大豆球蛋白抗菌多肽抑制單增李斯特菌的機(jī)制研究

解博洋，王 昊，李月婷，張興國(guó)*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 健康管理學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春市疾病預(yù)防控制中心，吉林長(zhǎng)春 130000）

1 單增李斯特菌研究現(xiàn)狀

1.1 微生物學(xué)特征

單細(xì)胞增生李斯特菌是一種革蘭氏陽性、非成孔、兼性厭氧菌，其適宜的生長(zhǎng)溫度通常在-0.4 ～50.0 ℃。該生物體因具有豐富的鞭毛，使其具有翻滾、蠕動(dòng)的特征，但這一特征僅在較小的溫度區(qū)間內(nèi)方可進(jìn)行。當(dāng)溫度在20 ～25 ℃時(shí)，其細(xì)胞膜表面產(chǎn)生鞭毛，當(dāng)溫度達(dá)到37 ℃時(shí)，鞭毛數(shù)量明顯減少[1]。單增李斯特菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求不高，通常在普通培養(yǎng)基上就能實(shí)現(xiàn)良好的生長(zhǎng)，能適應(yīng)高pH 值、高鹽的環(huán)境，能在冷庫(kù)、冰箱等低溫環(huán)境下生存，有“冰箱殺手”之稱[2]。

1.2 臨床表現(xiàn)

單增李斯特菌的主要感染形式為局部感染和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的散播性感染，它屬于比較危險(xiǎn)的感染性病原體，感染單增李斯特菌的死亡率可達(dá)到20%～30%。即使感染者在患病初期及時(shí)采取了相應(yīng)的治療手段，也很難將死亡率降到20%以下[3]。單增李斯特菌感染會(huì)造成患者發(fā)熱、腸胃炎、局部濃重、呼吸困難、敗血癥、腦膜炎以及孕婦流產(chǎn)等后果[4]，而老年人、免疫力較差者及孕婦，恰恰是感染單增李斯特菌的高危人群[5]。

1.3 流行病學(xué)特征

單增李斯特菌是一種人和動(dòng)物皆可感染的病原菌，在全世界范圍內(nèi)有著不同程度的傳播狀況。在發(fā)達(dá)國(guó)家，人們感染單增李斯特菌的現(xiàn)象較為嚴(yán)重[6]。單增李斯特菌在大自然中分布很廣，多種動(dòng)物也深受其害，如哺乳動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、魚類、鳥類等。單增李斯特菌可在不同種類動(dòng)物之間通過口腔-糞便的途徑傳播，有可能是其在種群之間傳播的主要方式之一[7]。單增李斯特菌作為危害程度較大的食源性病原菌之一，其對(duì)于食品的污染是不容忽視的，單增李斯特菌可通過多種途徑污染生鮮水果蔬菜，也可以在食品的生產(chǎn)和加工環(huán)節(jié)中對(duì)乳制品、肉類食品以及未加熱即食的冷藏食品等造成污染[8]。

1.4 耐藥性

單增李斯特菌通常具有較強(qiáng)的耐藥性和耐環(huán)境性，其特點(diǎn)是通過與其他細(xì)菌交換耐藥性的方式來增強(qiáng)抗藥性[9-10]。單增李斯特菌引起的李斯特菌病需要使用復(fù)方磺胺甲惡唑、氨芐西林、青霉素等抗生素治療。人們?nèi)舾腥揪哂心退幮缘膯卧隼钏固鼐鷮?huì)大大提高治療的難度，這將會(huì)導(dǎo)致患者的死亡率升高，更為嚴(yán)重的是單增李斯特菌攜帶的耐藥基因能夠在種屬內(nèi)及種屬間水平傳播[11]，造成多種食源性致病菌的普遍耐藥[12]。

