外泌體在藥物遞送系統(tǒng)中的研究進(jìn)展

皮桐昊，劉瑞琦，賈佳佳，王東凱

（沈陽(yáng)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程極其復(fù)雜，多數(shù)藥物載體會(huì)在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中由于生物不相容性而導(dǎo)致藥物的生物利用度降低。并且在現(xiàn)階段的藥物治療中，多數(shù)藥物均需要載體進(jìn)行遞送以發(fā)揮良好的治療效果，而傳統(tǒng)的藥物遞送載體均以外源性載體為主，雖然現(xiàn)階段的納米級(jí)的藥物載體在一定程度上優(yōu)于傳統(tǒng)的藥物遞送載體，但將其投入臨床應(yīng)用和其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程仍然面臨著兩大問(wèn)題：①安全性——納米載體材料的毒性；②在體內(nèi)是否會(huì)造成異質(zhì)性——被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（reticuloendothelial system,RES）或單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（mononuclear phagocyte system,MPS）識(shí)別捕獲而被快速清除[1]。盡管現(xiàn)階段可通過(guò)聚乙二醇（PEG）對(duì)納米粒子進(jìn)行表面改性，賦予其“隱形”的特性，抑制血液中的調(diào)理素蛋白對(duì)納米載體的識(shí)別，減少了非特異性血清吸附，減少了RES 的吞噬，進(jìn)而使得納米載體可以在體內(nèi)具有較長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間，為靶向傳遞提供更多的機(jī)會(huì)；但由于PEG 層本身具有高度的親水性，在賦予納米載體“隱形”的同時(shí)，也阻礙了納米藥物載體與細(xì)胞膜之間進(jìn)行相互作用，會(huì)導(dǎo)致藥物的釋放不理想。并且，近年來(lái)有研究表明，納米載體也具有一定的免疫原性[2-4]，會(huì)引起機(jī)體的免疫應(yīng)答，仍然無(wú)法從根本上解決上述兩大問(wèn)題，適用范圍受到很大的限制。

與人工合成的納米級(jí)藥物載體相比，外泌體作為天然的內(nèi)源性物質(zhì)，首先就具有很好的生物相容性，具有極低的免疫原性，并且毒性極小，可以從根本上解決上述的兩大問(wèn)題。此外，外泌體在結(jié)構(gòu)上與單層脂質(zhì)體相似，在脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)中，疏水性藥物分布在雙分子層內(nèi)，親水性藥物分布在管腔內(nèi)[5]。根據(jù)這種相似性，預(yù)計(jì)外泌體藥物遞送系統(tǒng)將表現(xiàn)出與脂質(zhì)體相似的特征。通過(guò)仔細(xì)篩選外泌體的來(lái)源，可以作為一種高度特異性的藥物遞送系統(tǒng)，同時(shí)，作為天然的藥物載體來(lái)包載多種藥物[6]。近年來(lái)，已經(jīng)有一些案例證明了臨床前使用外泌體作為藥物遞送系統(tǒng)在多種治療應(yīng)用中的成功。例如，研究發(fā)現(xiàn)利用外泌體的包囊載藥，姜黃素的溶解性、穩(wěn)定性和抗炎性都得到了提升。此外，外泌體制劑在保護(hù)小鼠免受脂多糖攻擊方面優(yōu)于脂質(zhì)體制劑[7]。由此可見(jiàn)，外泌體確實(shí)是一種理想的藥物遞送載體，具有很高的研究?jī)r(jià)值和極其廣闊的應(yīng)用前景。

1 外泌體

1.1 外泌體及其基本來(lái)源

剛發(fā)現(xiàn)外泌體時(shí)，這種比多泡體還要小的細(xì)胞外囊泡被視為細(xì)胞外排出的代謝垃圾[8]，但隨著對(duì)這種細(xì)胞外囊泡不斷地深入研究，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞外囊泡在細(xì)胞之間的通訊交流中發(fā)揮著極其重要的作用[9]。在這種細(xì)胞外囊泡的形成過(guò)程中，多種生物分子被包裹在內(nèi)腔或者脂質(zhì)雙分子層內(nèi)，從而促進(jìn)該囊泡的多種功能[10]。該細(xì)胞外囊泡就是于 1987 年被 Johnstone 等[11]命名的外泌體。

