慢性高脂肪飲食對缺血/再灌注大鼠腦損傷影響及機(jī)制

李加善 楊德兵 彭志鋒

山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院1解剖教研室，2生理教研室（山西大同 037009）

肥胖是缺血性腦卒中的主要危險因素之一［1］。全身炎癥是肥胖患者常見病理，并與其他代謝疾病發(fā)展有關(guān)，如糖尿病、動脈粥樣硬化和高血壓［2］。現(xiàn)有證據(jù)表明，肥胖可通過加重神經(jīng)炎癥和出血而惡化缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）腦損傷［3-5］。然而，在現(xiàn)有研究中，這些相關(guān)的分子機(jī)制尚未完全闡明。細(xì)胞焦亡是程序性細(xì)胞死亡新形式。細(xì)胞焦亡發(fā)生依賴于炎性Caspase和Gasdermin蛋白家族，激活的Caspase-1可使細(xì)胞內(nèi)Gasdermin D蛋白裂解為N端和C端片段；N端Gasdermin D然后在脂質(zhì)膜上形成一個孔，導(dǎo)致離子失衡、細(xì)胞腫脹和細(xì)胞凋亡［6］。有研究還表明，焦亡導(dǎo)致?lián)p傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）大量釋放到細(xì)胞外，這些分子進(jìn)一步加重炎癥［7-8］。其中高遷移族蛋白B1（high mobility group box-1，HMGB1）屬于DAMPs。HMGB1直接與Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）4結(jié)合，并進(jìn)一步誘導(dǎo)活化B細(xì)胞的核因子-κ輕鏈增強(qiáng)子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell，NF-κB）活化，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)擴(kuò)大［9-10］。但是肥胖是否通過細(xì)胞焦亡及HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路加重I/R腦損傷仍不明確。因而，本研究旨在評估慢性高脂肪飲食（chronic high-fat diet，HFD）對大鼠腦I/R損傷后細(xì)胞焦亡及HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的影響，有可能為治療缺血性腦卒中提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組雄性Wistar大鼠（體質(zhì)量180 ～ 220 g）購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（動物許可證號：SCXK（京）2019-0011）。它們被安置在溫度可控的環(huán)境中［（25 ± 1）℃，12 h光周期］。在適應(yīng)7 d后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常飲食（normal diet，ND）組（n= 30）和HFD組（n= 30）。每組再分別分為Sham組和I/R組兩個亞組，每個亞組15只。正常飲食組以標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，含有碳水化合物495.3 g、脂肪83.7 g、蛋白質(zhì)269.0 g、維生素65.4 g和纖維34.3 g；HFD組以高脂/高碳水化合物飲食飼養(yǎng)，高脂飲食主要含有碳水化合物190.76 g、脂肪342.24 g、蛋白質(zhì)353.6 g、膽固醇10 g、維生素85.19 g、DL-蛋氨酸3 g、纖維13.21 g、酵母粉1 g和氯化鈉1 g（購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所）。每周測定食物攝入量和體質(zhì)量。在16周結(jié)束時采集血樣以測量代謝參數(shù)。I/R手術(shù)后24 h，對所有大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評估，然后處死。

1.2 實驗試劑HE和尼氏染料（美國Sigma公司）；甘油三酯、總膽固醇和血糖檢測試劑盒（天根生物科技有限公司）；NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、Caspase-1、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、HMGB1、TLR4和NF-κB抗體（美國Sigma公司）。

1.3 大鼠I/R模型制備腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠。然后在頸部腹面作中線切口顯露右側(cè)頸總動脈，用鈍性解剖法分離迷走神經(jīng)附近鄰近組織的肌肉，分離頸動脈分叉，仔細(xì)分離頸外動脈、頸內(nèi)動脈、枕動脈和翼腭動脈。將細(xì)絲經(jīng)頸外動脈插入頸內(nèi)動脈阻斷大腦中動脈（middle cerebral artery occlusion，MCAO），阻斷60 min后牽拉單絲誘導(dǎo)再灌注，在再灌24 h后進(jìn)行相關(guān)檢測。模型成功標(biāo)志是手術(shù)后出現(xiàn)手術(shù)側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)。Sham組除不插入細(xì)絲外，其余手術(shù)均相同。

1.4 代謝血液參數(shù)測定在正常飲食或HFD攝入16周后，從尾靜脈收集各組大鼠血液樣本。然后將樣品在4 ℃下以1 600 ×g離心10 min。根據(jù)制造商的說明，使用比色測定法評估甘油三酯、總膽固醇和血糖水平。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)測定I/R后24 h，通過使用5點神經(jīng)缺陷量表來確定神經(jīng)行為學(xué)變化。評分為0，無明顯神經(jīng)功能缺損；1分，無法伸展對側(cè)前爪；2分，向同側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分，軀干向?qū)?cè)傾斜；4分，不能自發(fā)或無意識地行走［11］。

