基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)分析脹果甘草地上部分的黃酮類化合物

侯冰燕,張 志,劉 穎,賈 棲,云 鷺,王文全,2,3,侯俊玲,2*,彭一峰

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院, 北京 102488; 2.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心, 北京 102488; 3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所, 北京 100193; 4.新疆全安藥業(yè)股份有限公司, 庫爾勒 841011

脹果甘草 (GlycyrrhizainflataBatalin.) 為豆科甘草屬多年生植物,其地上部分有較好的抗前列腺炎作用,發(fā)揮抗炎作用的主要成分為其黃酮類成分。脹果甘草地上部分含有一定量的黃酮,但目前對于其黃酮類化合物的研究較少。本實驗在查閱大量文獻的基礎(chǔ)上,用超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱(UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS) 聯(lián)用技術(shù)分析了脹果甘草地上部分的黃酮類成分,共識別了95個黃酮類化合物,為脹果甘草地上部分的化學(xué)成分研究提供了數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UHPLC-Q-Orbitrap液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng):Ultimate 3000型超高效液相色譜儀(美國Dionex公司);串聯(lián)Thermo Q Exactive Plus型高分辨質(zhì)譜(美國Thermo Fisher Scientific 公司);FA2004N型電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);GTR10-2型高速冷凍離心機(北京時代北利離心機有限公司);KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(北京鑫科奧科技有限公司)。

1.2 試藥

甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純,購自Fisher Scientific公司。

本實驗樣品為脹果甘草植株的地上部分,采自新疆省圖木舒克市6年生栽培脹果甘草,經(jīng)王文全教授鑒定為脹果甘草GlycyrrhizainflataBatalin.。

2 方法

2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 (100 mm×2.1 mm,1.7 μm)。流動相乙腈(A)-5 mL·L-1甲酸水溶液(B),水溶性部位洗脫梯度 (0～20 min,5%～20% A; 20～70 min,20%～30% A) ;脂溶性部位洗脫梯度(0～2 min,10% A; 2～7 min,10%～15% A; 7～24 min,15%～35% A; 24～40 min,35%～60% A; 40～50 min,60%～85% A; 50～55 min,85% A; 55～55.1 min,85%～10% A; 55. 1～60 min,10% A) 。流速為0.2 mL·min-1;柱溫為30 ℃;進樣量為2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

加熱電噴霧離子化源(HESI);鞘氣流量為40 arb,輔助氣體流量為15 arb,毛細管溫度為320 ℃,輔助氣體加熱器溫度為350 ℃,正噴霧電壓為3.2 kV, 負噴霧電壓為3.0 kV。MS的分辨率為70 000,MS/MS的分辨率為17 500,掃描方式為全掃模式,正、負離子模式同時檢測,質(zhì)譜記錄正離子譜掃描范圍為m/z50～750。

2.3 供試品溶液的制備

脹果甘草地上部分工廠醇提取物的制備:脹果甘草地上部分醇提取物由北京同仁堂通州藥廠協(xié)議提取加工,稱取脹果甘草地上部分干燥莖葉135 kg,加10倍量體積分數(shù)為70%的乙醇浸漬1 h,沸騰回流提取90 min,分離提取液和藥渣。將藥渣按照上述步驟重復(fù)提取1次,合并2次的提取液,提取液濃縮回收溶劑,真空干燥,粉碎成粉末,冷藏備用。

脹果甘草醇提取物水溶性部位和脂溶性部位供試品的制備:取上述干燥好的脹果甘草地上部分工廠醇提取物粉末,以料液比為1∶15加入去離子水,在功率為100 W超聲下處理30 min使其溶解,靜置24 h,以4 000 r·min-1離心15 min,將不溶于水的部分再重復(fù)上述操作,得水溶性部位和脂溶性部位,分別收集液體和浸膏,烘干打粉,冷藏備用。制備樣品的甲醇溶液(質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1),過0. 22 μm微孔濾膜,即得。

2.4 質(zhì)譜分析

用Compound discover 3.3軟件及mzCloud和mzVault數(shù)據(jù)庫收集脹果甘草地上部分可能含有的化學(xué)成分信息,再用Thermo Xcalibur 4.1軟件計算出高分辨精確質(zhì)量數(shù),確定各色譜峰對應(yīng)化合物的分子式,通過二級質(zhì)譜的碎片離子推測化合物的結(jié)構(gòu)式,結(jié)合數(shù)據(jù)庫和文獻報道相關(guān)化合物及其對照品的相同或類似成分的碎片離子信息進行對比分析、鑒定推斷。