外泌體是一種由活細(xì)胞產(chǎn)生的具有脂質(zhì)雙分子層的納米級(jí)的細(xì)胞外囊泡，可以看作為一個(gè)內(nèi)源性的“納米球”，其直徑在 30～100 nm。外泌體具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，由膽固醇、鞘磷脂和磷酸甘油酯等成分共同組成，在其脂質(zhì)雙分子層的表面附著有粘附分子、主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex,MHC）、大量的特定蛋白質(zhì)，包括四跨膜蛋白、熱休克蛋白等等和各種特定的配體（CD9、CD63、CD81 等）。除此以外，在外泌體的內(nèi)腔中還攜帶各種生物分子，包括核酸、某些酶類(lèi)、蛋白分子、細(xì)胞代謝物等，例如信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid,mRNA）、微小核糖核酸（micro ribonucleic acid,miRNA）、脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid,DNA）和長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸（Longnon-coding ribonucleic acid,LncRNA）等，如圖1 所示[12]。

Fig.1 Structure schematic of exosomes[12]圖1 外泌體的結(jié)構(gòu)圖[12]

外泌體的形成過(guò)程可以大致分為以下三步：①細(xì)胞膜通過(guò)內(nèi)吞作用向內(nèi)凹陷形成囊泡。②囊泡進(jìn)一步形成多泡體，多泡體內(nèi)包含細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物和蛋白質(zhì)。此時(shí)，多泡體有兩種選擇路徑，其一是與溶酶體結(jié)合，將內(nèi)容物和蛋白質(zhì)降解，另一種是③多泡體向細(xì)胞膜移動(dòng)，并與細(xì)胞膜融合，將胞內(nèi)囊泡釋放到細(xì)胞外，這個(gè)被釋放到細(xì)胞外的囊泡就是外泌體，這個(gè)過(guò)程也是外泌體的釋放過(guò)程（見(jiàn)圖2[13]）。多泡體經(jīng)細(xì)胞膜被釋放到供體細(xì)胞外之后，形成外泌體，隨之被附近的細(xì)胞或者是其他遠(yuǎn)處的受體細(xì)胞所吸收，進(jìn)而對(duì)受體細(xì)胞的生命活動(dòng)產(chǎn)生影響。

Fig.2 The formation process of exosomes[13]圖2 外泌體的形成過(guò)程[13]

外泌體的獲取來(lái)源較為豐富、廣泛，無(wú)論在正常生理狀態(tài)下，還是在病理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)幾乎所有的細(xì)胞都可以分泌產(chǎn)生外泌體，例如免疫細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等。外泌體可以被視為一種特異性分泌的膜泡,是細(xì)胞與細(xì)胞之間進(jìn)行物質(zhì)交換和信息交流的一種重要媒介。

1.2 外泌體作為藥物遞送載體的優(yōu)勢(shì)