1.6 組織病理學(xué)測定I/R后24 h，采用經(jīng)心臟灌注固定處死大鼠。在深度鎮(zhèn)靜麻醉下，打開胸腔以暴露心臟。接下來，立即通過左心室灌注0.9%生理鹽水溶液，以清除循環(huán)系統(tǒng)中血液，然后加入4%多聚甲醛用于組織保存。然后收集腦皮層梗死周圍區(qū)域，并進(jìn)一步在4%多聚甲醛中固定24 h。隨后，將所有樣品嵌入石蠟中，并用切片機(jī)切成5 μm厚的切片。冠狀切片用HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 尼氏染色通過尼氏染色法測定梗死周圍區(qū)域區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量。進(jìn)行5 μm厚的切片，并在37 ℃下用0.5%甲酚紫溶液染色10 min。在光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)變化，存活神經(jīng)元具有完整邊界和圓形細(xì)胞核，而死亡神經(jīng)元具有細(xì)胞質(zhì)收縮。測定并比較每組大鼠大腦皮層梗死周圍區(qū)域活細(xì)胞密度。

1.8 蛋白質(zhì)制備和western blotting分析I/R后24 h，迅速收集腦組織并在冷裂解緩沖液中勻漿。然后，將勻漿在4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，收集上清液。通過使用Bradford蛋白質(zhì)測定法測定總蛋白質(zhì)濃度。將每個樣品中25 μ總蛋白裝入10%凝膠中并進(jìn)行電泳。將分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上。通過將PVDF膜與5%脫脂牛奶孵育2 h來阻斷非特異性蛋白結(jié)合。將膜與一級抗體在4 ℃下孵育過夜，主要包括NLRP3、Caspase-1、IL-1β、HMGB1、TLR4和NF-κB抗體。采用TBST洗滌PVDF膜，然后在室溫下與抗兔IgG或山羊抗鼠IgG二級抗體孵育2 h。利用化學(xué)發(fā)光掃描系統(tǒng)檢測相關(guān)蛋白表達(dá)并攝片，采用Quantity one圖像分析軟件對目標(biāo)條帶吸光度積值進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HFD對大鼠代謝影響與ND組相比，HFD組大鼠體質(zhì)量及內(nèi)臟脂肪組織重量增加（P＜0.05）；此外，HFD組大鼠血清甘油三酯、總膽固醇和葡萄糖水平均增加（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組大鼠喂養(yǎng)3個月后代謝參數(shù)的比較Tab.1 Comparison of metabolic parameters between two groups of rats after 3 months of feeding ±s

表1 兩組大鼠喂養(yǎng)3個月后代謝參數(shù)的比較Tab.1 Comparison of metabolic parameters between two groups of rats after 3 months of feeding ±s

組別ND組HFD組t值P值n 30 30體質(zhì)量（g）398.5 ± 45.3 523.6 ± 61.9 26.437＜ 0.001脂肪組織（g）19.8 ± 23.4 41.2 ± 5.3 39.075＜ 0.001甘油三酯（mg/dL）73.8 ± 7.8 96.7 ± 10.2 14.378 0.006總膽固醇（mg/dL）54.6 ± 5.9 88.6 ± 9.7 31.849＜ 0.001葡萄糖（mg/dL）134.6 ± 16.2 153.8 ± 17.3 11.536 0.017

2.2 HFD對I/R大鼠神經(jīng)行為學(xué)影響無論ND或HFD，I/R組大鼠神經(jīng)功能缺損評分高于Sham組（P＜0.05）。在I/R組中，HFD大鼠神經(jīng)功能缺損評分高于ND大鼠（P＜0.05）（表2）。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較Tab.2 Comparison of neuron function defect scores of rats in each group ±s

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較Tab.2 Comparison of neuron function defect scores of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n t值P值15 15 ND 0 2.8 ± 0.3 46.936＜ 0.001 HFD 0 3.7 ± 0.4 57.423＜ 0.001 9.834 0.028

2.3 HFD對I/R大鼠組織病理學(xué)影響在Sham組中，ND大鼠實質(zhì)組織和細(xì)胞排列正常，而HFD大鼠核固縮的萎縮細(xì)胞略有增加。在I/R組中，不論ND或HFD大鼠表現(xiàn)為同側(cè)皮層形成大量空泡空間和不規(guī)則細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而且HFD大鼠比ND大鼠具有更多的受損細(xì)胞（圖1）。

圖1 各組大鼠典型HE染色（× 40）Fig.1 Typical HE staining of rats in each group（× 40）

2.4 HFD對I/R大鼠神經(jīng)元存活影響在Sham組中，ND和HFD大鼠尼氏陽性細(xì)胞在大腦中廣泛表達(dá)。在I/R組中，ND和HFD大鼠同側(cè)皮層神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)收縮和核固縮（圖2）。與Sham組相比，I/R大鼠大腦皮層存活神經(jīng)元減少（P＜0.05），而且HFD大鼠存活神經(jīng)元數(shù)量少于ND大鼠（P＜0.05）（表3）。

