不同炮制時間下的西洋紅參對免疫力低下小鼠免疫功能的影響

李生斌 趙 崢 萬 嬌 趙 惠 劉愛玲 白媛媛 劉春軍

(1 榆林市星元醫(yī)院中藥房，榆林，719000； 2 寶雞市中心醫(yī)院藥劑科，寶雞，721008)

不同炮制時間下的西洋紅參對免疫力低下小鼠免疫功能的影響

李生斌1趙 崢1萬 嬌1趙 惠1劉愛玲1白媛媛1劉春軍2

(1 榆林市星元醫(yī)院中藥房，榆林，719000； 2 寶雞市中心醫(yī)院藥劑科，寶雞，721008)

目的：探討不同炮制時間下西洋紅參水提物對對免疫力低下小鼠免疫功能的影響。方法：清潔級小鼠70只，隨機平均分為空白組、陽性藥組、模型組、2 h炮制組、4 h炮制組、6 h炮制組及生藥組，每天分別給予等量生理鹽水、左旋咪唑(30 mg/kg)、2 h炮制的西洋紅參水提物(200 mg/kg)、4 h炮制的西洋紅參水提物(200 mg/kg)、6 h炮制的西洋紅參水提物(200 mg/kg)及生藥水提物(200 mg/kg)。對除空白組外小鼠采用環(huán)磷酰胺(50 mg/kg)腹腔給藥誘導小鼠免疫低下模型。分別檢測脾臟及胸腺指數；應用碳廓清實驗、ConA與LPS誘導小鼠脾淋巴細胞增殖反應；檢測各組小鼠T淋巴細胞亞群值。結果：各種炮制時間的西洋紅參及生藥均可不同程度的提高免疫低下小鼠的脾臟及胸腺指數、廓清指數、吞噬指數、脾淋巴細胞增殖反應、CD4+及CD8+細胞數，且可升高CD4+/CD8+細胞比值。在各炮制組中，2 h炮制的西洋紅參水提物免疫調節(jié)功能優(yōu)于其余炮制組及生藥組。結論：不同炮制時間的西洋紅參水提物對免疫力低下小鼠的免疫調節(jié)作用均不相同，其中2 h炮制時間活性最佳，值得進行深入研究。

炮制；西洋參；免疫力低下

西洋參為五加科植物西洋參(拉丁名：PanaxquinquefoliumL.)的干燥根，原產于美國北部及加拿大南部[1]?，F代藥學研究顯示，西洋參炮制品西洋紅參對于提高免疫力、抗癌、抗疲勞及抗心肌缺血等多方面均具有較好的活性，而提高免疫力活性為其最主要的應用價值之一[2]。有研究表明，炮制時間及溫度的不同對于西洋紅參的化學成分影響均較大，故對于該藥物的藥理活性亦具有一定的影響[3]，而截止目前，醫(yī)學界尚未對于不同的炮制時間對該藥物提高免疫活性影響展開研究，對該藥物的炮制及其應用等方面均造成一定的困擾。為此，本課題組通過研究不同炮制時間對西洋紅參水提物治療小鼠免疫力低下的作用，為進一步了解其使用特點提供一定的借鑒，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 70只體質量為(18±2)g的清潔級ICR(Institute of Cancer Research)小鼠，雌雄各半，由西安交通大學實驗動物中心提供，質量合格證號：SCXK(陜)2014-0219。上述小鼠于實驗前適應性喂養(yǎng)7 d，自然光照，自由飲水及攝食，室溫控制為(20±2)℃，本課題中動物的實驗操作流程需嚴格遵循《實驗動物保護條例》。

1.1.2 藥物

1.1.2.1 藥材選取 生藥材購買于美國威斯康星州Hill Up植物藥材有限公司(美國威斯康星州麥迪遜市產)，該藥材由西安交通大學生藥學系陳虎教授鑒定為五加科植物西洋參(PanaxquinquefoliumL.)的干燥根，藥材的質量符合2010版中國藥典(一部)中對該藥物的相關規(guī)定。

1.1.2.2 西洋紅參的炮制方法 根據2010版中國藥典(一部)[4]、《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》[5]中對于西洋紅參的炮制方法，將購買的五年西洋參生藥洗凈，去除支根及須根后置于密封容器中，分別隔水蒸2 h、4 h及6 h，將上述炮制時間不同的西洋參切片(3～5 mm厚)置于-20 ℃冰箱中48 h后冷凍干燥，即分別得炮制時間為2 h、4 h及6 h的西洋紅參。