與人工合成的藥物載體相比較，外泌體作為藥物遞送載體具有以下優(yōu)勢(shì)：①外泌體為內(nèi)源性物質(zhì)，具有極低的免疫原性和良好的生物相容性，不會(huì)被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)和單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)識(shí)別捕獲并快速清除。②具有很好的生物穩(wěn)定性，可使藥物的半衰期增加。相關(guān)研究表明，即使暴露在炎癥環(huán)境下，外泌體仍會(huì)對(duì)藥物提供保護(hù)，并具有較長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間[14]。并且值得注意的是，利用 PEG 對(duì)外泌體進(jìn)行表面修飾，利用“隱身”特性延緩了被 RES 的快速清除，可以顯著提高外泌體的循環(huán)時(shí)間。相關(guān)研究表明，修飾后的外泌體體內(nèi)循環(huán)時(shí)間可達(dá)到 60 min 以上[15]。③來(lái)源廣泛，體內(nèi)多種細(xì)胞在正常生理狀態(tài)和病理狀態(tài)下均可產(chǎn)生[16]，且存在多種分離提取的方法。④屬于天然的納米級(jí)藥物遞送載體。⑤可包載的藥物種類(lèi)多，特別是可以包載生物活性材料,包括DNA、RNA 和蛋白質(zhì)等[12。⑥外泌體可以通過(guò)絕大多數(shù)的生物膜系統(tǒng)發(fā)揮作用,包括血腦屏障在內(nèi)[17]。⑦相較于細(xì)胞療法，外泌體更易儲(chǔ)存[18]。⑧外泌體具有腫瘤靶向性以及其他特定的靶向性。大量研究數(shù)據(jù)顯示，外泌體也同其他納米載體（尺寸 ≤ 100 nm）一樣遵循增強(qiáng)滲透和保留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect,EPR）在腫瘤部位達(dá)到靶向聚集[16]；另外一些研究也表明，特定來(lái)源的外泌體具有內(nèi)在的靶向性。例如，由中樞神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可靶向聚集到特定的神經(jīng)元；由缺氧腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可向缺氧腫瘤部位靶向聚集[19-20]。⑨無(wú)異倍體性風(fēng)險(xiǎn)[21]，即不會(huì)造成使用者的染色體數(shù)目不完整。⑩作為內(nèi)源性物質(zhì)，其毒性可以忽略。相較于無(wú)機(jī)材料合成的納米載體，不會(huì)由于其不可降解性而存在潛在的毒性積累，大大降低了安全隱患[22-23]。綜上所述，外泌體是理想的藥物遞送載體[24]。

2 外泌體的獲取方法和載藥方法

2.1 外泌體的獲取方法

外泌體雖然是理想的藥物遞送載體，但是其分離提取卻存在一定的難度。如何在分離提取外泌體的過(guò)程中，同時(shí)保證其含量、生物活性和結(jié)構(gòu)的完整性是目前需要面臨的三個(gè)最大挑戰(zhàn)。因?yàn)榈侥壳盀橹?，還并不存在一種最優(yōu)的分離提取方法可以同時(shí)解決上述所有問(wèn)題。

迄今為止，用來(lái)分離提取外泌體的方法存在很多種，包括超速離心法、梯度密度離心法、分子排阻色譜法色譜、超濾離心法、聚合物沉淀法以及商業(yè)化的試劑盒等，但是每一種方法都存在各自的局限性。目前，最常用的外泌體分離提取方法是超速離心法，也被稱(chēng)為外泌體分離提取的“金標(biāo)準(zhǔn)”[25]。該方法的原理是根據(jù)外泌體的尺寸大小，通過(guò)超速離心將外泌體分離提取的一種分離提取技術(shù)。但是，該方法的局限性在于需要多次進(jìn)行離心處理，這就需要耗費(fèi)大量的時(shí)間，并且需要的樣品量較大。同時(shí)需要注意的是，超速離心可能會(huì)影響到外泌體生物結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致獲得的外泌體含量降低[26]或者生物膜固有特性的改變。不僅如此，該方法還會(huì)使得外泌體發(fā)生聚集或者受到其他細(xì)胞碎片、微粒的干擾和污染[27]。雖然該方法被稱(chēng)為外泌體分離提取的金標(biāo)準(zhǔn)，但就客觀而言，該方法依然是有很大的局限性。有研究表明，分離提取所得的外泌體的含量和純度也與分離提取的過(guò)程方法有著一定的聯(lián)系。表1 總結(jié)了目前分離提取外泌體的方法及各種方法的優(yōu)勢(shì)和局限性[28-33]。

Table 1 Exosome extraction techniques,methods,advantages and disadvantages[28-33]表1 外泌體提取技術(shù)、方法和優(yōu)缺點(diǎn)[28-33]

2.2 載藥方法

在將外泌體作為藥物遞送載體投入到臨床應(yīng)用前，存在的又一個(gè)關(guān)鍵性的難題是如何將藥物準(zhǔn)確有效地載入到外泌體之中。目前，外泌體的載藥方法分為兩大類(lèi)：被動(dòng)載藥和主動(dòng)載藥。

被動(dòng)載藥的方式是將藥物與外泌體或者外泌體的供體細(xì)胞共孵育，進(jìn)而使得藥物進(jìn)入外泌體中，或者是由外泌體供體細(xì)胞分泌裝載藥物的外泌體，被動(dòng)載藥的局限性相對(duì)較大，包封率較低，但載藥方法簡(jiǎn)單。