圖2 各組大鼠典型尼氏染色（× 40）Fig.2 Typical Nissl staining of rats in each group（× 40）

表3 各組大鼠存活神經(jīng)元密度比較Tab.3 Comparison of survival neuron density of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n5 5 t值4.784 8.173 P值0.107 0.025 ND 100.0 ± 0.0 37.3 ± 4.2 63.740＜ 0.001 HFD 93.5 ± 9.6 20.6 ± 2.4 75.382＜ 0.001

2.5 HFD對I/R大鼠細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白影響與Sham組相比，I/R組中ND和HFD大鼠細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白（NLRP3、Caspase-1、IL-1β）表達(dá)增加（P＜0.05），而且HFD大鼠細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白（NLRP3、Caspase-1、IL-1β）表達(dá)高于ND大鼠（P＜0.05）（圖3和表4-6）。

圖3 各組大鼠典型細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of typical apoptosis related proteins of rats in each group

表4 各組大鼠NLRP3蛋白表達(dá)的比較Tab.4 Comparison of NLRP3 protein expression of rats in each group ±s

表4 各組大鼠NLRP3蛋白表達(dá)的比較Tab.4 Comparison of NLRP3 protein expression of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 175.3 ± 18.6 9.164 0.012 HFD 105.8 ± 11.2 227.6 ± 24.4 14.826＜ 0.001 t值1.946 7.139 P值0.832 0.036

表5 各組大鼠Caspase-1蛋白表達(dá)的比較Tab.5 Comparison of Caspase-1 protein expression of rats in each group ±s

表5 各組大鼠Caspase-1蛋白表達(dá)的比較Tab.5 Comparison of Caspase-1 protein expression of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 198.3 ± 20.1 13.836＜ 0.001 HFD 103.6 ± 11.3 247.6 ± 25.0 17.649＜ 0.001 t值1.238 6.972 P值0.896 0.039

表6 各組大鼠IL-1β蛋白表達(dá)的比較Tab.6 Comparison of IL-1β protein expression of rats in each group ±s

表6 各組大鼠IL-1β蛋白表達(dá)的比較Tab.6 Comparison of IL-1β protein expression of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n5 5 t值2.182 6.549 P值0.814 0.041 ND 100.0 ± 0.0 203.3 ± 21.1 17.378＜ 0.001 HFD 108.5 ± 11.7 268.1 ± 28.4 23.538＜ 0.001

2.6 HFD對I/R大鼠HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路影響與Sham組相比，I/R組中ND和HFD大鼠HMGB1及其下游因子TLR4和NF-κB表達(dá)增加（P＜0.05），而且HFD大鼠HMGB1及其下游因子TLR4和NF-κB表達(dá)高于ND大鼠（P＜0.05）（圖4和表7-9）。

圖4 各組大鼠典型HMGB1/TLR4/NF-κB蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of typical HMGB1/TLR4/NF-κB protein of rats in each group

表7 各組大鼠HMGB1蛋白表達(dá)的比較Tab.7 Comparison of HMGB1 protein expression of rats in each group ±s

表7 各組大鼠HMGB1蛋白表達(dá)的比較Tab.7 Comparison of HMGB1 protein expression of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 217.3 ± 22.8 24.4280＜ 0.001 HFD 101.5 ± 10.6 300.2 ± 32.4 68.354＜ 0.001 t值0.084 9.152 P值0.969 0.013

表8 各組大鼠TLR4蛋白表達(dá)的比較Tab.8 Comparison of TLR4 protein expression of rats in each group ±s

表8 各組大鼠TLR4蛋白表達(dá)的比較Tab.8 Comparison of TLR4 protein expression of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 207.3 ± 21.4 22.638＜ 0.001 HFD 95.5 ± 9.8 310.3 ± 32.0 74.736＜ 0.001 t值1.043 9.376 P值0.925 0.011

表9 各組大鼠NF-κB蛋白表達(dá)的比較Tab.9 Comparison of NF-κB protein expression of rats in each group ±s

表9 各組大鼠NF-κB蛋白表達(dá)的比較Tab.9 Comparison of NF-κB protein expression of rats in each group ±s

組別Sham組I/R組t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 175.2 ± 19.6 9.543 0.010 HFD 101.4 ± 9.8 283.1 ± 29.0 52.457＜ 0.001 t值0.028 11.649 P值0.987 0.006