1.1.2.3 西洋紅參炮制品水提物的制備 參考相關文獻[7]中西洋紅參的提取方法，取上述炮制時間為2 h、4 h及6 h的藥材與西洋參生藥材，分別加入20倍體積純水，95 ℃提取4次，2 h/次，合并提取液并減壓蒸餾，濃縮即得到炮制時間為2 h、4 h及6 h的西洋紅參水提物與西洋參生藥材水提物浸膏，分別加水配制為相當于西洋紅參1.5 g/mL的濃度的水提液。

1.1.3 試劑與儀器 環(huán)磷酰胺購自江蘇恒瑞醫(yī)藥公司，批號：2014120836；左旋咪唑、二硝基氟苯(DNFB)及印度墨汁均購自美國SIGMA公司，批號分別為79110198、79178321和79129832；小牛血清、脂多糖(LPS)、刀豆蛋白A(ConA)及溴化-3(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑(MTT)均由武漢博士德生物科技有效公司，批號分別為2014120312、2014110923、2014100821及2015010234；RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，批號為8909323。

96孔細胞培養(yǎng)板(美國CORNING公司)；Bio-Rad550型酶標儀(日本Bio-Rad公司)；MODEL550型臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥方法 將上述小鼠隨機分為空白組、陽性藥組、模型組、炮制組(2 h炮制組、4 h炮制組、6 h炮制組)及生藥組，共7組，每組10只。按照參考文獻中北美產西洋參及其炮制品用于小鼠模型的一般劑量，確定2 h炮制組、4 h炮制組、6 h炮制組及生藥組西洋參給藥劑量均為150 g/kg(按生藥量計算)，即200 mg/kg的水提取液。

炮制組小鼠每天灌胃給予200 mg/kg西洋紅參；陽性藥組每天灌胃給予30 mg/kg左旋咪唑；空白組與模型組小鼠則給予等量蒸餾水。連續(xù)給藥7 d，其中在給藥的第3 d對正常組外的其他組別小鼠進行50 mg/kg環(huán)磷酰胺腹腔注射，1次/d，連續(xù)注射2 d。給藥7 d后，脫椎處死各組小鼠，并進行下一步實驗。

1.2.2 檢測指標與方法

1.2.2.1 各組小鼠臟器指數的檢測 如1.2.1中所述，處死小鼠后于無菌條件下取脾臟及胸腺，稱濕重，檢測并計算各組小鼠脾臟指數及胸腺指數，其中小鼠脾臟指數為脾臟重/體重(mg/g)；胸腺指數為胸腺重/體重(mg/g)。

1.2.2.2 各組小鼠單核細胞吞噬碳粒能力的檢測 如1.2.1中所述，第7天給藥結束后，對每組小鼠尾靜脈注射離心后的20%印度墨汁(注射劑量0.10 mL/10 g)，用專用取血管在注射后0.5 min及6 min分別對各組小鼠進行眼眶后靜脈取血，取血量為0.025 mL。取血后，立刻將上述靜脈血吹入0.1%碳酸鈉溶液2 mL中，再取0.025 mL空白組小鼠靜脈血溶解于0.1%碳酸鈉溶液210 mL中進行校零，檢測分光光度計675 nm波長處的比色值，利用文獻中公式計算小鼠吞噬指數K與吞噬系數α。

1.2.2.3 各組小鼠脾淋巴細胞增殖反應的檢測 取1.2.2.1中各組小鼠部分無菌脾臟，制備細胞密度為5×106個/mL的脾細胞懸液并加入96孔板(每孔100 μL)，每孔再分別加入100 μL LPS(20 mg/L)或ConA(5 mg/L)，在37 ℃及5%CO2培養(yǎng)箱中對上述細胞培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL的MTT(5 g/L PBS液)，繼續(xù)培養(yǎng)5 h。利用高速離心機對其進行離心，棄去上清后以DMSO溶解，利用酶標儀檢測570 nm處吸光度(A)。每組均設5個復孔，并取平均值。

1.2.2.4 各組小鼠T淋巴細胞亞群值的檢測 取1.2.2.1中小鼠剩余無菌脾臟，以PBS常規(guī)制備各組脾細胞懸液，加0.84%氯化銨溶液于懸液中使紅細胞裂解，調整上述懸液的細胞濃度至5×108～5×109/L，取50 μL上述懸液與1 mL PBS于離心管，利用高速離心機離心除去上清。分別取10 μL FITC-抗CD4+Ab及10 μL PE-抗CD8+Ab于離心管中，混勻后在避光條件下反應30 min，利用流式細胞儀檢測其中CD4+、CD8+細胞數，并計算CD4+/CD8+。