3 結(jié)果與分析

3.1 脹果甘草地上部分醇提取物水溶性部位黃酮類化合物的鑒定

取脹果甘草地上部分醇提取物水溶性部位供試品溶液,按照2.1和2.2項下色譜、質(zhì)譜條件進行分析,分別得到正、負離子模式下總離子流圖(total ion chromatogram,TIC) 及質(zhì)譜圖,見圖1,共表征52個黃酮類化合物,包含35個黃酮苷、7個二氫黃酮、6個黃酮、3個異黃酮和1個查爾酮。被推斷化合物的保留時間、相對分子質(zhì)量、分子式、一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)及二級質(zhì)譜碎片離子見表1。

表1 脹果甘草地上部分醇提物水溶性部位的黃酮類物質(zhì)質(zhì)譜信息

3.2 脹果甘草地上部分醇提取物脂溶性部位黃酮類化合物的鑒定

取脹果甘草地上部分醇提取物脂溶性部位供試品溶液,按照2.1和2.2項下色譜、質(zhì)譜條件進行分析,分別得到正、負離子模式下TIC及質(zhì)譜圖,見圖2,共表征出83個黃酮類化合物,其中黃酮苷39個、黃酮24個、二氫黃酮9個、異黃酮7個、查爾酮4個。被推斷化合物的保留時間、相對分子質(zhì)量、分子式、一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)及二級質(zhì)譜碎片離子見表2。

表2 脹果甘草地上部分醇提取物脂溶性部位的黃酮類物質(zhì)質(zhì)譜信息

注:A.正離子模式;B.負離子模式。1.表沒食子兒茶素;2.槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷;3.(+)-兒茶素;4.維采寧Ⅱ;5.芹甙元-7-葡萄糖苷;6.牡荊素葡萄糖苷;7.二氫楊梅素;8.異槲皮苷;9.維采寧Ⅲ;12.牡荊素鼠李糖苷;13.蘆丁;14.毛蕊異黃酮葡萄糖苷;16.葒草苷;17.槲皮素;19.圣草酚;21.染料木苷;22.百蕊草素Ⅰ;23.山柰酚-3-O-蕓香糖苷;24.紫云英苷;25.葛根素;26.柚皮苷;28.新地奧斯明;31.丁香亭-3-O-葡糖苷;35.金絲桃苷;36.根皮苷;38.山柰酚;40.芒柄花苷;42.大豆素;43.甘草查爾酮B;44.甘草素;45.毛蕊異黃酮;46.木犀草素;47.蒙花苷;48.美迪紫檀苷;50.千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷;51.甲基槲皮素;52.淫羊藿苷;55.刺甘草查爾酮;56.黃豆黃苷;57.柚皮素;58.金雀異黃酮;59.橙皮素;60.異鼠李素;61.香葉木素;62.異山柰素;63.去甲漢黃芩素;64.棕矢車菊素;65.刺芒柄花素;66.羥基芫花素;67.鳶尾黃酮乙素;68.異澤蘭黃素;69.美迪紫檀素;70.漢黃芩素;71.川皮苷;72.金腰乙素;73.白楊素;74.金合歡素;75.黃芩新素Ⅱ;76.喬松素;77.高良姜素;78.櫻黃素;79.淫羊藿素;80.8-異戊烯基柚皮素;81.龍血素A;82.去甲基川陳皮素;83.梔子黃素B。

3.3 黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)解析

脹果甘草地上部分中的黃酮類化合物主要是以木犀草素和槲皮素為母核的化合物及其衍生物,裂解規(guī)律相似。通過以下鑒定過程可以發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物易產(chǎn)生m/z137、m/z153、m/z301、m/z107、m/z229等碎片,易丟失CO、CO2、H2O、C2H2O等碎片。黃酮母核裂解產(chǎn)生黃酮典型碎片m/z151、m/z137;查爾酮母核裂解產(chǎn)生m/z147、m/z119特征碎片離子;含有甲氧基的黃酮化合物會發(fā)生CH3的丟失,如異鼠李素、刺芒柄花素、異澤蘭黃素等。

