毛佩芝 吳紀(jì)恒 王龍虎 嚴(yán)熒燕 汪志春
1 寧波市婦女兒童醫(yī)院 浙江 寧波 315000
2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院 浙江 杭州 310058
3 浙江大學(xué)藥學(xué)院 浙江 杭州 310058
4 江蘇京蟾生物資源開(kāi)發(fā)有限公司 江蘇 盱眙 211700
非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是目前發(fā)病率和死亡率均排前列的惡性腫瘤[1]。臨床試驗(yàn)以及實(shí)踐證明,中藥在提高放化療效果、改善腫瘤耐藥反應(yīng)、降低術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、延長(zhǎng)病人生存期、提升生存質(zhì)量等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)[2,3]。蟾酥為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍(Bufobufo gargarizans)或黑框蟾蜍(BufomelanostictusSchneider)的干燥分泌物,是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材。研究顯示,蟾酥的主要藥效物質(zhì)是蟾毒配基類成分,其在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)以及減輕癌痛等方面有顯著療效[4,5]。因此,蟾酥及其制劑廣泛用于抗腫瘤,治療肺癌效果尤佳[6-8]。然而蟾酥抗腫瘤的作用機(jī)制復(fù)雜,作用靶點(diǎn)尚未明確,加上它又是毒性中藥,其應(yīng)用受到限制[9,10]。因此,探索蟾酥抗腫瘤的結(jié)合靶點(diǎn)及其作用機(jī)制,對(duì)其精準(zhǔn)用藥具有重要意義。
分子對(duì)接技術(shù)可以通過(guò)算法模擬小分子與受體大分子蛋白之間的結(jié)合作用方式。在計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)中,模擬分子對(duì)接是關(guān)鍵步驟,即通過(guò)算法預(yù)測(cè)藥物分子與靶點(diǎn)結(jié)合互相作用的方式和過(guò)程[11]。分子對(duì)接技術(shù)在中藥活性成分篩選和靶點(diǎn)確證方面有著廣泛的應(yīng)用前景。
本文在前期研究的基礎(chǔ)上[12],采用半柔性分子對(duì)接技術(shù),研究蟾酥有效成分與PARP 蛋白間的相互結(jié)合方式,從結(jié)合自由能、疏水作用、構(gòu)象穩(wěn)定性、結(jié)合親和力等方面探討配體抑制活性的概率,初步探究蟾酥抗腫瘤作用機(jī)制。然后,在虛擬分析的基礎(chǔ)上,開(kāi)展流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沙蟾毒精引起的A549 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn),并檢測(cè)沙蟾毒精給藥后A549 細(xì)胞中cleaved PARP 的表達(dá)量,以達(dá)到與分子對(duì)接預(yù)測(cè)結(jié)果相互佐證的目的。本文研究的意義在于為蟾酥的精準(zhǔn)用藥和新藥開(kāi)發(fā)提供新的研究基礎(chǔ)。
1.1 細(xì)胞與試劑:A549和H157細(xì)胞由浙江大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)室提供。標(biāo)準(zhǔn)品沙蟾毒精(CAS:464-74-4)、遠(yuǎn)華蟾毒精(CAS:472-26-4)、華蟾毒它靈(CAS:1108-68-5)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于98%。噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Annexin V/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒(中國(guó)Biosharp 公司);PARP 一抗(Abcam 公司,批號(hào):ab227244);山羊抗兔二抗(Abcam公司,批號(hào):ab7090)。
1.2 儀器:酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-TEK 公司);FC 500MCL 流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter 公司);化學(xué)發(fā)光成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。
