高黎貢山不同海拔棕色綠僵菌對(duì)溫度的適應(yīng)性

徐 玲 張翼飛 陳 凱

（1.保山學(xué)院高黎貢山研究院；2.云南省教育廳高黎貢山蟲(chóng)生真菌資源保護(hù)與綠色發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南保山 678000)

綠僵菌（MetarhiziumSorokin）是一種具有廣譜殺蟲(chóng)能力的蟲(chóng)生真菌，被認(rèn)為是最具開(kāi)發(fā)潛力的真菌殺蟲(chóng)劑之一，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。綠僵菌在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中常受環(huán)境因素的制約而導(dǎo)致其殺蟲(chóng)效果大大降低，環(huán)境條件對(duì)綠僵菌的生長(zhǎng)具有較大影響，綠僵菌不同菌株要求的環(huán)境條件不同[1]。自然界中不同地理生境的環(huán)境條件不同，也使綠僵菌種群和數(shù)量存在很大差異[2，3]。環(huán)境溫度是影響綠僵菌生長(zhǎng)和地理分布的重要的因素之一[4]，也是利用綠僵菌防治害蟲(chóng)必須考慮的條件之一。

高黎貢山是世界生物圈保護(hù)區(qū)，也是我國(guó)生物多樣性保護(hù)的關(guān)鍵地區(qū)之一，其地理環(huán)境復(fù)雜多樣，生態(tài)因子垂直差異較大[5]。棕色綠僵菌（M.brunneum）是高黎貢山綠僵菌的優(yōu)勢(shì)物種，不同海拔地區(qū)都有分布[6]。本研究擬探討高黎貢山不同海拔的棕色綠僵菌菌株在不同培養(yǎng)溫度下的菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢能力差異，為探明綠僵菌受生境條件的影響奠定基礎(chǔ)，為高黎貢山綠僵菌菌株的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：來(lái)自高黎貢山25 個(gè)海拔地區(qū)（170～3 100 m）的棕色綠僵菌菌株（表1），保存于保山學(xué)院高黎貢山研究所真菌資源實(shí)驗(yàn)室。

表1 綠僵菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢能力與海拔梯度的相關(guān)性

1.2 菌株活化

將保存的各菌株分別接種到PPDA 平板培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)3 d，恢復(fù)菌種的正常生物學(xué)活性。

1.3 培養(yǎng)溫度對(duì)不同海拔地區(qū)菌株生長(zhǎng)的影響

各菌株分別用打孔器取直徑5 mm的菌塊，接入到新的PPDA平板培養(yǎng)基中央，分別置于7種不同梯度溫度（5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃）下培養(yǎng)，每次處理進(jìn)行3次重復(fù)。培養(yǎng)15 d后用十字交叉法測(cè)定各菌株不同處理的菌落直徑（mm）。培養(yǎng)20 d各菌株產(chǎn)孢充分后，刮取每個(gè)平板培養(yǎng)基上菌落表面的所有孢子粉，用電子天平稱取其重量（mg），各菌株不同處理的孢子粉產(chǎn)量（產(chǎn)粉量）為三次重復(fù)的平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

將不同海拔梯度的菌株分為低（海拔170～900 m 的8 個(gè)菌株）、中（海拔1 000～1 900 m 的9 個(gè)菌株）、高（海拔2 000～3 100 m的8個(gè)菌株）三組。

用SPASS Statistics 22.0軟件對(duì)各菌株的菌落直徑和產(chǎn)粉量與其生境海拔梯度進(jìn)行相關(guān)性分析，對(duì)低、中、高三組海拔菌株的菌落直徑和產(chǎn)粉量進(jìn)行單因素差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高黎貢山棕色綠僵菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的適宜溫度

棕色綠僵菌各菌株在不同溫度（5～35℃）下培養(yǎng)15 d后測(cè)定菌落直徑（圖1）。25～30℃培養(yǎng)時(shí)，大多數(shù)菌株的菌落直徑為最大，說(shuō)明此溫度下菌絲生長(zhǎng)較快，是棕色綠僵菌的最適生長(zhǎng)溫度。在15～35℃培養(yǎng)后菌落直徑都有不同程度的增大，說(shuō)明此溫度范圍為棕色綠僵菌菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度，但當(dāng)溫度降低到20℃和15℃時(shí)或上升到35℃時(shí)各菌株的菌絲生長(zhǎng)速度都明顯降低。當(dāng)溫度降低至5℃和10℃后，培養(yǎng)15 d后菌落直徑無(wú)明顯變化，說(shuō)明溫度過(guò)低不利于棕色綠僵菌的菌絲生長(zhǎng)。

