三種植物精油和純露在沐浴露和洗手液中的抑菌抗氧化性能研究

王 瑩 王新炎 許鈺爽 楊立偉 劉晨曦 賈 陸 劉 偉 薛 剛 *

1.南陽理工學院河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，河南南陽，473000；2.河南華牧生物科技有限公司，河南南陽，473300；3.河南京科國草藥業(yè)有限公司，河南南陽，473043；4.鄭州大學藥學院，河南鄭州，450002

隨著人們消毒防護和衛(wèi)生安全意識的不斷增強，具有抑菌/抗菌功效的特種洗手液和沐浴露備受消費者歡迎[1-5]。目前市售抑菌洗手液和沐浴露產(chǎn)品主要是添加三氯生、三氯卡班等化學合成抑菌劑，這些成分不僅對人體有毒副作用，還有潛在的致癌作用。傳統(tǒng)的化學抑菌劑已經(jīng)不能滿足消費者對于安全的追求[6-9]。天然抑菌成分因其毒性低和價格低廉的優(yōu)勢，已從傳統(tǒng)的食品添加劑推廣應用到日化產(chǎn)品行業(yè)。添加中草藥等天然提取物的洗手液及沐浴露，不僅溫和不刺激，而且安全可靠，符合人類倡導的天然健康理念。

牛至精油具有較強的抗菌和抗氧化活性。有研究[10]表明牛至精油對DPPH自由基和ABTS自由基均有較強的清除能力，且清除能力都優(yōu)于化學合成的抗氧化劑BHT。牛至精油具有抗菌、殺菌、抗球蟲和增強機體特異性免疫的功效已有文獻報道[11-12]。迷迭香精油具有很好的抑菌效果[13]和較強的自由基清除能力[14]。目前迷迭香精油已被廣泛應用于食品、農(nóng)產(chǎn)品、醫(yī)藥和化妝品等多個領域[15]。艾草精油具有抗菌、抗病毒和抗氧化作用[16]。而作為天然的抑菌抗氧化劑，牛至、迷迭香、艾葉揮發(fā)油本身就有獨特的色澤和香味，因此相關產(chǎn)品中無需再加色素和香精，可以使產(chǎn)品更安全簡便，節(jié)約成本[17]。純露是在蒸餾萃取精油的過程中水蒸氣冷凝下來的副產(chǎn)品，含有少量精油成分及活性物質(zhì)，同樣具有良好的抗菌、驅(qū)蟲、保健作用[18]。

本文以牛至、迷迭香、艾草精油和純露為抑菌成分，制備綠色沐浴露和洗手液，并與添加傳統(tǒng)抑菌抗氧化劑三氯生、醋酸氯己定和尼鉑金乙酯的化學沐浴露和洗手液[19]進行抑菌和抗氧化性能的比較，為企業(yè)生產(chǎn)以牛至、迷迭香和艾草精油和純露為原料，制備添加天然抗氧化劑的綠色洗手液和沐浴露提供參考依據(jù)，為降低日化產(chǎn)品中化學抑菌抗氧化劑的毒性、致癌等危害，發(fā)揮天然抑菌抗氧化劑高效抑菌、抗氧化性和低毒性等優(yōu)勢提供支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

本實驗所用牛至精油和純露由河南華牧生物科技有限公司提供，迷迭香精油、迷迭香純露、艾草精油、艾草純露由河南京科國草藥業(yè)有限公司提供。異Vc鈉、維生素E、丁基羥基茴香醚（BHA）、2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）、叔丁基對苯二酚（TBHQ）、三氯生、醋酸氯己定、尼鉑金乙酯及所用主要試劑三氯乙酸、磷酸氫二鈉、過氧化氫、鐵氰化鉀、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸等均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

主要儀器包括：752N紫外可見分光光度計（上海精科實業(yè)有限公司），TGL-16C高速離心機（上海安亭科學儀器廠），BSA224S-CW電子天平（Sartorius中國有限公司），NDJ-5S數(shù)字式黏度計（上海舜宇恒平科學儀器有限公司），LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 洗手液的制備