1.3 軟件和數(shù)據(jù):Autodock 軟件由美國(guó)斯克利普斯研究所開(kāi)發(fā),免費(fèi)授權(quán)。PARP 蛋白晶體結(jié)構(gòu)來(lái)源于數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)。三維結(jié)構(gòu)來(lái)源于(https://zinc.docking.org/substances/home/)。軟件運(yùn)行于Windows操作系統(tǒng)下。相關(guān)軟件均已授權(quán)或免授權(quán)。
2.1 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)處理:在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中,搜索PARP-1 蛋白(蛋白號(hào):5DS3)晶體結(jié)構(gòu)文件,基源為大腸桿菌。利用Pymol軟件去除水分子和多余的配體,得到PARP-1蛋白結(jié)構(gòu)。之后添加電荷和極性氫原子,應(yīng)用Autodock軟件對(duì)小分子化合物進(jìn)行能量?jī)?yōu)化,檢查可旋轉(zhuǎn)的化學(xué)鍵,另存為pdbqt[Protein Data Bank,Partial Charge(Q),& Atom Type(T)]文件。
2.2 Autodock 分子對(duì)接:Autodock 4.2 軟件運(yùn)行于Windows 系統(tǒng)下,依次加載蛋白晶體結(jié)構(gòu)(受體)和小分子化合物(配體)。用Auto Grid 計(jì)算格點(diǎn)能量,采用拉馬克遺傳算法對(duì)接運(yùn)算,用半經(jīng)驗(yàn)的自由能評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)各配體與蛋白之間的結(jié)合情況。參數(shù)設(shè)置:將參數(shù)“能量最大評(píng)價(jià)次數(shù)”確定為2500000,運(yùn)行次數(shù)確定為100,其他參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[13]報(bào)道,確定蛋白活性口袋的氨基酸殘基和中心點(diǎn)坐標(biāo)(X、Y、Z):Gly 863、Ser 904、Tyr 907、Tyr 896、Lys 903 和Arg 878,中心坐標(biāo)為(30.571,15.384,44.088)。
2.3 PILP 分析:PILP(Protein-Ligand Interaction Profiler)是一個(gè)在線的蛋白配體非共價(jià)聯(lián)系的分析工具。將Autodock 生成的PDB 文件導(dǎo)入PILP,經(jīng)算法處理,以展示受體與配體之間的非共價(jià)鍵作用,包括氫鍵、π-π堆積、疏水作用等。
2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及MTT檢測(cè):選用第3代至第8代的A549和H157 細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中,在37℃、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每隔12h觀察并記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)1 次,以確保細(xì)胞狀態(tài)良好。在細(xì)胞培養(yǎng)72h 后,加入MTT 20μL,再孵育4h 后于酶標(biāo)儀490nm 處測(cè)定吸光度值,并計(jì)算細(xì)胞抑制率。
2.5 Western Blot:將培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS 沖洗細(xì)胞2次,再加入蛋白酶抑制劑和RIPA預(yù)混液,提取A549細(xì)胞總蛋白樣本,并檢測(cè)蛋白濃度;將蛋白樣本上樣在10%SDS-PAGE 凝膠梳孔中,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗(1∶899)中孵育;過(guò)夜后,洗膜,二抗孵育,洗膜;ECL 發(fā)光顯影,凝膠成像儀曝光,拍照,應(yīng)用ImageJ軟件檢測(cè)條帶灰度值,將目的條帶灰度值對(duì)比內(nèi)參條帶灰度值,得到目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