圖1 棕色綠僵菌菌株BUM-500在不同溫度下培養(yǎng)形成的菌落

棕色綠僵菌各菌株在不同溫度（5～35℃）下培養(yǎng)20 d后測(cè)定每個(gè)平板所產(chǎn)孢子粉質(zhì)量。所有菌株均表現(xiàn)為在25℃培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)粉量最大，30℃和20℃次之，15℃較差，溫度過(guò)低（5℃和10℃）和過(guò)高（35℃）都很少產(chǎn)孢或不產(chǎn)孢?？梢钥闯觯厣G僵菌產(chǎn)孢的適宜溫度范圍為15～30℃，最適溫度為25℃。

2.2 高黎貢山綠僵菌菌株的菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢能力與生境海拔的相關(guān)性

對(duì)不同培養(yǎng)溫度（15～35℃）下棕色綠僵菌菌株的菌落直徑和產(chǎn)粉量與海拔梯度進(jìn)行相關(guān)性分析（表1），發(fā)現(xiàn)在≤25℃的溫度下培養(yǎng)時(shí)各菌株的菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢能力與其生境海拔都沒(méi)有相關(guān)性，而培養(yǎng)溫度上升至30℃和35℃時(shí)，菌株的菌絲生長(zhǎng)與生境海拔的相關(guān)關(guān)系為極顯著（P＜0.01），溫度為30℃時(shí)，各菌株的產(chǎn)孢能力與生境海拔也有顯著相關(guān)性（P＜0.05）。

2.3 不同海拔綠僵菌菌株的菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)粉量差異性

對(duì)低、中、高三組海拔梯度下各綠僵菌菌株在不同溫度下培養(yǎng)后菌落直徑（15～35℃）與產(chǎn)粉量（15～30℃）的差異顯著性進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示（表2），在15～25℃培養(yǎng)時(shí)，低、中、高海拔梯度三組菌株的菌落直徑和產(chǎn)粉量差異都不顯著（P＞0.05）；在較高溫度（30℃和35℃）培養(yǎng)時(shí)，三組菌株的菌落直徑差異都為極顯著（P＜0.01）；在30℃培養(yǎng)時(shí)，三組海拔菌株的產(chǎn)粉量差異為顯著（P＜0.05）。

2.4 不同培養(yǎng)溫度下不同海拔綠僵菌菌株的菌絲生長(zhǎng)情況

不同海拔菌株在不同溫度下培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)速度不同（表3）。從三組菌株菌落直徑的平均值來(lái)看，在15℃、20℃和25℃培養(yǎng)時(shí)，低、中、高三組海拔菌株的菌落直徑平均值較接近，結(jié)合以上相關(guān)性和方差分析結(jié)果可以看出，在此溫度范圍內(nèi)海拔梯度對(duì)綠僵菌菌絲生長(zhǎng)的影響較小。在30℃培養(yǎng)時(shí)，三組海拔菌株菌落直徑差異顯著，低海拔菌株最高（64.3 mg），中海拔菌株（55.4 mg）其次，高海拔菌株最低（38.8 mg）。在35℃培養(yǎng)時(shí)，低海拔菌株（18.0 mg）與中海拔菌株（17.8 mg）的菌落直徑均值顯著高于高海拔菌株（8.9 mg）。

表3 不同溫度培養(yǎng)后不同海拔來(lái)源菌株的菌落直徑/mm

低、中、高三組海拔菌株的最適生長(zhǎng)溫度也存在明顯差異（表4）。低中海拔（170～1 900 m）的多數(shù)菌株在30℃培養(yǎng)時(shí)菌落直徑達(dá)到最大，有12 個(gè)菌株（BUM-170、BUM-300、BUM-400、BUM-500、BUM-600、BUM-700、BUM-900、BUM-1000、BUM-1100、BUM-1200、BUM-1400、BUM-1800）的菌落直徑超過(guò)了60 mm，其中菌株BUM-300 和BUM-400 的菌落直徑超過(guò)了70 mm。高海拔（2 000～3 100 m）的多數(shù)菌株在25℃下培養(yǎng)菌落直徑達(dá)到最大，但都小于60 mm?？梢钥闯觯械秃０味鄶?shù)菌株的最適生長(zhǎng)溫度為30℃，而高海拔多數(shù)菌株的最適生長(zhǎng)溫度為25℃。但也有少數(shù)菌株并不遵循此規(guī)律，如中海拔菌株BUM-1500、BUM-1900的最適生長(zhǎng)溫度為25℃（菌落直徑分別為51.7 mm 和53.0 mm）；高海拔菌株BUM-2400 和BUM-2500 的最適生長(zhǎng)溫度為30℃（菌落直徑分別達(dá)50.6 mm和52.5 mm）。