稱取一定量的片堿置于一定量的純凈水中，加熱攪拌溶解2～5 min至透明后，加入HVS攪拌溶解5 min至透明。緩慢加入脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉（AES），邊加邊升溫，30 min升溫到70 ℃。加入α-烯基磺酸鈉（AOS）、磺酸、三甲基甘氨酸及一定量的抑菌抗氧化劑，攪拌，加入1,3-丁二醇、CAB-35和Co-40，調(diào)和，加入1,3-二羥甲基-5,5二甲基海因（DMDMH）及食鹽，攪拌均勻，制得洗手液產(chǎn)品。

1.2.2 沐浴露的制備

稱取一定量的片堿置于一定量的純凈水中，加熱攪拌溶解2～5 min至透明后，加入HVS攪拌溶解5 min至透明。緩慢加入AES，邊加邊升溫，30 min升溫到70 ℃。加入AOS、磺酸、三甲基甘氨酸及一定量的抑菌抗氧化劑，攪拌，加入羥丙基三甲基氯化銨、CAB-35和Co-40，調(diào)和，加入DMDMH及食鹽，攪拌均勻，制得沐浴露。

1.2.3 原料及產(chǎn)品的抗氧化活性測定

采用DPPH法測定原料及產(chǎn)品對DPPH·自由基的清除能力[20]，計算其清除率及IC50。

采用普魯士藍法測定原料及產(chǎn)品的還原力[21]，用BHT做對照，用BHT當量即每克樣品中含有相當BHT的毫克數(shù)來表示樣品還原力（mg/g）。

采用水楊酸法測定原料及產(chǎn)品對羥自由基的清除能力，計算其清除率[22]。

1.2.4 產(chǎn)品抑菌試驗

（1）濾紙片法抑菌試驗：采用混合接菌法移取不同濃度的菌懸液于培養(yǎng)皿中，倒入培養(yǎng)基凝固后，將滅菌、浸有待測樣液的濾紙片貼在培養(yǎng)基表面，濾紙間距離適中，同時用無菌水進行空白對照實驗，每組3次重復，測定其抑菌圈直徑，判斷產(chǎn)品對于供試菌種的抑制程度[23-24]。抑菌圈直徑的判斷標準：抑菌圈直徑（包含濾紙片直徑5 mm）大于15 mm為高度敏感，10～15 mm為中度敏感，7～9 mm為不敏感，抑菌圈小于7 mm或無抑菌圈表示無抑菌作用。

（2）產(chǎn)品抑菌率試驗：采用懸液定量實驗法[25]，參照GB 15979—2002[26]中的懸液法檢驗產(chǎn)品抑菌率。將各個菌種培養(yǎng)液用無菌水稀釋成10-5的菌懸液，將無菌水稀釋成體積分數(shù)為50%的洗手液和沐浴露樣液2.0 ml和一定濃度的菌懸液2.0 ml置于滅菌后的離心管中，充分搖勻，使其充分作用1 min，將該反應液以混合接菌法接種至相應的培養(yǎng)皿中，恒溫培養(yǎng)。對照組用蒸餾水代替，培養(yǎng)一定時間后采用平板菌落計數(shù)法統(tǒng)計菌落數(shù)，按公式1計算抑菌率。

公式中：X為抑菌率（%）；A為空白組菌落數(shù)；B為實驗組菌落數(shù)。

評價標準：抑菌率≥90%，產(chǎn)品有抑菌作用[21]。

（3）現(xiàn)場手消毒試驗：參照GB 15979—2002[26]及文獻[27]，選擇志愿者進行現(xiàn)場消毒試驗。將手的四指在冷卻凝固的培養(yǎng)皿中按壓一下，立刻蓋上培養(yǎng)皿，即為對照樣品。使用制作的沐浴露或洗手液產(chǎn)品將手指洗干凈，待自然晾干后迅速在培養(yǎng)皿上按壓四指，立刻蓋上培養(yǎng)皿，即為被試樣品。置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，記錄對照樣品和被試樣品中的菌落數(shù)量，按照公式2計算抑菌率。