3.3.1黃酮苷類化合物的解析 表2中化合物4的保留時間為7.33 min,準分子離子峰為m/z595.162 1[M-H]-,分子式為C27H30O15,特征碎片離子m/z473[M-H-C4H8O4]-丟失1個葡萄糖、m/z353[M-H-2C4H8O4]-丟失2個葡萄糖基、m/z297[M-H-2C4H8O4-2CO]-,為黃酮苷類化合物,結(jié)合文獻報道相關(guān)黃酮苷類裂解規(guī)律[21]鑒定為維采寧Ⅱ,即新西蘭牡荊苷,同表1化合物10,是來自廣金錢草的地上部分。表2中化合物15的保留時間為10.33 min,準分子離子峰為m/z433.110 4 [M+H]+,分子式為C21H20O10,特征碎片離子有m/z271 [M+H-C6H10O5]+、m/z243 [M+H-C6H10O5-CO]+,結(jié)合文獻,鑒定為異牡荊素,同表1中化合物28,裂解途徑見圖3。表2中化合物16的保留時間為10.34 min,分子離子基峰為m/z449.105 3 [M+H]+,分子式為C21H20O11,m/z287 [M+H-C6H5O5]+是其脫去吡喃糖基產(chǎn)生的碎片,m/z135 [M+H-C6H5O5-C7H4O4]+是其通過逆狄爾斯-阿爾德反應(yīng)(retro Diels-Alder reaction,RDA)裂解產(chǎn)生的碎片,結(jié)合文獻的碎片信息推測其為葒草苷。

圖3 異牡荊素可能的碎片裂解途徑

3.3.2黃酮類化合物的解析 表2中化合物46的保留時間為16.64 min,準分子離子峰為m/z285.038 6 [M-H]-,分子式為C15H10O6,m/z151[M-H-C6H5O5-C8H6O2]-、133[M-H-C7H4O4]-碎片是其母核發(fā)生RDA裂解而產(chǎn)生的,結(jié)合文獻報道中的黃酮裂解規(guī)律[22],鑒定為木犀草素,同表1中的化合物35。表2中化合物66的保留時間為24.89 min,準分子離子峰為m/z299.054 1 [M+H]+,分子式為C16H12O6,特征碎片離子有m/z284[M+H-CH3]+,m/z256[M+H-CH3-CO]+、m/z227[M+H-CH3-CO-CHO]+、m/z153[M+H-CH3-C8H6O2]+,結(jié)合文獻鑒定其為羥基芫花素,裂解途徑見圖4。表2中化合物60的保留時間為20.76 min,準分子離子峰為m/z315.049 1 [M-H]-,分子式為C16H12O7,裂解過程為m/z300[M-H-CH3]-、m/z271 [M-H-CH3-CHO]-、m/z243[M-H-CH3-CHO-CO]-、m/z151 [M-H-CH3-CHO-C7H5O2]-、m/z107[M-H-CH3-CHO-C7H5O2-CO2]-,丟失1個甲基碎片,可能含有甲氧基取代,結(jié)合文獻報道鑒定其為異鼠李素,同表1中的化合物43,但正負離子模式不同,產(chǎn)生的碎片離子不同。

圖4 羥基芫花素可能的碎片裂解途徑

3.3.3二氫黃酮類化合物的解析 表2中化合物19的保留時間為10.63 min,準分子離子峰為m/z289.068 8 [M+H]+,分子式為C15H12O6,結(jié)合文獻及其碎片信息m/z271[M+H-H2O]+、m/z153 [M+H-C8H8O2]+,鑒定其為圣草酚,同表1中的化合物22,裂解途徑見圖5。

圖5 圣草酚可能的碎片裂解途徑

3.3.4異黃酮類化合物的解析 表2中化合物42的保留時間為15.38 min,準分子離子峰為m/z255.063 5 [M+H]+,分子式為C15H10O4,結(jié)合文獻報道中的異黃酮裂解規(guī)律[22-23]及其碎片信息m/z227 [M+H-CO]+、m/z199 [M+H-2CO]+,m/z137[M+H-C8H5O]+,鑒定其為大豆素,同表1中的化合物51,裂解途徑見圖6。

圖6 大豆素可能的碎片裂解途徑

3.3.5查爾酮類化合物的解析 表1中化合物50的保留時間為61.87 min,準分子離子峰為m/z256.073 4 [M+H]+,分子式為C15H12O4,結(jié)合文獻及其碎片信息m/z119 [M+H-C7H5O3]+、m/z137[M+H-C8H7O]+、m/z147[M+H-C6H5O2]+,鑒定其為異甘草素,同表2中的化合物54,裂解途徑見圖7。

