基于網絡藥理學和分子對接技術探討蔓荊子防治急性心肌梗死的作用機制

陳禮琴,徐彤彤,呂祥威,武 琦,覃秋語,趙位昆

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是一種常見的心血管疾病,其主要特征是冠狀動脈閉塞后心肌長時間處于缺血狀態(tài)進而導致心肌細胞發(fā)生不可逆性損傷[1]。早期及時的血運重建是目前治療AMI的主要措施,通常采用經皮冠狀動脈介入術或溶栓治療,這些治療方法能夠迅速恢復血供,但是經再灌注治療后AMI病人的死亡率仍居高不下[2]。因此,積極研發(fā)防治AMI的有效治療藥物具有非常重要的意義。

近年來,隨著中醫(yī)學多靶點、全方位的治療理念不斷推進,中藥在心血管領域的重要性不斷提升。單純西藥干預治療存在一定不良反應且治療效果有限。中藥不同于西藥,具有多靶點、多通路、多環(huán)節(jié)的治療特點,其副作用也相對較輕。蔓荊子是馬鞭草科牡荊屬植物的干燥成熟果實,具有抗炎、抗菌、抗氧化等藥理活性[3]。其成分中含有牡荊子黃酮,即紫花牡荊素,經研究表明,紫花牡荊素可通過多種途徑抑制心肌缺血再灌注損傷,對心血管系統(tǒng)疾病有一定的治療作用,其作用機制可能與抑制炎癥反應、氧化反應、細胞凋亡等相關[4]。但是蔓荊子在AMI中的作用尚不清楚,故本研究擬通過網絡藥理學結合分子對接探討蔓荊子防治AMI的潛在靶點以及作用機制。

1 資料與方法

1.1 蔓荊子有效成分及其靶點獲取

應用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,https://tcmsp-e.com/tcmsp.php),以草本名稱(herb name)“蔓荊子”進行檢索,限定口服利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥18%篩選有效成分并通過TCMSP數據庫獲得相應化合物對應的靶點。滿足篩選條件但是未能在TCMSP數據庫獲得相應作用靶點的化合物,搜索其CAS號并輸入PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)以獲取其Canonical SMILES號。通過SwissTargetPrediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch),物種選擇為“Homo sapiens”,將預測出的靶點取Probability>0的前15位作為補充。應用UniPort數據庫(https://www.uniprot.org),以物種為人類且為已驗證的基因作為篩選條件,對預測的藥物靶點名稱進行校正,統(tǒng)一為GeneSymbol。

1.2 AMI疾病靶點收集

以“acute myocardial infarction”為檢索詞,物種限定為“Homo sapiens”,通過GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)、TTD數據庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM數據庫(https://www.omim.org/)進行檢索并獲得AMI疾病的基因靶點。

1.3 藥物-藥物化合物-靶點網絡圖的構建

運用Rstudio 4.1.3軟件中的“VennDiagram”程序包繪制韋恩圖,獲取蔓荊子活性成分與AMI疾病的交集,并將交集靶點作為蔓荊子治療AMI的潛在靶點。除去蔓荊子與疾病靶點未存在交集的有效成分,將藥物有效成分的Mol ID與共有靶點導入Cytoscape 3.9.1[5]軟件中構建“藥物-藥物化合物-靶點”可視化網絡圖。利用Network Analyzer工具,計算各節(jié)點的連接度(Degree)值,節(jié)點代表藥物、化合物或靶點,節(jié)點之間的連接代表其存在相互作用,節(jié)點的Degree值代表節(jié)點之間相連的數目。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡圖的構建

將交集靶點輸入STRING數據庫(https://cn.string-db.org/),篩選條件為物種“Homo sapiens”、最低相互作用得分≥0.4、去除在網絡中斷開的節(jié)點,以TSV格式導出相應結果,將文件導入Cytoscape 3.9.1,構建PPI網絡。設置節(jié)點的大小、顏色與Degree值成正比,Degree值越大,節(jié)點越大,顏色越深。通過Cytohubba插件對PPI網絡進行篩選分析,分別以MCC、MNC、Degree、Betweennesss、Radiality計算前20個核心基因,取其交集,獲取關鍵靶點。MCC在Cytohubba中具有更高的可信度[6],故將獲得的關鍵靶點按照MCC降序排列。