2.6 Annexin V-FITC 檢測(cè)細(xì)胞凋亡:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰酶消化制得懸液并將細(xì)胞接種于24 孔板,分組同上。藥物處理24h后消化、離心,預(yù)冷PBS重懸,將細(xì)胞密度調(diào)至1×105/mL,1000r/min 離心5min,棄上清,加入500μL 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞,加入5μL Annexin VFITC,輕輕混勻;再加入5μL 碘化丙啶,輕輕混勻,室溫下避光孵育10min,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
3.1 分子對(duì)接結(jié)果:蟾酥主成分與PARP-1 蛋白靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)接結(jié)果綜合了半經(jīng)驗(yàn)化的自由能評(píng)價(jià)評(píng)分抑制常數(shù)值(Ki)參與對(duì)接的氨基酸殘基等數(shù)據(jù)。PARP-1 分別與沙蟾毒精、嚏根草配基、嚏根草醇、華蟾毒它靈、遠(yuǎn)華蟾毒精、19-氧代華蟾毒它靈和19-氧代華蟾酥毒基相互作用的最低結(jié)合自由能分別為-5.72、-6.47、-6.52、-5.81、-6.25、-6.16、-6.80 KJ/mol。通過(guò)拉馬克算法分析,得到了PARP 蛋白(5DS3)和小分子配體的最佳對(duì)接方式,如圖1 所示。
圖1 有效成分與PARP-1對(duì)接模式圖
表1 蟾酥抗腫瘤活性成分與PARP蛋白的分子對(duì)接結(jié)果
3.2 體外活性試驗(yàn)結(jié)果:為了驗(yàn)證上述分析結(jié)果,本文選擇其中代表性化合物(沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精和華蟾毒它靈),考察有效成分對(duì)癌細(xì)胞(A549和H157)的生長(zhǎng)抑制作用,如表2所列。試驗(yàn)結(jié)果表明,它們都能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),這與虛擬分析的結(jié)論相吻合。
表2 3種活性成分對(duì)A549、H157肺癌細(xì)胞的抑制作用(±s,n=3)
表2 3種活性成分對(duì)A549、H157肺癌細(xì)胞的抑制作用(±s,n=3)
IC50(ng/mL)A549 H157沙蟾毒精12.37±3.61 8.89±1.43遠(yuǎn)華蟾毒精27.79±17.52 23.72±7.27華蟾毒它靈23.40±4.28 131.32±21.16
與空白對(duì)照比較,給藥干預(yù)A549 細(xì)胞、H157 細(xì)胞72h,各組細(xì)胞增殖受到抑制,細(xì)胞增殖抑制率隨給藥濃度上升而增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且500ng/mL濃度組增殖抑制效果最佳(圖2)。
圖2 三種化合物對(duì)A549、H157細(xì)胞的增殖抑制作用
3.3 沙蟾毒精誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡結(jié)果:我們進(jìn)一步測(cè)試了蟾酥抗腫瘤成分沙蟾毒精誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的效果。結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組(0ng/mL)比較,處理組細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P<0.05),且呈濃度依賴性,其中25ng/mL濃度組細(xì)胞凋亡比例最高。
圖3 沙蟾毒精誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.4 誘導(dǎo)PARP 蛋白裂解結(jié)果:圖4 是免疫印跡法探究沙蟾毒精誘導(dǎo)A549 細(xì)胞的PARP 蛋白裂解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖4 可知,與對(duì)照組(0ng/mL)相比,處理組的cleaved PARP 表達(dá)量明顯增加且呈濃度依賴性。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Autodock軟件模擬結(jié)果相一致。
圖4 免疫印跡法測(cè)定PARP蛋白的表達(dá)量