圖7 異甘草素可能的碎片裂解途徑

4 討論

甘草為豆科植物甘草G.uralensisFish.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖。甘草除可作為大宗藥材入藥外,在食品、飲料、卷煙、化妝品等工業(yè)中均有應(yīng)用,其需求量也在世界各國不斷上升,但甘草地上部分目前只在畜牧業(yè)及水土保持方面有應(yīng)用,未得到合理地開發(fā),人工栽培甘草經(jīng)濟效益較低。許多研究表明,甘草地上部分含有黃酮,最高可達94 mg·g-1[24],高于其地下部分的黃酮含量,而黃酮類化合物具有抗炎、抗癌、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理活性[25],可將甘草地上部分進行藥理活性和化學(xué)成分研究,將其開發(fā)為具有藥用價值的新藥,為甘草地上部分資源的合理利用提供新思路。

本文用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)結(jié)合分子離子峰、二級碎片、數(shù)據(jù)庫匹配和查閱相關(guān)文獻,表征出了脹果甘草地上部分中的黃酮類化合物,建立了分別適用于脹果甘草地上部分水溶性部位和脂溶性部位的色譜條件,得到了較好的超高效液相分離效果。共鑒定出95個黃酮,水溶性部分共鑒定出52個黃酮,脂溶性部分共鑒定出83個黃酮,水溶性部分和脂溶性部分共有黃酮37個,主要為黃酮苷、二氫黃酮。其中水溶性部分主要為黃酮苷,負離子模式下21個,正離子模式下31個。脂溶性部分主要為黃酮苷元,負離子模式下33個,正離子模式下50個,表明黃酮苷元在正、負離子模式下均有高靈敏度響應(yīng),但正離子模式較負離子模式響應(yīng)稍好,從裂解碎片和方式來看,正、負離子模式下的黃酮糖苷裂解差異較大[26]。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合文獻報道化合物斷裂規(guī)律研究方法,能夠快速實現(xiàn)對化合物的初步定性,對復(fù)雜體系中微量化合物的快速定性具有重大意義。但該方法只能進行大概的結(jié)構(gòu)推斷,不能對具體的取代位點或物質(zhì)的同分異構(gòu)體等做出詳細描述,準確的結(jié)構(gòu)鑒定還需要對目標化合物進行分離和純化后通過核磁等技術(shù)進行準確的結(jié)構(gòu)解析。

脹果甘草地上部分目前研究較少,本文用液質(zhì)技術(shù)首次將脹果甘草地上部分黃酮類化合物進行了較為全面地分析鑒定,其中甘草素、甘草苷、異甘草苷、異甘草素、刺芒柄花素、甘草查爾酮B、8-異戊烯基柚皮素是已報道的脹果甘草中含有的黃酮。脹果甘草地上部分的黃酮含量高于地下部分,且黃酮類物質(zhì)相差較大,但也有相同成分,如維采寧Ⅱ、蘆丁、槲皮素、喬松素等。甘草查爾酮A可以用于快速鑒定脹果甘草,本實驗鑒定結(jié)果未見甘草查爾酮A,因為甘草查爾酮A主要存在于根莖中[27],而本文所用的材料主要為脹果甘草葉。3種基原甘草地上部分均含有一定量的黃酮,光果甘草黃酮含量較高,烏拉爾甘草黃酮含量較低,脹果甘草黃酮含量在二者之間[28]。脹果甘草地上部分與烏拉爾甘草地上部分有較多相同的黃酮,二氫楊梅素、橙皮素、牡荊素葡萄糖苷、根皮苷是脹果甘草地上部分獨有的黃酮成分,而烏拉爾甘草地上部分帶有異戊烯基側(cè)鏈的黃酮較多[15]。

脹果甘草地上部分醇提取物經(jīng)過水沉離心工藝后,分為物理狀態(tài)迥異的兩部分,一部分為溶于水的液體狀,另一部分為不溶于水的固體狀。從成分分析結(jié)果來看,水溶性部分幾乎全為黃酮苷類化合物,而脂溶性部分的黃酮苷類物質(zhì)的相對峰高較低、含量較少,主要為黃酮苷元類化合物。水溶性部分中紫云英苷、山柰酚、槲皮素、異牡荊素等含量較高,脂溶性部分中喬松素、高良姜素、8-異戊烯基柚皮素等含量較高,這些黃酮類物質(zhì)均被證實具有廣泛的藥理作用。黃酮苷元較黃酮苷的藥效作用更廣泛,可通過優(yōu)化水沉離心工藝,如增加水沉離心次數(shù)、水的比例等將脹果甘草地上部分醇提取物分為主要含有黃酮苷和主要含有黃酮苷元的部位,分別將其開發(fā)為具有不同藥效、不同劑型的總黃酮提取物類新藥。