1.5 基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析

利用Rstudio 4.1.3及Bioconductor數據庫的“org.Hs.eg.db”程序包將交集靶點的基因symbols轉化為Entrez IDs,隨后利用“ClusterProfiler”程序包對網絡進行GO富集分析和KEGG富集分析。選取P<0.05的條目分別繪制GO及KEGG富集分析結果圖,篩選出交集靶點所涉及的分子功能(molecular function,MF)、細胞組成(cellular component,CC)、生物過程(biological process,BP)以及信號通路的前20項。

1.6 分子對接驗證

通過PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索關鍵靶點對應的化合物并下載其sdf格式的三維結構,利用OpenBabel 3.1.1將sdf格式轉化為pdb格式,應用蛋白晶體結構數據庫(PDB,https://www.rcsb.org/)搜索關鍵靶點并下載其三維結構。通過PyMOL 2.4.0和AutoDockTools 1.5.7(ADT)軟件對受體和配體進行常規(guī)處理,輸出pdbqt格式,借助AutoDock Vina對受體和配體進行分子對接[7]。使用Lamarckian(拉馬克)遺傳算法進行分子對接計算,根據結合自由能評估最終對接結構,靶蛋白受體與化合物配體之間的結合自由能越小,則親和能力越強。將結果再導入PyMOL 2.4.0進行可視化處理。

2 結 果

2.1 蔓荊子中活性成分及其靶點的篩選

在OB≥30%和DL≥18%的篩選條件下,通過TCMSP數據庫收集到27個藥物活性成分。獲取相應化合物對應的靶點,通過SwissTargetPrediction平臺進一步補充,匯總后去除重復值,蔓荊子有效成分對應靶點基因共計226個。詳見表1。

表1 蔓荊子中活性成分

2.2 蔓荊子活性成分與AMI疾病交集基因

通過GeneCards、DisGeNET、TTD、OMIM數據庫檢索“acute myocardial infarction”,得到靶點基因4 676個,去除重復后最終得到4 184個AMI疾病靶點基因。將226個藥物靶點與4 184個疾病靶點取交集得到交集靶點185個,即蔓荊子治療AMI的潛在靶點。詳見圖1。

圖1 蔓荊子活性成分與AMI疾病交集靶點韋恩圖

2.3 “藥物-藥物化合物-靶點”網絡

基于藥物與疾病靶點交集的185個靶基因及其有效成分,通過Cytoscape 3.9.1軟件,構建蔓荊子抗AMI的藥物-藥物化合物-靶點網絡圖。該網絡包括212個節(jié)點(其中黃色凹四邊形代表的是蔓荊子藥物,藍色菱形代表的是藥物化合物Mol ID,紅色圓形代表交集基因靶點)、415條邊,根據各節(jié)點的Degree值,排序后發(fā)現蔓荊子中最主要的5個活性化合物依次為:槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、豆甾醇(stigmasterol)、牡荊素C(vitexifolin C)。詳見圖2。

圖2 藥物-化合物-靶點網絡圖

2.4 PPI網絡構建及關鍵靶點的選取

將交集靶點導入STRING數據庫進行PPI網絡分析,保存STRING數據庫生成的PPI網絡圖,每條邊代表蛋白質和蛋白質之間的相互作用(見圖3)。將輸出的TSV格式文件導入Cytoscape 3.9.1軟件,構建PPI網絡圖(見圖4),用于后續(xù)核心靶點的篩選。網絡中顯示的線越多,關聯度越大,PPI網絡中交集靶點的排名也越高。PPI網絡圖中包含184個節(jié)點、3 473條邊,通過Degree值進行排列,Degree值越大,節(jié)點越大,顏色越深。利用CytoHubba插件對PPI網絡圖進行分析,分別設置MCC、MNC、Degree、Radiality、Betweennesss計算前20個核心基因,然后通過Rstudio 4.1.6利用“VennDiagram”程序包繪制韋恩圖(見圖5),取其交集,獲得11個關鍵靶點,按照MCC降序排列,依次為α-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-6(IL-6)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、白細胞介素-1β(IL1B)、細胞腫瘤抗原p53(TP53)、蛋白c-Fos(FOS)、磷酸酶和張力蛋白同源基因(PTEN),詳見表2。在PPI網絡中提取上述11個關鍵靶點創(chuàng)建子集以構建PPI核心網絡(見圖6)。該網絡中有11個節(jié)點、55條邊。按照MCC降序從紅到黃變化,顏色越紅,意味著其在MCC中排名越靠前。排名最前的為AKT1,排名最末為PTEN。