2 結果

2.1 各組小鼠臟器指數比較情況 模型組脾臟指數及胸腺指數較空白組與陽性藥組出現明顯降低(P<0.01)；各西洋紅參炮制組及生藥組脾臟指數及胸腺指數均明顯高于模型組，各組相關數據分別與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中在各炮制組中，2 h炮制組小鼠脾臟及胸腺指數均高于其余炮制組及生藥組。見圖1。

圖1 各組小鼠臟器指數比較情況(***P<0.001)

2.2 各組小鼠單核細胞吞噬碳粒能力比較情況 正常組小鼠的碳廓清指數K與吞噬指數α均明顯高于模型組，2組相比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各西洋紅參炮制組及生藥組K與α均明顯高于模型組(P<0.05)；其中在各炮制組中，2 h炮制組小鼠碳的廓清指數與吞噬指數均高于其余炮制組及生藥組。見表1。

表1 各組小鼠碳廓清指數及吞噬指數比較情況

注：各組分別與模型組相比較，*P<0.05；**P<0.01。

2.3 各組小鼠脾淋巴細胞增殖反應檢測結果 模型組小鼠ConA與LPS誘導后脾淋巴細胞增殖反應明顯低于正常組，2組相比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各西洋紅參炮制組及生藥組則均可提高脾淋巴細胞增殖反應，各組分別與模型組相比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中2 h炮制組小鼠脾淋巴細胞增殖情況均大于其余炮制組及生藥組。見圖2。

圖2 各組小鼠脾淋巴細胞增殖反應檢測情況(***P<0.001)

2.4 各組小鼠T淋巴細胞亞群值的檢測結果 如表2所示，模型組小鼠T淋巴細胞亞群比例失調，CD4+及CD8+細胞數明顯低于空白組(P<0.01)；與模型組相比較，陽性藥組、各西洋紅參炮制組及生藥組小鼠T淋巴細胞亞群值則得到明顯升高，各組分別與模型組相比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中2 h炮制組小鼠上述值均大于其余炮制組及生藥組。見表2。

表2 各組小鼠T淋巴細胞亞群值的檢測情況±s)

注：各組分別與模型組相比較，*P<0.05；**P<0.01。

3 討論

西洋參是人參的一種，原產于美國北部及加拿大南部一帶，以威斯康辛州產西洋參品質最佳，可作為保健食品服用[7]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥學認為，西洋參生藥及其炮制品為涼性補益藥，可用于臨床陰虛內熱證等疾病的治療，其中西洋紅參為應用最為廣泛的一類炮制品[8]。西洋參皂苷是西洋紅參中最主要的活性成分，其中以三萜類化合物居多，化學結構與人參皂苷具有一定的相似之處，可分為Ra組、Rb組和Rg組等3大類群，其中Rb組及Rg組的藥理活性較強[9]?，F代藥學研究證實，西洋紅參具有提高免疫力、保護心血管系統(tǒng)、增強中樞神經系統(tǒng)功能、促進血液活力及抗糖尿病等活性，其中西洋紅參的促進免疫活性是該炮制品最為廣泛的研究領域之一[10]。黃艷飛[11]等的研究結果表明，炮制時間、方法等炮制工藝的不同對西洋參中皂苷類化合物的影響均較大，尤其是能夠顯著影響西洋參中最主要的活性成分Rg1及Rg2的含量，故西洋參的藥理活性亦能夠產生明顯變化，該結論與本研究中不同炮制時間的西洋紅參水提物免疫調節(jié)活性之間具有差異這一結果基本一致。Mathur A[12]則從化學結構上闡述了西洋參提高免疫的物質基礎，其結果發(fā)現，一系列含有過氧鍵的皂苷類化合物是西洋參免疫調節(jié)的重要前體活性成分，對其進行適當的高溫處理，可在氧氣的作用下將其過氧鍵破壞形成羥基，而長時間的持續(xù)高溫又可將羥基氧化為較為穩(wěn)定的終產物羰基皂苷；在這3種皂苷中，羥基皂苷活性最強，羰基活性次之，含有過氧鍵的皂苷則最弱。在本研究中，高溫炮制2 h的西洋參活性最佳，隨著炮制時間的延長活性逐漸降低，而所有炮制組活性均優(yōu)于生藥組，該結果與上述Mathur A的研究結論基本一致，但炮制時間的選擇還需要通過LC-MS等方法進一步的探討。盡管臨床對西洋紅參炮制的研究極為廣泛，但對炮制時間影響該藥物免疫活性的研究卻較少涉及，本課題參考上述研究結果，比較了不同的炮制時間下的西洋紅參水提物的免疫調節(jié)活性，為探討西洋參炮制工藝提供了一定的借鑒。

