X射線與γ射線輻照對懸浮紅細胞質(zhì)量影響的對比研究

馮娜 蘭靜 曹鑫 丁謹 景媛媛

陜西省血液中心，西安 710061

輻照血液主要是指對血液制劑使用一定劑量的γ或X射線進行照射，使血液中的淋巴細胞失去活性所制成的全血或成分血[1-2]，在臨床上主要用于預(yù)防輸血相關(guān)性移植物抗宿主?。╰ransfusion associated graft versus host diseases，TA-GVHD）的發(fā)生[3-4]。目前國內(nèi)外主要應(yīng)用γ射線輻照技術(shù)制備輻照血液，有的國家應(yīng)用率已高達95%[5]。作為國際公認的用于制備輻照血液的推薦方法之一，X射線輻照技術(shù)因其輻射均勻性好、易于安全防護、不易造成環(huán)境污染等優(yōu)點正逐漸替代γ射線輻照技術(shù)被應(yīng)用于制備輻照血液[6]。然而，現(xiàn)有法律法規(guī)對X射線輻照血液的質(zhì)量標準仍無明確規(guī)定，并且X射線對紅細胞質(zhì)量的影響還有待深入探究。基于此，本研究通過測定X射線輻照儀制備的輻照血液與γ射線輻照儀制備的輻照血液在不同保存期的質(zhì)控指標與部分理化指標，對比分析兩種技術(shù)制備的輻照血液的差異，以評價X射線輻照儀制備的輻照血液的質(zhì)量，同時為后續(xù)建立輻照血液的具體質(zhì)量標準提供數(shù)據(jù)支持，具體報告如下。

材料與方法

1 研究對象

隨機抽取ALT檢測不合格，其他各項檢測均合格的2 U懸浮紅細胞共計49袋，其中21袋進行γ射線輻照，28袋進行X射線輻照。本研究所涉及的懸浮紅細胞樣本均來源于初篩合格的無償獻血者。

2 主要儀器及試劑

γ射線血液輻照儀（BIOBEAM 8000，德國）與X射線血液輻照儀（RS3400，山東威高）分別用于懸浮紅細胞的輻照處理；懸浮紅細胞血細胞比容（HCT）與血紅蛋白含量（cHb）的測定使用血細胞計數(shù)儀（KX-21，Sysmex）完成；使用生化分析儀（008a，日立）完成紅細胞上清液中K+、Na+、Cl-、Ca2+的測定；K+、Na+、Cl-濃度測定所使用的試劑包括參比電極液（日立，批號：L1656）、樣本稀釋液（日立，批號：K2321）、內(nèi)部標準液（日立，批號：J4801）；鈣離子檢測試劑盒（和光，批號：205877）用于Ca2+濃度的測定；恒溫水浴箱（BWS-20，上海一恒）、紫外可見分光光度計（T6，北京普析）與游離血紅蛋白測定試劑盒（瑞爾達，北京）用于游離血紅蛋白含量的測定。

3 懸浮紅細胞標本的留取和保存

實驗所涉及的懸浮紅細胞均嚴格按照《血站技術(shù)操作規(guī)程》與《全血及成分血質(zhì)量要求》的要求制備而來，除ALT檢測不合格以外，其他各項檢測均合格。將留取的49袋懸浮紅細胞全部置于2～6℃血液冷藏冰箱中保存。

4 對懸浮紅細胞進行X射線輻照與γ射線輻照

將留取的懸浮紅細胞按照輻照技術(shù)的不同分為X組與γ組，其中X組共計28袋懸浮紅細胞，γ組共計21袋懸浮紅細胞。為了最大限度考察輻照血液各項指標的變化，在采集后第13天對X組與γ組懸浮紅細胞分別進行X射線與γ射線輻照處理，輻照結(jié)束后將血液置于2～6 ℃血液冷藏冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

5 取樣時間點的選擇

根據(jù)GB 18469-2012的規(guī)定，經(jīng)輻照后的血液制劑，其質(zhì)量控制要求與原血液制劑的要求相同，故本項目共設(shè)計了兩個取樣時間點，分別為輻照后第1天與輻照后第22天，即采集后第14天與采集后第35天。

6 血細胞比容（HCT）與血紅蛋白含量（c血紅蛋白）的測定

分別留取采集后第14天（輻照后第1天）與采集后第35天（輻照后第22天）的經(jīng)X射線與γ射線輻照后的懸浮紅細胞，使用血細胞計數(shù)儀測定其血細胞比容與血紅蛋白含量。

7 游離血紅蛋白含量（c游離血紅蛋白）的測定

分別留取采集后第14天（輻照后第1天）與采集后第35天（輻照后第22天）的經(jīng)X射線與γ射線輻照后的懸浮紅細胞，通過低速離心機以3 500×g離心5 min后取上清液，使用游離血紅蛋白測定試劑盒進行游離血紅蛋白含量的測定，具體操作步驟參照游離血紅蛋白測定試劑盒說明書。