公式中：X為抑菌率（%）；A為對照樣品平均菌落數(shù)；B為被試樣品平均菌落數(shù)。

評價標準：抑菌率≥90%，產(chǎn)品有抑菌作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 濾紙片法測定抑菌性能

將所得沐浴露和洗手液產(chǎn)品進行適當稀釋后，浸泡濾紙片，并貼于采用混合接菌法移取不同濃度菌懸液的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)后測定其抑菌圈直徑，結(jié)果見表1。測定添加化學抑菌劑的沐浴露和洗手液產(chǎn)品的抑菌圈大小見表2。

表1 添加精油或純露的沐浴露和洗手液產(chǎn)品抑菌圈大小

表2 添加化學抑菌劑的沐浴露和洗手液產(chǎn)品的抑菌圈大小

表1數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：不同原料加量的沐浴露和洗手液產(chǎn)品抑菌圈大小差異不明顯。牛至純露加量在5%～15%時對三種菌的抑菌圈＞15 mm，為高度敏感，其中抑菌圈大小順序為銅綠假單胞菌＞大腸埃希菌＞白念珠菌。迷迭香純露加量在1%～15%時，對三種菌的抑菌圈＞15 mm，為高度敏感，抑菌圈大小順序為銅綠假單胞菌＞大腸埃希菌＞白念珠菌，其中加量為5%時對白念珠菌的抑菌圈為7～9 mm，為低度敏感。艾草純露加量在1%～15%時，對三種菌的抑菌圈＞15 mm，為高度敏感，抑菌圈大小順序為大腸埃希菌＞銅綠假單胞菌＞白念珠菌，加量在1%～10%時對白念珠菌為低度敏感，10%～15%加量時為中度敏感。

表2數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：添加三氯生、醋酸氯己定和尼泊金乙酯濃度大于0.03%時對銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的抑菌圈＞20 mm，為極度敏感；對白念珠菌抑菌圈為10 mm，為中度敏感。由此可見各化學抑菌劑的抑菌性能大小順序為三氯生＞醋酸氯己定＞尼泊金乙酯，確定添加量為0.03%。

2.2 抑菌率法測定抑菌性能

對牛至、迷迭香和艾草精油和純露最小添加量的洗手液和沐浴露產(chǎn)品及化學抗菌劑產(chǎn)品進行加水稀釋至50%，分別與一定濃度的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和白念珠菌菌懸液混合后，采用稀釋混合平板法進行抑菌率實驗。結(jié)果見表3。

表3 各產(chǎn)品對供試菌種的抑菌率

抑菌率實驗結(jié)果顯示：濃度稀釋為50%的產(chǎn)品對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和白念珠菌的抑菌率均超過了50%，說明產(chǎn)品中加入的天然抗菌劑和化學抗菌劑對三種供試菌種均有顯著的抑菌作用。

2.3 現(xiàn)場手消毒實驗

產(chǎn)品原液50%濃度稀釋液作為試驗樣液，對于大腸埃希菌的抑菌率實驗，原液體積分數(shù)25%濃度的稀釋液作為試驗樣液，對于白念珠菌的抑菌率實驗，原液體積分數(shù)25%濃度的稀釋液作為試驗樣液，對于銅綠假單胞菌的抑菌率實驗。選擇10人進行現(xiàn)場手消毒實驗，計算出消毒率。結(jié)果見表4。

表4 產(chǎn)品的抑菌率實驗及現(xiàn)場手消毒實驗結(jié)果

現(xiàn)場手消毒實驗結(jié)果顯示洗手液和沐浴露產(chǎn)品對人體表面細菌都有明顯的抑菌效果，其中牛至精油抑菌率為76.6%效果最顯著，除艾草精油和艾草純露的洗手液和沐浴露抑菌率在50%以下，其他均在50%以上。