主動(dòng)載藥的方法包括超聲法、擠出法、反復(fù)凍融法和電穿孔法。其中，超聲法外泌體對(duì)藥物包封率較高，但是該方法可能會(huì)導(dǎo)致外泌體的自身聚集，并且對(duì)外泌體膜表面的蛋白造成影響[34]；擠出法的藥物包封率也同樣較高，但是在載藥的過(guò)程中由于擠壓機(jī)械力的存在，有可能會(huì)對(duì)外泌體的生物結(jié)構(gòu)造成破壞，進(jìn)而對(duì)外泌體的脂質(zhì)雙層膜的固有性質(zhì)產(chǎn)生一定的影響[35]；反復(fù)凍融法的條件相對(duì)溫和，操作較為簡(jiǎn)單，不易對(duì)生物活性物質(zhì)造成破壞，但是，該方法會(huì)導(dǎo)致外泌體對(duì)藥物的包封率較低，并且會(huì)引起外泌體的聚集[36]；電致孔法是指將外泌體置于一定的外電場(chǎng)之中，在外電場(chǎng)的作用下，外泌體表面會(huì)形成若干小孔，這種小孔具有恢復(fù)為完整生物膜的傾向，進(jìn)而將藥物包載于外泌體中。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于其方法參數(shù)具有可控性，這就使得人工干預(yù)更加方便，該方法是目前最具應(yīng)用前景的載藥方法。然而，據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，該方法的缺點(diǎn)是容易引起外泌體自身的聚集，但幸運(yùn)的是該載藥方法中的外泌體自身聚集是可逆轉(zhuǎn)的，可以通過(guò)不斷地進(jìn)行參數(shù)的優(yōu)化和海藻糖脈沖介質(zhì)來(lái)有效地減少這種問(wèn)題的發(fā)生[37]。此外，還出現(xiàn)了一種極其新穎的載藥方法——通過(guò)一種特殊的光學(xué)可逆的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，進(jìn)而將蛋白質(zhì)裝載到外泌體之中。該方法克服了傳統(tǒng)方法的局限性，距離理想的載藥方法又近了一步。表2 介紹了一些外泌體藥物裝載方法和適用藥物類(lèi)型。

Table 2 Exosome drug loading methods and applicable drug types表2 外泌體藥物裝載方法和適用藥物類(lèi)型

3 外泌體在作為藥物遞送系統(tǒng)載體的應(yīng)用進(jìn)展

3.1 外泌體作為藥物遞送載體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

血腦屏障作為控制各種物質(zhì)在外周血液循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system,CNS）之間的通過(guò)的一種動(dòng)態(tài)界面，有效地保護(hù)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)，防止病原體、神經(jīng)毒素血漿成分和血細(xì)胞進(jìn)入到大腦[38-41]。但也正是由于血腦屏障（blood-brain barrier,BBB）的存在，多數(shù)通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)要進(jìn)入腦內(nèi)進(jìn)行治療或者進(jìn)行疾病預(yù)防的藥物會(huì)受到阻礙，以至于對(duì)疾病的治療和預(yù)防產(chǎn)生了極大的阻礙。但外泌體作為一種內(nèi)源型的物質(zhì)可以穿透血腦屏障，進(jìn)入腦內(nèi)，為藥物的腦內(nèi)遞送提供了機(jī)會(huì)。

就目前而言，藥物的腦部遞送載體主要有脂質(zhì)體和膠束。脂質(zhì)體目前被廣泛用于腦部的藥物遞送，并且，其也同樣具有較好的生物相容性[42]，但脂質(zhì)體的穩(wěn)定性較差，同時(shí)，對(duì)其進(jìn)行表面修飾的可用分子較少，使得脂質(zhì)體在腦部的藥物遞送受到了限制[23]；而膠束的結(jié)構(gòu)較為特殊，對(duì)于親水性藥物的腦部遞送，存在著一定的限制。相對(duì)于以上兩種載體，外泌體并不存在上述的限制，為藥物的腦部遞送拓展了一條新的方向。