胸腺及脾臟等免疫器官的臟器指數是衡量機體免疫功能情況的初步指標[13-14]；而單核巨噬細胞吞噬能力則能夠有效衡量機體非特異性免疫功能，其中巨噬細胞碳廓清指數與吞噬指數可有效反映內皮網狀系統(tǒng)的吞噬功能強弱[15-16]；遲發(fā)型變態(tài)反應則是一種常見的免疫反應，是通過T細胞介導的細胞免疫應答形式[17]；血液中T細胞亞群數目及其比值檢測則是評價體內免疫調節(jié)平衡狀態(tài)的重要參數[18-19]。本研究表明，各組西洋紅參水提物不僅均能明顯改善由于環(huán)磷酰胺所導致的小鼠的脾和胸腺萎縮，還可調節(jié)碳廓清指數及吞噬指數，對免疫抑制小鼠網狀內皮系統(tǒng)吞噬能力亦有一定的促進作用，而2 h炮制的西洋紅參上述指標最接近空白組，提示西洋紅參炮制品及生藥水提物均可以增強小鼠非特異性免疫功能，其中2 h炮制的西洋紅參活性最優(yōu)。此外，各組西洋紅參水提物還能促進小鼠低下的淋巴細胞增殖反應，提高CD4+、CD8+細胞數及CD4+/CD8+比值，且2 h炮制的西洋紅參促進作用與陽性藥組更接近，提示西洋紅參可增強機體特異性細胞免疫功能，而2 h炮制的西洋紅參的促進作用強于其余炮制組。

由于本課題的目的主要是探討炮制時間的不同對西洋紅參藥理活性的影響，故在研究中僅使用單一劑量進行闡述，而給藥劑量的量效關系還需要在后期研究中進行深入探討。

綜上所述，本研究發(fā)現，與生藥相比較，炮制后的西洋紅參水提取物對免疫力低下小鼠具有更好的免疫調節(jié)活性，且炮制時間為2 h的西洋紅參活性最佳，但其具體機制還不明確，仍需要進行深入研究。

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(2016-04-27收稿 責任編輯：白樺)

Effects of Panax quinquefolium L.Water Extraction under Different Processed Time on Hypoimmunity in Mice

Li Shengbin1，Zhao Zheng1，Wan Jiao1,Zhao Hui1，Liu Ailing1，Bai Yuanyuan1,Liu Chunjun2

(1Departmentofpharmacy,YulinXingyuanHospital,Yulin719000,China；2Departmentofpharmacy，CentralHospitalofBaoji，Baoji721008，China)

Objective:To explore the effects ofPanaxquinquefoliumL.under different processed time on hypoimmunity in mice.Methods:Seventy KM mice，randomly divided into a blank control group and positive drug group，model group，2 h processed group，4 h processed group，6 h processed group and crude drug group，were given same amount of normal saline，levomisole (30 mg/kg)，2 h extract (200 mg/kg)，4 h extract (200 mg/kg)，6 h extract (200 mg/kg) and crude drug extract (200 mg/kg) each day，respectively.Except the blank group，the other mice were treated by cyclophosphamide (50 mg/kg) through abdominal administration to induce low immune mice model.To detect the spleen and thymus index，indexes of the clearance rate of carbon，ConA and LPS were applicated to induce spleen lymphocyte proliferation response，testing each value of T lymphocyte subsets in mice.Results:All kinds of processing time of ginseng and crude drugs can influence the levels of spleen and thymus index，expurgation index，index，spleen lymphocyte proliferation reaction and the number of CD4+and CD8+cells，and can increase the ratio of CD4+/ CD8+cells in the lower immune mice.In each processing group，2 h group was more active than the other groups.Conclusion:Different processing time ofPanaxquinquefoliumL.water extract on hypoimmunity in mice varies in effect，in which 2 h processed time has the best activity and is worth of further research.

PanaxquinquefoliumL.; Processed; Hypoimmunity

李生斌(1975.05—)，男，本科，主管中藥師，研究方向：中藥鑒定和炮制，E-mail：lishengbing1975@163.com

劉春軍(1981.04—)，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：藥物治療內科腫瘤，E-mail：lcj-email@126.com

R283.1；R-332

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.037