2.4 產(chǎn)品抗氧化活性測定

采用DPPH法、普魯士藍法和水楊酸法測定添加植物精油、純露和化學抑菌劑的沐浴露、洗手液產(chǎn)品抗氧化活性，見表5。

表5 洗手液和沐浴露產(chǎn)品的抗氧化活性測定結(jié)果

由表5知，沐浴露產(chǎn)品清除DPPH·能力排序為：醋酸氯己定＞尼泊金乙酯＞迷迭香精油＞牛至精油＞艾草精油＞三氯生＞牛至純露＞迷迭香純露＞艾草純露；還原力大小排序為：醋酸氯己定＞尼泊金乙酯＞三氯生＞牛至精油＞迷迭香精油＞艾草精油＞牛至純露＞迷迭香純露＞艾草純露；·OH清除能力大小排序為：牛至精油＞迷迭香精油＞迷迭香純露＞牛至純露＞艾草精油＞艾草純露＞醋酸氯己定＞三氯生＞尼泊金乙酯。添加醋酸氯己定的沐浴露產(chǎn)品清除DPPH·能力和還原力最強，添加植物精油和純露的沐浴露產(chǎn)品具有與化學抑菌抗氧化劑沐浴露產(chǎn)品相當?shù)目寡趸芰?，如添?.03%三氯生所制備的沐浴露與添加0.4%牛至精油的沐浴露產(chǎn)品清除DPPH·的能力相近。

洗手液產(chǎn)品清除DPPH·能力排序為：牛至精油＞迷迭香精油＞醋酸氯己定＞艾草精油＞尼泊金乙酯＞牛至純露＞迷迭香純露＞三氯生＞艾草純露；還原力大小排序為：牛至精油＞迷迭香精油＞醋酸氯己定＞艾草精油＞尼泊金乙酯＞牛至純露＞迷迭香純露＞三氯生＞艾草純露；·OH清除能力大小排序為：迷迭香精油＞牛至精油＞醋酸氯己定＞艾草精油＞尼泊金乙酯＞牛至純露＞迷迭香純露＞三氯生＞艾草純露。洗手液中以添加0.4%的牛至精油或迷迭香精油的產(chǎn)品抗氧化性最強。

3 結(jié)論

（1）采用濾紙片法對添加植物精油、純露及化學抗氧化劑的洗手液和沐浴露進行抑菌實驗，結(jié)果表明牛至純露加量在5%～15%時對三種菌的抑菌圈＞15 mm，為高度敏感，其中抑菌圈大小順序為銅綠假單胞菌＞大腸埃希菌＞白念珠菌。迷迭香純露加量在1%～15%時，對三種菌的抑菌圈＞15 mm，為高度敏感，抑菌圈大小順序為：銅綠假單胞菌＞大腸埃希菌＞白念珠菌，其中加量為5%時對白念珠菌的抑菌圈為7～9 mm，為低度敏感。艾草純露加量在1%～15%時，對三種菌的抑菌圈＞15 mm，為高度敏感，抑菌圈大小順序為：大腸埃希菌＞銅綠假單胞菌＞白念珠菌，加量在1%～10%時對白念珠菌為低度敏感，10%～15%加量時為中度敏感。

（2）通過抑菌率實驗得出加入0.4%植物精油與0.03%化學抑菌劑的洗手液和沐浴露產(chǎn)品抑菌效果相當。

（3）通過對比不同產(chǎn)品抗氧化性的測定結(jié)果，添加醋酸氯己定的沐浴露產(chǎn)品清除DPPH·能力和還原力最強，添加植物精油和純露的沐浴露產(chǎn)品具有與化學抑菌抗氧化劑沐浴露產(chǎn)品相當?shù)目寡趸芰?，如添?.03%三氯生所制備的沐浴露與添加0.4%牛至精油的沐浴露產(chǎn)品清除DPPH·的能力相近。添加0.4%的牛至精油或迷迭香精油的洗手液產(chǎn)品抗氧化性強于添加化學抑菌抗氧化劑的洗手液產(chǎn)品。