雖然外泌體作為遞送載體可以跨越血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)藥物或內(nèi)容物到達(dá)大腦，但天然的外泌體靶向性并不強(qiáng)[43]，所以，需要對(duì)其進(jìn)行改造以得到工程外泌體——使用特性的表面分子對(duì)天然外泌體的脂質(zhì)雙分子層進(jìn)行表面修飾或者使天然外泌體裝載特定的內(nèi)容物[44]；經(jīng)此可以大大提升外泌體的靶向性。通常，前者的改造方法應(yīng)用價(jià)值較高，該方法不僅可以有效地包載治療藥物，還可以保留原外泌體的固有特性，應(yīng)用前景極其廣闊。

有研究表明，將過(guò)氧化氫酶裝載到外泌體中，可成功穿透血腦屏障進(jìn)入大腦，進(jìn)而改善帕金森病的疾病狀態(tài)[45]。另外，Alvarez-Erviti 等[46]構(gòu)建了編碼溶酶體相關(guān)膜糖蛋白2b（Lamp2b）的質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell,DC）細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)獲得的外泌體通過(guò)膜上的 Lamp2b與神經(jīng)元特異性狂犬病病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein,RVG）肽融合強(qiáng)烈，經(jīng)此工程改造的細(xì)胞可分泌帶有 RVG 肽的外泌體[47](見(jiàn)圖3[48])。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型中，該外泌體裝載的siRNA 可以有效地被遞送到大腦；并且該 RVG 肽通過(guò)與煙堿乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor,nAChR）相結(jié)合，可以達(dá)到選擇性地靶向到達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞和腦內(nèi)皮細(xì)胞[49]。

Fig.3 Engineering modification of exosomes[48]圖3 外泌體的工程改造[48]

3.1.1 外泌體在 CNS 退行性疾病治療中的應(yīng)用

Izco 等[50]以 RVG 來(lái)源的外泌體為載體，通過(guò)電穿孔的方法，將短發(fā)夾核糖核酸（short hairpin RNA,shRNA）包載進(jìn)外泌體之中，對(duì)帕金森病癥（Parkinson’s disease,PD）的小鼠進(jìn)行給藥。發(fā)現(xiàn) PD 小鼠的大腦中，降低了α-突觸核蛋白的聚集和多巴胺能神經(jīng)元的損傷。Haney等[51]還發(fā)現(xiàn)，將過(guò)氧化氫酶加載到外泌體之中，對(duì) PD 體內(nèi)外模型具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。

3.1.2 外泌體在腦血管疾病治療中的應(yīng)用

Tian 等[52]通過(guò)構(gòu)建短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞小鼠模型，驗(yàn)證了以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為供體細(xì)胞，利用環(huán)(精氨酸-甘氨酸-天門(mén)冬氨酸-D-酪氨酸-賴(lài)氨酸)肽[cyclo(arginine-glycineaspartate-Dtyrosine-lysine)peptide,c(RGDyK)]修飾的外泌體，可以有效包載姜黃素治療大腦缺血，減低缺血性腦損傷區(qū)域的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。

Zhang 等[53]通過(guò)將 c(RGDyK)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體進(jìn)行偶聯(lián)，再將經(jīng)過(guò)膽固醇修飾的 miRNA-210 負(fù)載至該外泌體，發(fā)現(xiàn)該外泌體可以促進(jìn)腦部血管生成。

3.2 外泌體作為藥物遞送載體在心血管疾病中的應(yīng)用

心血管疾病作為全球人類(lèi)健康的第一殺手，有很高的致死率。在體內(nèi)的多種生理過(guò)程和病理過(guò)程均有外泌體的參與，其不僅可以作為心血管疾病診斷的標(biāo)志物[54]，而且還可以作為天然的藥物遞送載體，為心血管疾病提供治療手段。但是僅僅以天然外泌體作為藥物遞送載體具有一定的局限性，限制了治療作用[55]。通過(guò)構(gòu)建滿足某種需求的外泌體可以打破這種局限性，將治療效果最大化?？梢酝ㄟ^(guò)某些特定方式來(lái)完成外泌體遞送載體的構(gòu)建，一般可以分為基因修飾和化學(xué)修飾兩種方法[56]。