2 大豆球蛋白抗菌多肽概述

大豆是人們熟知的一種植物，其含有豐富的蛋白質(zhì)（大豆蛋白）。大豆蛋白主要由11S（大豆球蛋白）和7S（β-伴大豆球蛋白）組成。其中，11S 是大豆蛋白的主要組成部分（約24%），通常以六聚體的結(jié)構(gòu)形式存在，每一個(gè)大豆球蛋白都由一種酸性和堿性多肽組成，通過二硫鍵連接在一起[13]。大豆球蛋白抗菌多肽是由11S（大豆球蛋白）在斷開二硫鍵后得到的一組堿性亞基，是分子量相近而結(jié)構(gòu)不同的堿性肽混合物，是抗菌肽中的一種?？咕牡膩碓春軓V，在機(jī)體早期防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用[14-15]?？咕氖且阎南忍烀庖叻磻?yīng)的基本成分，也可以作為某些生物體的免疫調(diào)節(jié)劑，是一種毒性低且高效、具有抗病毒、抗癌、抗菌活性的藥物。有研究表明，病原體通常對(duì)于抗菌肽很難產(chǎn)生耐藥性，也因此抗菌肽的研究被人們寄予厚望，被作為抗生素的潛在替代品[16]。大豆球蛋白抗菌多肽具有良好的熱穩(wěn)定性、低致敏性、溶解性和抗菌性，是具有潛力和開發(fā)前景的天然抗菌劑。

3 大豆球蛋白抗菌多肽抑制單增李斯特菌的機(jī)制

大豆球蛋白抗菌多肽具有抗菌廣譜性，與化學(xué)抗菌劑相比，其優(yōu)點(diǎn)是安全且無副作用，現(xiàn)代研究表明，大豆球蛋白抗菌多肽對(duì)單增李斯特菌的細(xì)胞膜、DNA 及其生物活性均有影響。

3.1 大豆球蛋白抗菌多肽對(duì)單增李斯特菌細(xì)胞膜的影響

大豆球蛋白抗菌多肽是一種帶正電的陽離子抗菌肽，與單增李斯特菌細(xì)胞膜表面的負(fù)電區(qū)域能夠產(chǎn)生靜電相互作用，即帶正電荷的大豆球蛋白抗菌多肽中和了單增李斯特菌表面的脂壁酸和肽聚糖等陰性基團(tuán)所帶的負(fù)電荷，同時(shí)抗菌肽通過插入脂質(zhì)雙層，與細(xì)胞膜磷脂上的陰離子接觸，誘導(dǎo)細(xì)菌膜去極化而產(chǎn)生布朗運(yùn)動(dòng)，使細(xì)胞膜或細(xì)胞壁拉伸，產(chǎn)生更大尺寸的孔，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的裂解。細(xì)胞膜的作用是維持細(xì)胞的形狀和完整性，并保證細(xì)胞的正常生理代謝。當(dāng)細(xì)胞膜損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)Na+、K+及Ca2+等出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹甚至死亡。ABDEL-SHAFI 等[17]在7S 和11S球蛋白抑制單增李斯特菌活性的實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不同濃度的11S 球蛋白能夠?qū)е聠卧隼钏固鼐砻婕?xì)胞膜產(chǎn)生不同程度的變形或裂解。實(shí)驗(yàn)表明，大豆球蛋白抗菌多肽損傷了單增李斯特菌的細(xì)胞膜。

