRNA SNHG16 and miR-516a-5p in colorectal cancer cell lines ±s

表3 結直腸癌細胞系中LncRNA SNHG16、miR-516a-5p表達水平Tab.3 Expression levels of LncRNA SNHG16 and miR-516a-5p in colorectal cancer cell lines ±s

組別FHC組HCT116組SW620組SW480組F值P值SNHG16 1.00 ± 0.18 4.92 ± 0.58 4.94 ± 0.59 5.14 ± 0.61 20.585 0.001 miR-516a-5p 1.00 ± 0.27 0.49 ± 0.06 0.44 ± 0.05 0.41 ± 0.04 6.836 0.001

2.3 干擾lncRNA SNHG16表達對SW480細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響與NC組相比，si-NC組SNHG16、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值、凋亡細胞、遷移細胞數、侵襲細胞數變化較小，差異無統計意義（P＞ 0.05）。與si-NC組相比，si-SNHG16組lncRNA SNHG16表達水平降低（P＜ 0.05），表明干擾lncRNA SNHG16表達的SW480細胞株構建成功，與si-NC組相比，si-SNHG16組CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值、遷移細胞數、侵襲細胞數降低，凋亡細胞升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表4、圖1。

圖1 Western blot蛋白圖Fig.1 Western blot protein plot

表4 干擾lncRNA SNHG16表達對SW480細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響Tab.4 Effects of interfering lncRNA SNHG16 expression on proliferation，apoptosis，invasion，and migration of SW 480 cells ±s

表4 干擾lncRNA SNHG16表達對SW480細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響Tab.4 Effects of interfering lncRNA SNHG16 expression on proliferation，apoptosis，invasion，and migration of SW 480 cells ±s

組別SNHG16 CyclinD1 MMP-2 MMP-9遷移細胞數侵襲細胞數NC組si-NC組si-SNHG16組F值P值1.00 ± 0.15 1.04 ± 0.18 0.35 ± 0.42 4.609 0.001 0.95 ± 0.08 0.92 ± 0.07 0.52 ± 0.04 15.203 0.001 0.75 ± 0.08 0.77 ± 0.09 0.35 ± 0.04 14.142 0.001 0.81 ± 0.09 0.79 ± 0.08 0.29 ± 0.03 17.333 0.001 OD值（490 nm）24 h 0.46 ± 0.05 0.43 ± 0.04 0.22 ± 0.03 13.016 0.001 48 h 0.78 ± 0.08 0.77 ± 0.07 0.48 ± 0.06 9.487 0.001 72 h 1.19 ± 0.22 1.17 ± 0.20 0.64 ± 0.06 7.627 0.001凋亡細胞（%）7.25 ± 0.81 7.29 ± 0.82 23.25 ± 3.48 14.161 0.001 175.25 ± 23.14 177.32 ± 23.18 84.25 ± 9.25 11.548 0.001 132.36 ± 21.03 133.05 ± 21.06 48.25 ± 5.31 13.263 0.001

2.4 高表達miR-516a-5p對SW480細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響與NC組相比，miR-NC組SNHG16、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值、凋亡細胞、遷移細胞數、侵襲細胞數變化較小，差異無統計意義（P＞ 0.05）。與miR-NC組相比，miR-516a-5p組miR-516a-5p表達水平升高（P＜ 0.05），表明高表達miR-516a-5p的SW480細胞株構建成功，與miR-NC組相比，miR-516a-5p組CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值、遷移細胞數、侵襲細胞數降低，凋亡細胞升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表5、圖2。

圖2 Western blot蛋白圖Fig.2 Western blot protein plot

表5 高表達miR-516a-5p對SW480細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響Tab.5 Effects of high expression of miR-516a-5p on the proliferation，apoptosis，invasion，and migration of SW 480 cells x ± s

2.5 lncRNA SNHG16靶向調控miR-516a-5p表達雙熒光素酶報告試驗顯示，與miR-NC組相比，miR-516a-5p可使SNHG16熒光素酶活性降低（P＜ 0.05），對MUT-SNHG16熒光素酶活性影響較?。≒＞ 0.05），見表6。