表4 不同溫度培養(yǎng)后不同海拔來(lái)源菌株的產(chǎn)粉量/mg.板

2.5 不同培養(yǎng)溫度下不同海拔地區(qū)綠僵菌菌株的產(chǎn)孢能力

不同溫度培養(yǎng)下不同海拔菌株的孢子粉產(chǎn)生能力不同（表4）。在15℃和20℃培養(yǎng)時(shí)，各菌株的產(chǎn)孢能力都較低，15℃時(shí)的產(chǎn)粉量范圍為3.6～13.7 mg/板，20℃時(shí)的產(chǎn)粉量范圍為17.6～44.7 mg/板；三組海拔梯度菌株的平均產(chǎn)粉量也較接近（15℃時(shí)分別為6.4 mg/板、6.8 mg/板、7.9 mg/板，20℃時(shí)分別為25.5 mg/板、24.9 mg/板、22.6 mg/板）。

在25℃培養(yǎng)時(shí)，不同菌株的孢子粉產(chǎn)生能力差異較大，范圍為31.0～217.4 mg/板。三組海拔菌株都存在產(chǎn)粉量很高和很低的菌株，低海拔菌株中產(chǎn)粉量最高的菌株超過(guò)200 mg/板，但也有2個(gè)菌株產(chǎn)粉量不到40 mg/板；中海拔和高海拔也都有產(chǎn)粉量高于100 mg/板和低于40 mg/板的菌株。根據(jù)前面相關(guān)性和差異性分析結(jié)果來(lái)看，組間的差異并不顯著，海拔與菌株產(chǎn)粉量的相關(guān)性也不顯著，但從三組菌株的平均產(chǎn)粉量來(lái)看，低海拔菌株最高（113.5 mg/板），其次為中海拔菌株（81.1 mg/板），高海拔菌株最低（68.4 mg/板）；低海拔中也存在較多產(chǎn)粉量較大的菌株，低海拔的8株菌中有4 株菌（BUM-170、BUM-500、BUM-600、BUM-800）的產(chǎn)粉量高于100 mg/板，中海拔的9 株菌中有2 株菌（BUM-1600、BUM-1700）的產(chǎn)粉量高于100 mg/板，高海拔的8 株菌中有1 株菌（BUM-2300）的產(chǎn)粉量高于100 mg/板。

在30℃培養(yǎng)時(shí)，三組海拔菌株的產(chǎn)粉量差異為顯著，范圍為6.2～114.5 mg/板，從平均產(chǎn)粉量來(lái)看，低海拔菌株（47.0 mg/板）顯著高于中高海拔菌株，中海拔菌株的產(chǎn)粉量（19.0 mg/板）略高于高海拔菌株（14.3 mg/板）；同組菌株的產(chǎn)粉量差異也很大，尤其是低海拔菌株，有的產(chǎn)粉量超過(guò)100 mg/板，有的不到15 mg/板，中高海拔菌株間的差異相對(duì)較小，產(chǎn)粉量都不到40 mg/板。低海拔有3 株菌（BUM-500、BUM-600、BUM-800）的產(chǎn)粉量高于60 mg/板，而中高海拔菌株的產(chǎn)粉量都低于40 mg/板。

3 討論

3.1 高黎貢山棕色綠僵菌的生長(zhǎng)溫度

綠僵菌在適宜的溫度下生長(zhǎng)速度較快，致病力較強(qiáng)[7]。林華峰等[8]對(duì)綠僵菌大孢變種的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，認(rèn)為其最適生長(zhǎng)溫度為25℃。姚君明等[9]研究認(rèn)為，綠僵菌菌株LA06 和LD04的最適生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的溫度都為25～30℃。張亞波等[10]對(duì)綠僵菌菌株WP08 的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，認(rèn)為其菌絲生長(zhǎng)最適溫度為25～30℃，產(chǎn)孢最適溫為25℃。張麗萍等[11]對(duì)一株金龜子綠僵菌的固體發(fā)酵條件進(jìn)行研究，認(rèn)為其最佳發(fā)酵溫度為26℃，溫度升高為30℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)較快，但產(chǎn)粉量較少。本研究中，棕色綠僵菌菌絲最適生長(zhǎng)溫度范圍為15～35℃，菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為25～30℃；產(chǎn)孢溫度范圍為15～30℃，低于15℃和高于30℃產(chǎn)粉量都極少，產(chǎn)孢最適溫度都為25℃。這與大多數(shù)關(guān)于綠僵菌生長(zhǎng)溫度的文獻(xiàn)報(bào)告一致。但高黎貢山不同海拔菌株的菌絲生長(zhǎng)最適溫度有差異，低中海拔多數(shù)菌株的最適溫為30℃，高海拔多數(shù)菌株的最適溫為25℃。