3.2 大豆球蛋白抗菌多肽對(duì)單增李斯特菌生理活性的影響

大豆球蛋白抗菌多肽不僅對(duì)單增李斯特菌的細(xì)胞膜有損傷作用，對(duì)其生理活性也有影響，如抑制細(xì)胞的能量合成和呼吸代謝。當(dāng)細(xì)胞缺乏能量供應(yīng)時(shí)，細(xì)胞將緩慢生長(zhǎng)，甚至死亡。ATP 酶在細(xì)胞能量代謝中具有重要的作用。在電解質(zhì)的作用下，ATP將分解為ADP 并釋放大量能量，大豆球蛋白抗菌多肽可以通過影響Na+、K+等電解質(zhì)，進(jìn)而影響ATP的分解，并降低ATP 酶（如β-半乳糖苷酶）的活性，從而抑制單增李斯特菌的生長(zhǎng)和代謝。微生物主要通過TCA 循環(huán)、EMP 途徑和HMP 途徑進(jìn)行細(xì)胞呼吸代謝，這3 種途徑是細(xì)胞獲得能量的基本過程，如果細(xì)胞呼吸代謝受到抑制，微生物生命也將消耗殆盡。有研究表明[18]，大豆球蛋白抗菌多肽對(duì)單增李斯特菌的呼吸代謝有抑制作用，并在糖酵解途徑中最為顯著。NING 等[19]通過比較大豆球蛋白抗菌多肽對(duì)3 種呼吸代謝途徑的抑制作用，發(fā)現(xiàn)濃度為0.1 mg·mL-1的大豆球蛋白抗菌多肽在單增李斯特菌呼吸代謝過程中的總抑制率為20.88%，在EMP 途徑、TCA 途徑和HMP 途徑中的抑制率分別為41.00%、35.51%和25.20%。這表明，在EMP 途徑、TCA 途徑和HMP 途徑中，EMP 途徑受大豆球蛋白抗菌多肽的抑制最為明顯，且EMP 途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶的活性下降最快，由此得出大豆球蛋白抗菌多肽可顯著抑制單增李斯特菌EMP 途徑中關(guān)鍵酶的活性，從而抑制其呼吸代謝。

3.3 大豆球蛋白抗菌多肽對(duì)單增李斯特菌DNA 的影響

DNA 是細(xì)菌生長(zhǎng)、發(fā)育的主要遺傳物質(zhì)。大豆球蛋白抗菌多肽可導(dǎo)致單增李斯特菌中的DNA含量降低，這是由于大豆球蛋白抗菌多肽破壞了單增李斯特菌的細(xì)胞膜，使核酸及蛋白質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)流出，同時(shí)大豆球蛋白抗菌多肽也會(huì)對(duì)單增李斯特菌的DNA 的復(fù)制及表達(dá)產(chǎn)生干擾。雖然大豆球蛋白抗菌多肽破壞單增李斯特菌DNA 的機(jī)制尚不明確，但LI 等[20]應(yīng)用一種合成抗菌肽對(duì)大腸桿菌的DNA 進(jìn)行了處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)此抗菌肽中的P7 能夠與細(xì)菌DNA 相互作用，并抑制基因組脫氧核糖核酸的遷移，且P7 能夠插入基因組堿基對(duì)中，使細(xì)菌DNA 的復(fù)制停留在R 期，無法完成完整的復(fù)制周期，干擾正常的細(xì)胞周期。由此筆者認(rèn)為大豆球蛋白抗菌多肽與單增李斯特菌中的DNA 相互作用，可能阻礙并抑制了大分子的合成以及相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)破壞細(xì)菌正常的生命周期，從而導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。

4 結(jié)語

綜上所述，大豆球蛋白抗菌多肽作為一種天然的抑菌劑，對(duì)單增李斯特菌具有良好的抑制效果，可從破壞細(xì)胞膜、DNA 以及抑制細(xì)胞呼吸代謝等多方面抑制或殺死單增李斯特菌。近年來，單增李斯特菌的耐藥性不斷上升，因此尋找高效、低耐藥性的替代品具有重要意義。大豆球蛋白抗菌多肽作為一種天然抗菌劑，對(duì)單增李斯特菌具有較好的抑制效果。大豆球蛋白抗菌多肽具有耐熱性、抗菌性、毒性低以及溶解性高的特點(diǎn)，可作為新型的天然防腐劑以保證食品安全。大豆球蛋白抗菌多肽具有較好的開發(fā)前景和潛力，本文闡述了大豆球蛋白抗菌多肽抑制單增李斯特菌的機(jī)制，為新型高效的天然抗菌劑的開發(fā)提供理論參考。目前仍有一些因素有待研究與探討，即研究大豆球蛋白抗菌多肽與抗生素聯(lián)合使用抑制單增李斯特菌的效果以及如何將大豆球蛋白抗菌多肽合理地應(yīng)用在食品的生產(chǎn)、加工和貯存中。