圖4 PPI蛋白相互作用關系網絡圖

圖5 交集靶點韋恩圖

圖6 11個關鍵靶點的PPI核心網絡圖

表2 Cytohubba交集靶點信息

2.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析

GO-BP富集分析顯示,蔓荊子可能通過調節(jié)脂多糖誘應答(response to lipopolysaccharide)、細菌來源的分子反應(response to molecule of bacterial origin)、異性生物質刺激的反應(response to xenobiotic stimulus)、含氧量的反應(response to oxygen levels)、金屬離子(response to metal ion)、傷口愈合(wound healing)、營養(yǎng)水平(response to nutrient levels)、氧化應激(response to oxidative stress)、炎癥反應(regulation of inflammatory response)等生物過程發(fā)揮治療作用。詳見圖7。

圖7 GO-BP富集分析(前20項條目)

GO-MF富集分析顯示,主要包括DNA結合蛋白因子(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶Ⅱ特異性結合DNA結合蛋白因子(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、信號受體激活劑活性(signaling receptor activator activity)、細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、泛素樣蛋白連接酶結合(ubiquitin-like protein ligase binding)、蛋白質異源二聚化活性(protein heterodimerization activity)、細胞因子活性(cytokine activity)、核受體活性(nuclear receptor activity)等。詳見圖8。

圖8 GO-MF富集分析(前20項條目)

GO-CC富集分析顯示,其主要參與膜筏(membrane raft)、膜微結構域(membrane microdomain)、囊泡腔(vesicle lumen)、細胞器外膜(organelle outer membrane)、外膜(outer membrane)、突觸膜(synaptic membrane)、內質網腔(endoplasmic reticulum lumen)、細胞質囊泡腔(cytoplasmic vesicle lumen)、質膜筏(plasma membrane raft)等細胞組分的構成。詳見圖9。

圖9 GO-CC富集分析(前20項條目)

KEGG通路富集分析顯示,蔓荊子可能通過參與脂質和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、糖尿病并發(fā)癥受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙型肝炎前列腺癌(hepatitis B prostate cancer)、血流剪切應力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信號轉導通路(TNF signaling pathway)等為主要調控作用途徑。詳見圖10。

2.6 分子對接驗證結果分析

一般而言,配體分子與受體蛋白間結合能愈小則表示二者結合親和力越強,結構也越穩(wěn)定。對PPI核心網絡中排名前5位的靶點進行分子對接,通過對AKT1、VEGFA、PTGS2、CASP3、TNF及其相應的化合物進行分子對接,結果見表3。

表3 部分關鍵靶點分子對接結果

2.6.1 活性成分與AKT1相互作用

山柰酚、木犀草素、檞皮素與AKT1分子對接結果表明,3種化合物和AKT1均存在較強的結合作用,結合能力為木犀草素>檞皮素>山柰酚。潛在的結合位點主要有THR-21、LYS-14、ASN-53、ARG-23、ARG-25、ARG-15、LEU-52等氨基酸殘基。3種化合物均可與氨基酸形成至少4個氫鍵,化合物與蛋白口袋結合能力較佳。其中木犀草素與AKT1受體的活性殘基形成7個氫鍵,多于另外2個化合物,說明該化合物與蛋白結合口袋的結合更強。詳見圖11。

圖11 山柰酚、木犀草素、檞皮素與AKT1分子對接模式圖

2.6.2 活性成分與VEGFA相互作用

木犀草素、檞皮素與VEGFA分子對接結果表明,2種化合物和VEGFA均存在較好的結合作用,結合能力為檞皮素>木犀草素。潛在的結合位點主要有LYS-39、GLY-114、CYS-68、CYS-61、ASP-63、ASN-62等氨基酸殘基。2種化合物均可與氨基酸形成至少2個氫鍵。其中檞皮素與VEGFA受體的活性殘基形成7個氫鍵,多于木犀草素,說明該化合物與蛋白結合口袋結合較強。詳見圖12。