3 討論

本研究主要觀察HFD攝入對I/R大鼠腦損傷影響，以及細(xì)胞焦亡和HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路在其中的作用。研究結(jié)果表明，HFD攝入惡化了I/R大鼠神經(jīng)功能預(yù)后，并降低了神經(jīng)元存活率。值得注意的是，本研究結(jié)果首次表明，在HFD喂養(yǎng)大鼠腦I/R損傷中，細(xì)胞焦亡和HMGB1信號通路顯著增強(qiáng)。

給大鼠喂養(yǎng)HFD，持續(xù)16周，這種飲食模式已被廣泛報道會誘發(fā)多種代謝疾病，如非酒精性脂肪肝、動脈粥樣硬化，以及腎、腸、腦和胰腺損傷［12-14］。與我們的數(shù)據(jù)一致，盡管ND組和HFD組大鼠食物攝入量沒有區(qū)別，但HFD組大鼠體質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪以及血清甘油三酯、總膽固醇和葡萄糖水平均增高。這些參數(shù)證實了HFD攝入大鼠存在與肥胖相關(guān)的代謝障礙。之后我們探討了HFD攝入對短暫MCAO引起的I/R大鼠腦損傷的影響。在I/R組中，與ND大鼠相比，HFD大鼠神經(jīng)功能缺損評分增高。這些數(shù)據(jù)表明，HFD攝入加劇了I/R大鼠腦損傷嚴(yán)重程度。我們還通過HE染色觀察了各組大鼠同側(cè)大腦皮層組織病理學(xué)變化。在I/R組中，HFD大鼠比ND大鼠具有更多的受損細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)與尼氏染色測定的存活神經(jīng)元密度一致。在I/R組中，具有清晰邊界且無細(xì)胞質(zhì)收縮的完整神經(jīng)元數(shù)量減少。在兩種飲食之間進(jìn)行比較，與ND大鼠相比，HFD大鼠存活神經(jīng)元減少更多。這些數(shù)據(jù)表明，HFD會促進(jìn)神經(jīng)元死亡，從而導(dǎo)致I/R損傷后大腦功能紊亂。

凋亡和壞死這兩種類型的細(xì)胞死亡都可以被調(diào)節(jié)，每種類型都有不同的形態(tài)學(xué)和生化特征［15-17］。細(xì)胞焦亡也被歸為程序性壞死形式。盡管細(xì)胞焦亡受信號通路調(diào)節(jié)，但細(xì)胞焦亡發(fā)生均需要質(zhì)膜破裂，這種現(xiàn)象會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)排出到細(xì)胞外，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)［18-19］。目前，抑制這些信號通路被視為缺血性腦卒中一種有前途的治療方法。例如，給予MCC-950（NLRP3炎性體特異性抑制劑），可有效減少炎性信號和腦水腫，從而改善I/R大鼠腦梗死體積和神經(jīng)功能［20］。這一證據(jù)支持細(xì)胞焦亡參與I/R大鼠腦損傷。因此，我們探討了HFD喂養(yǎng)大鼠I/R損傷后細(xì)胞焦亡的作用。結(jié)果顯示，在HFD喂養(yǎng)I/R大鼠中，與細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白質(zhì)（NLRP3、caspase-1和IL-1β）在腦梗死周圍顯著增加。這些結(jié)果表明，長期食用HFD會加劇I/R大鼠細(xì)胞焦亡。如上所述，細(xì)胞焦亡通過調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)膜雙層中孔形成來誘導(dǎo)溶解性細(xì)胞死亡。從而導(dǎo)致DAMPs釋放到細(xì)胞外空間。HMGB1是一種常見DAMPs，參與腦I/R損傷后炎癥信號啟動和傳播［21］。該分子介導(dǎo)TLR4/NF-κB信號通路，是缺血大腦促炎癥中起重要作用介質(zhì)［22-23］。TLR4/NF-κB級聯(lián)激活對I/R腦損傷產(chǎn)生有害影響，而抑制這些信號傳導(dǎo)可減少腦梗死［24］。此外，NF-κB還調(diào)節(jié)NLRP3表達(dá)，NLRP3是炎癥復(fù)合體主要成分；這種調(diào)節(jié)會導(dǎo)致細(xì)胞焦亡［25］。因此，我們進(jìn)一步研究腦I/R損傷后HMGB1、TLR4和NF-κB信號蛋白表達(dá)。在I/R組中，與ND大鼠相比，HFD大鼠HMGB1、TLR4和NF-κB表達(dá)增高。因此，HFD加劇I/R損傷后HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路。下一步研究需采用上述信號通路特異性抑制劑來確認(rèn)該信號通路在細(xì)胞焦亡中具體作用。

總之，本研究結(jié)果表明，HFD攝入會加重大鼠腦I/R損傷后細(xì)胞焦亡，并增強(qiáng)HMGB1/TLR4/NFκB信號通路表達(dá)，從而導(dǎo)致I/R后不良結(jié)局。