8 溶血率的計算

根據(jù)公式溶血率（%）=（1-HCT）×c游離血紅蛋白/c血紅蛋白×100%計算相應(yīng)時間點的溶血率。

9 K+、Na+、Cl-、Ca2+濃度的測定

分別留取采集后第14天（輻照后第1天）與采集后第35天（輻照后第22天）的經(jīng)X射線與γ射線輻照后的懸浮紅細胞，通過低速離心機以3 500×g離心5 min后取上清液，使用日立008a全自動生化分析儀及相應(yīng)試劑分別測定上清液中的K+、Na+、Cl-、Ca2+濃度。

10 統(tǒng)計學分析

SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件用于實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。計算各組數(shù)據(jù)的平均值與標準差，采用平均值±標準差（）對實驗結(jié)果進行表示，其中溶血率的單位為%，K+、Na+、Cl-、Ca2+濃度的單位均為mmol/L。兩組數(shù)據(jù)間的差異性比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 溶血率的比較

結(jié)果見表1。輻照后第1天，X組的溶血率為（0.10±0.03）%，γ組的溶血率為（0.09±0.06）%，兩者無顯著性差異（P1，2＞0.05）。輻照后第22天，X組的溶血率為（0.29±0.07）%，γ組的溶血率為（0.27±0.06）%，兩者無明顯差異（P3，4＞ 0.05）。隨著保存時間的延長，X組與γ組的溶血率均明顯增大（P1，3＜0.05，P2，4＜0.05），但均滿足紅細胞制劑儲存期末溶血率＜紅細胞總量的0.8%的質(zhì)量標準。

表1 X組與γ組溶血率的對比

2 K+濃度的比較

見表2。輻照后第1天，X組上清液K+濃度為（46.50±7.94）mmol/L，γ組上清液K+濃度為（45.03±4.65）mmol/L，X組上清液K+濃度與γ組上清液K+濃度相當（P1，2＞0.05）。輻照后第22天，X組上清液K+濃度為（64.22±4.58）mmol/L，γ組上清液K+濃度為（63.05±3.57）mmol/L，兩者無明顯差異（P3，4＞0.05）。X組上清液與γ組上清液中的K+濃度隨著保存時間的延長明顯增大（P1，3＜0.05，P2，4＜0.05）。

表2 X組與γ組上清液中K+濃度的對比

3 Na+濃度的比較

結(jié)果見表3。輻照后第1天，X組上清液Na+濃度為（99.44±3.86）mmol/L，γ組上清液Na+濃度為（100.83±4.79）mmol/L，X組上清液Na+濃度與γ組Na+濃度無明顯差異（P1，2＞0.05）。輻照后第22天，X組上清液Na+濃度為（81.50±5.56）mmol/L，γ組上清液Na+濃度為（81.76±3.91）mmol/L，兩者無明顯差異（P3，4＞0.05）。隨著保存時間的延長，X組上清液與γ組上清液中的Na+濃度均明顯降低（P1，3＜0.05，P2，4＜0.05）。

表3 X組與γ組上清液中Na+濃度的對比

4 Cl-濃度的比較

結(jié)果如表4所示。輻照后第1天，X組上清液中的Cl-濃度為（68.35±2.79）mmol/L，γ組上清液中的Cl-濃度為（67.59±1.26）mmol/L，X組上清液中的Cl-濃度與γ組上清液中的Cl-濃度無明顯差異（P1，2＞0.05）。輻照后第22天，X組Cl-的濃度為（68.72±1.97）mmol/L，γ組Cl-的濃度為（68.28±1.36）mmol/L，兩者無明顯差異（P3，4＞0.05）。隨著保存時間的延長，X組與γ組上清液中的Cl-濃度均無明顯變化（P1，3＞0.05，P2，4＞0.05）。

表4 X組與γ組上清液中Cl-濃度的對比

5 Ca2+濃度的比較

結(jié)果如表5所示。輻照后第1天，X組上清液中的Ca2+濃度為（0.40±0.11）mmol/L，γ組上清液中的Ca2+濃度為（0.43±0.08）mmol/L，X組上清液中的Ca2+濃度與γ組上清液中的Ca2+濃度無明顯差異（P1，2= 0.192）。輻照后第22天，X組上清液中的Ca2+濃度為（0.39±0.10）mmol/L，γ組上清液中的Ca2+濃度為（0.41±0.04）mmol/L，兩者無明顯差異（P3，4=0.613）。且隨著保存期的延長，X組與γ組上清液中的Ca2+濃度無明顯變化（P1，3＞0.05，P2，4＞0.05）。

表5 X組與γ組的Ca2+濃度對比

討 論

TA-GVHD是輸血最嚴重的并發(fā)癥之一，其發(fā)病機制主要是由于受者機體的免疫系統(tǒng)無法正常識別并清除供者的外源細胞，供者的淋巴細胞在受者體內(nèi)存活并定植，通過識別受者宿主抗原、介導免疫反應(yīng)攻擊宿主的靶器官及組織[3-4]。輸注輻照血液是最常用，也是最有效的用于預(yù)防TA-GVHD的方法[7]。