圖12 木犀草素、檞皮素與AEGFA受體分子對接模式圖

2.6.3 活性成分與PTGS2相互作用

將關鍵靶點PTGS2分別與15種蔓荊子活性成分進行對接,結合能力居前6位的化合物為玄參黃酮、山柰酚、CHEMBL1589200、木犀草素、檞皮素、紫杉葉素,與PTGS2對接結果表明,此6種化合物與PTGS2均存在較好的結合作用,結合能力為檞皮素>木犀草素>CHEMBL1589200>紫杉葉素、山柰酚>玄參黃酮。潛在的結合位點主要有HIS-39、ARG-44、TYR-130、GLU-465、GLY-135、CYS-47、CYL-36、ASP-125、ASN-43、ARG-469等氨基酸殘基。其中檞皮素與PTGS2受體的活性殘基形成5個氫鍵,多于其他活性成分,說明該化合物與蛋白結合口袋結合較強。詳見圖13。

圖13 活性成分與PTGS2受體分子對接模式圖

2.6.4 活性成分與CASP3相互作用

山柰酚、木犀草素、檞皮素與CASP3對接結果表明,3種化合物和CASP3均存在較強的結合作用,結合能力為木犀草素>山柰酚>檞皮素。潛在的結合位點主要有GLU-124、GLY-125、ARG-164、THR-140、PHE-158、ALA-162等氨基酸殘基。3種化合物均可與氨基酸形成至少3個氫鍵,化合物與蛋白口袋結合能力較佳。其中木犀草素與CASP3受體的活性殘基形成6個氫鍵,多于另外2個化合物,說明該化合物與蛋白結合口袋的結合更強。詳見圖14。

圖14 山柰酚、木犀草素、檞皮素與CASP3分子對接模式圖

2.6.5 活性成分與TNF相互作用

山柰酚、木犀草素、檞皮素、Vitrofolal B與TNF對接結果表明,4種化合物和TNF均存在較強的結合作用,結合能力為檞皮素>木犀草素>山柰酚>Vitrofolal B。潛在的結合位點主要有TYR-115、GLN-102、GLU-116、ALA-22、ASN-46、TRP-28、ALA-134、GLN-25、SER-133等氨基酸殘基。4種化合物均可與氨基酸形成至少3個氫鍵,化合物與蛋白口袋結合能力較佳。其中檞皮素與TNF受體的活性殘基形成6個氫鍵,多于另外3個化合物,說明該化合物與蛋白結合口袋的結合更強。詳見圖15。

圖15 活性成分與TNF分子對接模式圖

3 討 論

蔓荊子是一種被廣泛應用于防治多種疾病的傳統(tǒng)中藥,包括心血管系統(tǒng)疾病,具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗癌和抗氧化等作用[8]。但是蔓荊子防治AMI的作用機制尚未充分闡明,本研究利用現代生物信息學技術,探尋蔓荊子防治AMI的藥效物質基礎和潛在作用靶點。通過構建“藥物-藥物化合物-靶點”網絡,發(fā)現槲皮素、木犀草素、山柰酚、豆甾醇、牡荊素C的Dgree值較大,在網絡中作用明顯,表明這5個成分可能是蔓荊子在防治AMI中發(fā)揮作用的主要物質基礎。Li等[9]研究發(fā)現,槲皮素可抑制半乳糖凝集素-3-炎癥小體(Gal-3-NLRP3)信號通路,發(fā)揮抗炎與抗氧化特性來減輕冠狀動脈粥樣硬化。Ding等[10]研究發(fā)現,木犀草素可通過調節(jié)信號換能器和轉錄激活劑來緩解炎癥反應,減少巨噬細胞和脂質的積累,進而減輕冠狀動脈粥樣硬化。Feng等[11]研究表明,山柰酚可通過抑制炎癥和細胞凋亡,使血管和脂質水平的形態(tài)正?；：按旱萚12]研究發(fā)現,牡荊素可抑制心肌細胞缺氧/復氧(H/R)后活性氧產生,減少心肌細胞自噬體累積,對心肌細胞H/R損傷有明顯的保護作用。