表6 雙熒光素酶報告試驗Tab.6 Dual-luciferase reporter assay ±s

表6 雙熒光素酶報告試驗Tab.6 Dual-luciferase reporter assay ±s

組別miR-NC組miR-516a-5p組t值P值WT-SNHG16 1.03 ± 0.14 0.49 ± 0.05 11.487 0.001 MUT-SNHG16 1.02 ± 0.12 1.00 ± 0.10 0.405 0.690

2.6 沉默miR-516a-5p表達逆轉干擾lncRNA SNHG16對SW480細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響與si-NC組相比，抑制lncRNA SNHG16表達可使SW480細胞中miR-516a-5p表達、凋亡細胞升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值、遷移細胞數、侵襲細胞數降低（P＜ 0.05），與si-SNHG16+antimiR-NC組相比，si-SNHG16+anti-miR-516a-5p組miR-516a-5p表達、凋亡細胞降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值、遷移細胞數、侵襲細胞數升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表7、圖3。

圖3 Western blot蛋白圖Fig.3 Western blot protein plot

表7 沉默miR-516a-5p表達逆轉干擾lncRNA SNHG16對SW480細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響Tab.7 Silencing of miR-516a-5p expression reversed the effects of interfering lncRNA SNHG16 on the proliferation，apoptosis，invasion，and migration of SW 480 cells ±s

表7 沉默miR-516a-5p表達逆轉干擾lncRNA SNHG16對SW480細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響Tab.7 Silencing of miR-516a-5p expression reversed the effects of interfering lncRNA SNHG16 on the proliferation，apoptosis，invasion，and migration of SW 480 cells ±s

組別miR-516a-5p CyclinD1 MMP-2 MMP-9遷移細胞數侵襲細胞數si-NC組si-SNHG16組si-SNHG16+anti-miR-NC組si-SNHG16+anti-miR-516a-5p組F 值P 值0.38 ± 0.04 1.06 ± 0.21 1.04 ± 0.20 0.45 ± 0.06 8.935 0.001 0.92 ± 0.07 0.52 ± 0.04 0.50 ± 0.03 0.94 ± 0.08 16.285 0.001 0.79 ± 0.08 0.31 ± 0.04 0.30 ± 0.03 0.81 ± 0.09 17.000 0.001 0.80 ± 0.09 0.27 ± 0.03 0.31 ± 0.04 0.75 ± 0.08 15.556 0.001 OD值（490 nm）24 h 0.44 ± 0.05 0.20 ± 0.03 0.23 ± 0.04 0.46 ± 0.06 10.086 0.001 48 h 0.81 ± 0.09 0.51 ± 0.06 0.50 ± 0.05 0.77 ± 0.08 9.050 0.001 72 h 1.19 ± 0.20 0.72 ± 0.08 0.75 ± 0.09 1.23 ± 0.21 6.645 0.001凋亡細胞（%）7.34 ± 0.85 21.58 ± 3.47 20.66 ± 3.34 7.49 ± 0.87 12.067 0.001 170.36 ± 22.03 80.36 ± 9.01 79.18 ± 8.93 166.52 ± 21.18 12.016 0.001 142.36 ± 22.14 50.36 ± 6.03 48.36 ± 5.85 138.36 ± 21.11 12.992 0.001