基因修飾即對(duì)目標(biāo)外泌體的供體細(xì)胞進(jìn)行基因修飾。對(duì)該供體細(xì)胞進(jìn)行基因修飾使其可以表達(dá)目標(biāo)靶向肽，其產(chǎn)生的外泌體也可以表達(dá)靶向肽[55]。這種方式構(gòu)建的功能化外泌體的穩(wěn)定性得到了較大提高，但耗時(shí)、耗資，技術(shù)要求相對(duì)較高。在這里需要提到的是，機(jī)體內(nèi)可產(chǎn)生外泌體的細(xì)胞有很多種，不同細(xì)胞所產(chǎn)生的外泌體攜帶內(nèi)容物的豐富性存在一定差異。在進(jìn)行基因修飾之前，可通過(guò)所需外泌體的表面標(biāo)志物的區(qū)別，識(shí)別其來(lái)源[56]，并篩選出合適的供體細(xì)胞。

化學(xué)修飾即對(duì)目標(biāo)外泌體直接進(jìn)行表面修飾。一般常用來(lái)修飾的化學(xué)基團(tuán)有疏水配體或脂質(zhì)類(lèi)配體和4-戊酸基團(tuán)。在疏水相互作用下，疏水配體或脂質(zhì)類(lèi)配體可以自發(fā)主動(dòng)地插入到外泌體的脂質(zhì)雙分子層之中，進(jìn)而完成表面修飾[57-58]；4-戊酸基團(tuán)對(duì)外泌體的表面修飾分為兩步，外泌體的氨基和4-戊酸的羧基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)（碳二亞胺偶聯(lián)反應(yīng)），之后通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)（銅催化的疊氮-炔烴 Husigenhuan 加成反應(yīng)）再與靶向肽連接，完成表面修飾[59]。

相較于基因修飾，化學(xué)修飾方法的優(yōu)點(diǎn)在于可在體外完成修飾[56]，技術(shù)操作相對(duì)而言簡(jiǎn)單。相較于傳統(tǒng)的綴和技術(shù)，以上兩種反應(yīng)均可在水溶液中進(jìn)行，并且具有相容性、選擇性和專(zhuān)一性高的優(yōu)勢(shì)[59]。這些優(yōu)勢(shì)為外泌體的化學(xué)修飾和臨床應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。但由于化學(xué)修飾是對(duì)外泌體膜表面進(jìn)行改造，即靶向肽或者其他基團(tuán)與外泌體膜結(jié)合，這可能會(huì)對(duì)外泌體膜的固有特征產(chǎn)生影響[56]。

值得注意的是，在化學(xué)修飾中用到的靶向肽，均需要滿足以下條件：對(duì)整合蛋白αvβ3 具有高度親和力，同時(shí)必須是含有精氨酸—天冬氨酸序列的環(huán)狀多肽，即心肌細(xì)胞特異性靶向肽和心肌缺血靶向肽[55,58,60]。有相關(guān)研究[55]表明，采用靶向肽修飾的外泌體有效地提升了其對(duì)心肌缺血區(qū)域的靶向性，進(jìn)而提高了治療效果。

3.2.1 外泌體在治療心肌梗死疾病中的應(yīng)用

Huang 等[61]以脂肪干細(xì)胞為供體細(xì)胞，使其表達(dá)沉默信息調(diào)節(jié)因子 1 的外泌體。將其給予急性心肌梗死的患者應(yīng)用。發(fā)現(xiàn)該外泌體可以縮小心肌梗死的面積區(qū)域，促進(jìn)血管生成，減輕炎癥的反應(yīng)。有相關(guān)研究進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)，用心肌缺血靶向肽對(duì)外泌體進(jìn)行化學(xué)修飾，并應(yīng)用于心肌梗死的小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)提高顯著[55]。

3.2.2 外泌體在治療心肌缺血疾病中的應(yīng)用

Cui 等[62]已經(jīng)證實(shí)，以脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞為供體細(xì)胞，其表達(dá)出的外泌體對(duì)心肌缺血區(qū)域的細(xì)胞具有保護(hù)作用；并且，其他干細(xì)胞，如多能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等分泌產(chǎn)生的外泌體對(duì)損傷的心肌細(xì)胞還具有一定的修復(fù)作用。另外值得注意的是，心肌細(xì)胞分泌產(chǎn)生的外泌體對(duì)已經(jīng)損傷的心肌細(xì)胞也有一定的修復(fù)作用[63-64]。