目前用于制備輻照血液的技術(shù)主要為γ射線輻照技術(shù)與X射線輻照技術(shù)。γ射線輻照通常采用放射性同位素鈷60（60Co）或銫137（137Cs）作為永久放射源[8-10]，目前在國內(nèi)采供血機構(gòu)已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用[11-14]。X射線輻照則是利用電子加速器產(chǎn)生的高能電子轟擊靶點發(fā)生韌致輻射反應(yīng)而產(chǎn)生X射線進行輻照[9]，待使用狀態(tài)時對環(huán)境和使用人員無安全威脅，國內(nèi)關(guān)于X射線輻照儀的創(chuàng)新研究已逐漸增多[15-17]。有研究表明，隨著保存時間的延長，經(jīng)輻照后的紅細胞成分包括攜氧能力、細胞活性、滲透脆性、上清液K+濃度、Na+濃度、游離血紅蛋白在內(nèi)的諸多理化指標會產(chǎn)生變化，輻照會導致紅細胞一定程度的損傷[18]，因此，對輻照后紅細胞成分質(zhì)量的變化進行探究具有重要意義。經(jīng)查閱文獻資料，目前已有較多對γ射線輻照對血液制劑質(zhì)量的影響的文獻報道[19-22]，而有關(guān)于X射線輻照對血液制劑質(zhì)量影響的研究則較少[23-25]。此外，《全血及成分血質(zhì)量要求》（GB-18469）也僅對γ射線輻照血液的質(zhì)量要求進行了規(guī)定，而未涉及X射線輻照血液[26]。

本研究對X射線輻照儀與γ射線輻照儀制備的輻照紅細胞成分在輻照后第1天與輻照后第22天的溶血率、上清液K+濃度、Na+濃度、Cl-濃度與Ca2+濃度進行了測定，并對比分析了兩種技術(shù)制備的輻照紅細胞成分相關(guān)指標的差異，以評價X射線對輻照紅細胞成分質(zhì)量的影響，并為輻照紅細胞成分質(zhì)量標準的建立和細化提供數(shù)據(jù)支持。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)X射線輻照儀與γ射線輻照儀制備的輻照紅細胞成分在輻照后第1天與輻照后第22天的溶血率、上清液K+濃度、Na+濃度、Cl-濃度與Ca2+濃度均無明顯差異（P＞0.05），提示X射線輻照與γ射線輻照對紅細胞成分質(zhì)量的影響相當，與現(xiàn)有的文獻報道結(jié)果一致[24，27]，認為γ射線輻照儀制備的輻照血液的質(zhì)量標準應(yīng)適用于X射線輻照儀制備的輻照血液。另外，隨著輻照后保存時間的延長，兩種技術(shù)制備的輻照紅細胞成分的溶血率、上清液K+濃度均明顯增大，這是因為隨著保存時間的延長，紅細胞膜逐漸出現(xiàn)破裂，紅細胞中的血紅蛋白與K+釋放到紅細胞外所致，上清液K+濃度的增大提示對于血鉀偏高的患者，應(yīng)盡量使用較新鮮的輻照紅細胞成分，或者在輸注輻照紅細胞成分后應(yīng)及時應(yīng)用降血鉀藥物，以避免引起不良后果[28-30]。另外，當保存期為輻照后第22天，即采集后第35天時，兩種技術(shù)制備的輻照紅細胞成分的溶血率，均滿足紅細胞制劑儲存期末溶血率＜紅細胞總量的0.8%的質(zhì)量標準，但考慮到本文僅考察了《全血及成分血質(zhì)量要求》規(guī)定的質(zhì)控指標，未涉及諸如2，3-DPG、ATP、紅細胞滲透脆性等其他反映紅細胞狀態(tài)的指標，因此，是否可考慮將輻照紅細胞成分的保存期進行適當延長，需依據(jù)其他指標的探究結(jié)果進行綜合判定。與溶血率、上清液K+濃度變化不同的是，兩種技術(shù)制備的輻照紅細胞成分的上清液Na+濃度均隨著輻照后保存時間的延長顯著降低，而上清液Cl-濃度與Ca2+濃度則不隨輻照后保存期的延長而發(fā)生變化。

綜上，X射線輻照儀與γ射線輻照儀制備的輻照紅細胞成分的質(zhì)量無明顯差異，表明使用X射線輻照儀替代γ射線輻照儀是安全、可行的。但通過調(diào)研文獻資料發(fā)現(xiàn)，輻照血液與未輻照血液的各項指標相比均有不同程度的差異[30-31]，提示X射線輻照對血液成分也可能存在一定程度的損傷，后續(xù)我們也將繼續(xù)開展X射線輻照血液的相關(guān)研究，以為輻照血液質(zhì)量標準的優(yōu)化和完善提供更加詳實的數(shù)據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突