3 討論

臨床多采用手術聯合化療對結直腸癌患者治療，但該治療方式預后較差，故尋找結直腸癌的新型治療靶點，對結直腸癌早期篩查具有重要意義。

臨床研究表明［4］，多種細胞的分化、轉移、增殖等生物學進程可受到lncRNA的影響，lncRNA為潛在的致癌基因，lncRNA表達升高，可使腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展受到影響，為臨床治療惡性腫瘤的潛在靶點。SNHG16為致癌基因，表達升高后，可促進結直腸癌的進展、生長，在結直腸癌的臨床病理學特征中，可對細胞的凋亡、轉移、侵襲進行調控［5］。lncRNA SNHG16為小核仁RNA宿主基因中的成員，為致癌RNA，在多種惡性腫瘤中具有較高的表達水平，并可影響腫瘤患者預后［6］。有關研究顯示［7］，lncRNA SNHG16在肝癌組織、細胞中表達升高，抑制其表達，可使肝癌細胞的遷移、增殖、侵襲減緩，且檢測lncRNA SNHG16表達，可用于預測肝癌患者的總生存期。lncRNA SNHG16表達升高，可影響脂質代謝的相關基因，使胃癌細胞的增殖速度加快，促進其遷移、侵襲［8］。有研究顯示，lncRNA SNHG16高表達于結直腸癌患者，抑制lncRNA SNHG16表達，可使細胞的凋亡速度加快，并抑制其轉移，使腫瘤細胞的存活率下降［9］。本文研究顯示，干擾lncRNA SNHG16表達，可使CyclinD1、MMP-2、MMP-9、OD值表達降低，并促進細胞的凋亡，抑制腫瘤細胞的轉移、侵襲，該研究與上述研究一致，表明lncRNA SNHG16具有致癌作用，干擾lncRNA SNHG16表達，可降低細胞的增殖、轉移能力，促使其恢復。

miRNA為調控性小RNA，在多種疾病中表達水平處于異常狀態(tài)，可參與多種疾病發(fā)生、發(fā)展，miRNA具有調節(jié)基因降解的作用，可對基因的翻譯進行抑制，并調節(jié)基因的衰減，影響其他miRNA表達，且miRNA可對炎癥介質的釋放、免疫細胞的分化進行調節(jié)［10］。在非小細胞肺癌中，miR-516a-5p具有抑癌作用，具有利于非小細胞肺癌存活的作用，miR-516a-5p低表達于結直腸癌組織，可影響結直腸癌細胞的增殖、轉移，為結直腸癌的抑制因子［11］。研究顯示［12］，lncRNA SNHG16通過與不同miRNA分子結合對腫瘤的進展進行調控，lncRNA SNHG16可介導miR-877-5p/FOXP4軸，使喉鱗狀細胞癌細胞的增殖速度加快，促進喉鱗狀細胞癌的發(fā)展，敲減lncRNA SNHG16表達，升高miR-342-3p表達，使多發(fā)性骨髓瘤細胞的凋亡速度加快，抑制腫瘤的發(fā)展，且lncRNA SNHG16可下調DKK3表達，使胃癌上皮-間質轉化速度加快。細胞轉移能力的增加與腫瘤的進展具有一定相關性，CyclinD1為腫瘤啟動子，MMP-2、MMP-9為基質金屬蛋白酶，可使細胞外基質的沉積發(fā)生降解，促進細胞的遷移、侵襲。本研究顯示，miR-516a-5p在結直腸癌中表達下降，lncRNA SNHG16表達升高，兩者呈負相關，敲減lncRNA SNHG16表達，可使miR-516a-5p激活，抑制結直腸癌細胞的轉移、侵襲，并降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達，表明干擾lncRNA SNHG16表達，可抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移，促進其凋亡，是熒光素酶報告顯示，lncRNA SNHG16對miR-516a-5p具有負調控作用。本研究顯示，miR-516a-5p表達降低，可逆轉干擾lncRNA SNHG16對結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用，使CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達升高，表明在結直腸癌中，lncRNA SNHG16起miR-516a-5p海綿作用，可對結直腸癌的生物學進程進行調節(jié)。

綜上所述，lncRNA SNHG16在結直腸癌中表達升高，miR-516a-5p表達降低，抑制lncRNA SNHG16表達，可使miR-516a-5p表達升高，增加細胞凋亡率升高，并抑制其增殖、遷移、侵襲，表明lncRNA SNHG16可靶向調控miR-516a-5p，使結直腸癌細胞的增殖減緩，抑制結直腸癌的發(fā)展，具有較好治療效果，可成為結直腸癌的治療靶點。本研究在研究過程中也具有相對局限性，未進行動物體試驗，且未進一步驗證miR-516a-5p對結直腸癌細胞的增殖、凋亡的影響，后續(xù)應建立動物試驗模型，進一步研究。