通過對藥物與疾病交集的185個靶點進行GO和KEGG富集分析。GO富集分析結果顯示,蔓荊子可能通過參與調控脂多糖誘應答、細菌來源的分子反應、異性生物質刺激的反應、金屬離子、傷口愈合、營養(yǎng)水平、氧化應激、炎癥反應等生物過程發(fā)揮治療作用。此外,可通過干預DNA結合蛋白因子、RNA聚合酶Ⅱ特異性結合DNA結合蛋白因子、信號受體激活劑活性、細胞因子受體結合、泛素樣蛋白連接酶結合、蛋白質異源二聚化活性、細胞因子活性、核受體活性等最終影響靶基因的表達。KEGG通路富集分析顯示,蔓荊子可能通過參與脂質和動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥受體信號通路、血流剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、TNF信號轉導通路等為主要調控作用途徑。通過GO和KEGG富集分析可知,蔓荊子可通過影響靶基因的表達,實現減輕內皮細胞損傷、氧化應激損傷、動脈粥樣硬化及脂質沉積等帶來的不利影響。表明蔓荊子是通過多靶點、多通路共同發(fā)揮抗血管內斑塊形成的作用,從而發(fā)揮防治AMI的作用。

對185個交集靶點進行PPI分析,并利用插件CytoHubba進一步篩選,結果顯示,AKT1、VEGFA、PTGS2、CASP3、TNF、IL-6、MMP9、IL1B、TP53、FOS、PTEN在該網絡中起到關鍵作用。AKT激酶是AGC蛋白激酶組的成員,在細胞增殖、遷移、生長和代謝等功能方面扮演著重要的角色[13]。血管內皮生長因子(VEGF)是一種同源二聚體血管活性糖蛋白,是血管通透性和血管生成的主要調節(jié)因子。近年來,治療性血管生成已被提出作為治療AMI的新策略,VEGFA表達水平與梗死區(qū)微血管密度增加呈正相關,提示VEGFA在心肌重塑和血管生成中起著重要的作用[14]。CASP3的抑制劑是細胞凋亡的主要執(zhí)行劑[15],通過慢病毒轉染大鼠可下調CASP3的表達進一步縮小心肌組織的梗死面積和降低心肌細胞的凋亡指數[16]。Zhou等[17]研究發(fā)現,動脈粥樣硬化的嚴重程度與PTGS2的表達呈正相關,且PTGS2可能是動脈粥樣硬化的中心基因。TNF是參與細胞衰老的主要炎癥信號分子之一,研究發(fā)現,奧格列汀可以抑制TNF-α誘導的促炎細胞因子白細胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-8的表達,并通過減少氫的產生來抑制氧化應激,以預防大鼠主動脈血管平滑肌細胞的衰老[18]。MMP9是血管生成的關鍵調節(jié)因子[19],主要由成纖維細胞、炎性細胞和肌細胞產生,其表達和活性的變化與心肌梗死后左心室重塑密切相關[20]。

分子對接結果表明,蔓荊子部分關鍵化合物與相應靶蛋白均存在較佳的結合作用。其中核心靶點AKT1與化合物木犀草素結合親和能力最強;VEGFA與檞皮素結合親和能力最強;PTGS2與檞皮素結合親和能力最強;CASP3與木樨草素結合能最強;TNF與檞皮素結合親和能力最強。化合物均存在較多的氫鍵受體供體,這有助于與靶蛋白形成較為穩(wěn)定的氫鍵使小分子化合物配體能夠穩(wěn)定地結合在相應蛋白的活性位點。此外,化合物配體與蛋白活性殘基還存在疏水相互作用和范德華力以及形成共軛結構。這些作用力可以有效地使小分子固定在活性中心,從而提高化合物在蛋白活性口袋的穩(wěn)定性。

本研究結果表明,蔓荊子防治AMI具有多成分、多靶點、多通路、多環(huán)節(jié)的調控特點,可能通過抗炎、免疫調節(jié)、脂代謝、調節(jié)細胞凋亡及細胞自噬等過程發(fā)揮防治作用。