PARP-1 是近年來(lái)腫瘤治療的一個(gè)熱門(mén)靶點(diǎn),而PARP-1抑制劑能夠靶向抑制DNA損傷修復(fù)過(guò)程,體外試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)均證實(shí)PARP-1 抑制劑具有較強(qiáng)的抗腫瘤效果,其已進(jìn)入臨床使用并取得了一系列令人滿意的療效[14]。由于腫瘤細(xì)胞基因組不穩(wěn)定,其存活非常依賴DNA 損傷應(yīng)答修復(fù)機(jī)制[15]。PARP-1 最重要的功能是參與堿基切除與修復(fù),在單鏈DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[16]。PARP 在細(xì)胞DNA 損傷后可以被激活,并識(shí)別DNA單鏈損傷缺口,最終結(jié)合到缺口上進(jìn)行修復(fù)。根據(jù)已有文獻(xiàn)[17]報(bào)道,蟾酥成分單體能夠通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡抑制其生長(zhǎng)。
首先本研究通過(guò)Autodock分子對(duì)接技術(shù)和PILP分析平臺(tái),模擬并預(yù)測(cè)了蟾酥有效成分的抗腫瘤作用靶點(diǎn)。結(jié)合表1 和圖1 所示,沙蟾毒精等7 種化合物均能與PARP-1的NAD+結(jié)合口袋中的部分氨基酸殘基發(fā)生氫鍵、鹽橋等相互作用,且與PARP-1 結(jié)合活性較強(qiáng),說(shuō)明這些化合物可能阻斷PARP-1 蛋白對(duì)損傷DNA 的修復(fù)作用,并以此發(fā)揮抗腫瘤活性。他們與PARP-1 結(jié)合的差異,在于各種結(jié)合自由能的差異,反映出配體與受體之間具有相當(dāng)?shù)挠H和力。
其次是結(jié)合的氨基酸殘基種類和結(jié)合方式的不同,由此可能導(dǎo)致最終藥效活性的差異。這7種化合物均屬于蟾毒配基類成分。根據(jù)文獻(xiàn)[13],對(duì)于蟾毒配基類分子的母核而言,在C-17位有α-吡喃環(huán)的甾體A/B順式、C/D順式結(jié)構(gòu)基本骨架對(duì)于維持其藥理活性至關(guān)重要。3-OH和5β-OH取代基能夠增加其活性,而C-3位的大取代基則不利于此類化合物的活性,可能是由于3位的大取代基會(huì)增大分子的極性。根據(jù)篩選結(jié)果,具有11α-羥基和12-羰基的沙蟾毒精表現(xiàn)出最強(qiáng)的藥理活性,說(shuō)明此結(jié)構(gòu)特征有利于增強(qiáng)其活性;對(duì)于19-氧代華蟾酥毒基、19-氧代華蟾毒它靈和華蟾毒它靈而言,16β-乙酰氧基有利于其分子活性增強(qiáng);此外,嚏根草醇的C-10位羥甲基;嚏根草配基,19-氧代華蟾毒它靈和19-氧代華蟾酥毒基的C-10位的醛基能夠增強(qiáng)其化合物活性,這與相關(guān)研究結(jié)果一致[18],說(shuō)明相對(duì)于蟾酥中的其他成分,我們篩選出的化合物具有對(duì)藥效活性更有利的取代基團(tuán),使得這些化合物在蟾酥對(duì)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。
本研究通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)成功預(yù)測(cè)PARP-1 有可能為蟾酥抗肺癌的腫瘤靶點(diǎn),隨后通過(guò)對(duì)沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精和華蟾毒它靈進(jìn)行藥效驗(yàn)證,證明3種成分具有顯著的肺癌細(xì)胞抑制作用。它們?cè)诩?xì)胞毒活性強(qiáng)弱排序?yàn)樯丑付揪?、遠(yuǎn)華蟾毒精、華蟾毒它靈。參考已上市的靶向PARP 蛋白的小分子藥物奧拉帕利(Olaparib)對(duì)A549 細(xì)胞的IC50 值:(13.38±1.2)μg/mL[19],以及現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的脂蟾毒配基對(duì)A549 細(xì)胞的IC50 值:(8.83±2.1)μg/mL[20]。對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),本文篩選出的小分子的IC50值顯著低于奧拉帕利和脂蟾毒配基,意味著更強(qiáng)的抑制作用。
最后本研究選擇其中含量最高的沙蟾毒精,探究其對(duì)細(xì)胞凋亡的作用及誘導(dǎo)PARP蛋白裂解的作用。結(jié)果表明,沙蟾毒精可以顯著誘導(dǎo)PARP蛋白發(fā)生裂解,并誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,由此抑制腫瘤細(xì)胞增殖,該結(jié)果與分子對(duì)接預(yù)測(cè)結(jié)果相互佐證。