Ong 等[65]將缺氧誘導(dǎo)因子 1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）與心臟祖細(xì)胞共同孵育，使細(xì)胞過(guò)度表達(dá) HIF-1，分泌出含有豐富 miR-126 和 miR-210 的外泌體；對(duì)該外泌體進(jìn)行提取純化后，應(yīng)用于心肌缺血的小鼠，發(fā)現(xiàn)該外泌體對(duì)缺血性心肌提供了保護(hù)作用。

4 外泌體作為藥物載體的應(yīng)用

目前，外泌體作為藥物載體的應(yīng)用已經(jīng)有了很多的實(shí)例，無(wú)論是供體細(xì)胞的多樣性，還是遞送物質(zhì)的多樣性，均顯示出了較為成熟的外泌體應(yīng)用技術(shù)。并且，在癌癥、感染性疾病的適應(yīng)癥上有所突破。外泌體作為藥物載體的應(yīng)用見(jiàn)表3。

Table 3 Application of exosomes as drug carriers表3 外泌體作為藥物載體的應(yīng)用

5 挑戰(zhàn)及展望

外泌體作為內(nèi)源性的“納米球”，在各個(gè)方面都顯示出其作為藥物遞送載體的優(yōu)勢(shì)和潛力。無(wú)論是外泌體極低的免疫原性和毒性，亦或是良好的生物相容性、內(nèi)在的靶向性和穩(wěn)定性，都彰顯著外泌體載藥系統(tǒng)的天然優(yōu)勢(shì)和潛力，為各種疾病的治療帶來(lái)了新的曙光。雖然，近些年對(duì)外泌體載藥的研究增多，并且，有很多研究證明了外泌體載藥系統(tǒng)的潛力和可行性，但是就目前而言，現(xiàn)階段對(duì)外泌體的研究還是不夠全面的，我們對(duì)外泌體的了解或許是只是冰山一角，距離外泌體載藥系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)真正的臨床應(yīng)用，我們還需面臨著許多的巨大挑戰(zhàn)。

目前，最大的挑戰(zhàn)之一是外泌體載藥在生物體內(nèi)非特異性的體內(nèi)分布。相關(guān)研究顯示：由某些特定供體細(xì)胞分泌產(chǎn)生的外泌體，即使未經(jīng)表面修飾，相對(duì)于傳統(tǒng)的藥物載體而言，也具有著某些器官的內(nèi)在的特定的靶向性，例如以 M1 極化的巨噬細(xì)胞為供體細(xì)胞，所分泌的外泌體對(duì)腫瘤組織有顯著的內(nèi)在靶向性[77]。

并且，目前，對(duì)外泌體的分離提取也存在難題，缺少一種理想的分離提取技術(shù)可以同時(shí)保證外泌體的含量、結(jié)構(gòu)完整性和純度?，F(xiàn)階段的分離提取技術(shù)也面臨著大規(guī)模量產(chǎn)的技術(shù)難關(guān)。

其次，是載藥方法，增加外泌體的藥物包載量也是限制其應(yīng)用的一點(diǎn)；并且，現(xiàn)階段如何將大核酸加載到外泌體中還是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)[78]。

再者，現(xiàn)階段對(duì)外泌體的非臨床研究和臨床研究存在差異，這種差異也存在于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和人體之間[79]，某些外泌體的靶向性在進(jìn)入人體后是否還有其他的預(yù)期效果，這一點(diǎn)有待深入研究。

最后，對(duì)于外泌體載藥遞送系統(tǒng)，需要權(quán)衡其各個(gè)方面的特征，綜合考慮不同來(lái)源的外泌體在治療中的局限性和優(yōu)勢(shì)，更需要考慮到藥物、外泌體和治療部位的相互作用，調(diào)整策略以確保其具有針對(duì)性[80]。

盡管目前我們對(duì)外泌體藥物遞送系統(tǒng)的研究還停留在初期，但我堅(jiān)信，外泌體藥物遞送系統(tǒng)的臨床應(yīng)用就在不遠(yuǎn)的明天。