3.2 高黎貢山不同海拔地區(qū)棕色綠僵菌對(duì)溫度的適應(yīng)性

不同地理來(lái)源蟲(chóng)生真菌的遺傳多樣性與地理距離的相關(guān)性目前尚沒(méi)有一致的定論[3，12]，但已有不少研究表明，不同地理來(lái)源蟲(chóng)生真菌在生物學(xué)特性、寄主轉(zhuǎn)化性、化學(xué)成分等方面都存在較大差異[13-15]。本課題組前期研究[16]結(jié)果表明，環(huán)境溫度是影響高黎貢山綠僵菌分布的主導(dǎo)因子。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，高黎貢山不同海拔地區(qū)分布的棕色綠僵菌菌株對(duì)溫度的適應(yīng)能力不同。

在較低溫度（15～25℃）培養(yǎng)時(shí)，菌落直徑和產(chǎn)粉量都與海拔無(wú)相關(guān)性，低、中、高海拔梯度三組菌株的菌落直徑和產(chǎn)粉量差異也不顯著，說(shuō)明在較低溫度下生境海拔對(duì)綠僵菌的生長(zhǎng)影響不大，只有在較高溫度下（30～35℃）培養(yǎng)才呈現(xiàn)出一定影響。在30℃和35℃培養(yǎng)時(shí)，三組海拔菌株的菌落直徑差異極顯著，海拔較低的菌株在高溫條件下菌絲生長(zhǎng)速度較快；在30℃培養(yǎng)時(shí)，三組海拔菌株的產(chǎn)孢能力差異顯著，低海拔菌株的產(chǎn)孢能力顯著高于中高海拔菌株，低海拔也存在較多產(chǎn)粉量較大的菌株，可以看出低海拔菌株更耐受高溫。

綜合不同海拔菌株的菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢情況可以看出，生境海拔較低的菌株對(duì)高溫的適應(yīng)能力更強(qiáng)，這應(yīng)該與低海拔地區(qū)環(huán)境溫度較高有關(guān)，綠僵菌在長(zhǎng)期適應(yīng)較高溫度的環(huán)境過(guò)程中，產(chǎn)生較多適應(yīng)高溫條件的菌株，這也說(shuō)明了不同海拔的環(huán)境溫度對(duì)綠僵菌株的環(huán)境適應(yīng)性發(fā)揮著重要作用。秦長(zhǎng)生等[17]研究了不同來(lái)源金龜子綠僵菌菌株的生物學(xué)特性，認(rèn)為不同菌株的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)粉量受溫度的影響差異極顯著。農(nóng)向群等[18]對(duì)不同地理來(lái)源白僵菌和綠僵菌對(duì)高溫的耐受力的研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自溫度較低的高緯度地區(qū)的菌株對(duì)高溫最敏感，來(lái)自溫度較高的非洲地區(qū)的菌株對(duì)高溫的抵抗力最強(qiáng)。這與本研究結(jié)果中不同海拔地區(qū)綠僵菌生長(zhǎng)受溫度的影響趨勢(shì)一致。

低海拔菌株中，BUM-300 和BUM-400 在30℃培養(yǎng)時(shí)菌落直徑達(dá)到最大（70 mm），但這兩個(gè)菌株的產(chǎn)粉量并不高；BUM-600 和BUM-800 雖然菌落直徑未能達(dá)到最大，但其菌絲生長(zhǎng)速度也較快（30℃時(shí)分別為66.7 mm 和59.5 mm），其產(chǎn)孢能力最高，在25℃時(shí)產(chǎn)粉量分別為204.4 mg/板和217.4 mg/板，30℃時(shí)產(chǎn)粉量分別為96.5 mg/板和114.5 mg/板。綠僵菌對(duì)高溫的耐受能力是影響其侵染寄主的一個(gè)重要因素[7]。在進(jìn)行生防菌開(kāi)發(fā)時(shí)，選用BUM-600和BUM-800這兩個(gè)菌株進(jìn)行菌劑生產(chǎn)將會(huì)產(chǎn)生較好的應(yīng)用效果。