生長(zhǎng)年限對(duì)滇重樓中甾體皂苷活性成分和生物量積累的影響

趙艷麗，賴佳輝，蔡 吹，張保得，韋春冕，彭壽杰，徐福榮

?藥材與資源?

生長(zhǎng)年限對(duì)滇重樓中甾體皂苷活性成分和生物量積累的影響

趙艷麗，賴佳輝，蔡 吹，張保得，韋春冕，彭壽杰，徐福榮*

云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南省南藥可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500

探究云南重樓var.（滇重樓）根莖中甾體皂苷活性成分和生物量積累隨生長(zhǎng)年限的變化狀況，以期為滇重樓的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。以7、8、9、11、12、13、14、15年生滇重樓為研究對(duì)象，采用HPLC法和直接稱重法測(cè)定不同年限滇重樓根莖中8種甾體皂苷（重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅲ、H、V和纖細(xì)薯蕷皂苷）含量和生物量。8種甾體皂苷活性成分線性關(guān)系良好（2≥0.999 5），精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率的RSD值均小于3%，驗(yàn)證了該方法的可行性；隨著年限的增長(zhǎng)，滇重樓根莖生物量呈逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)，其生長(zhǎng)發(fā)育可分為增長(zhǎng)緩慢期（第1～4年）、增長(zhǎng)快速期（第5～10年）和增長(zhǎng)平緩期（第11年后）3個(gè)階段，其中7年生滇重樓根莖生物量增長(zhǎng)最快，平均年增長(zhǎng)量達(dá)（31.843±14.225）g；滇重樓根莖中8種甾體皂苷成分含量在不同生長(zhǎng)年限的變化呈隨機(jī)波動(dòng)、無(wú)規(guī)律，《中國(guó)藥典》2020版規(guī)定的3個(gè)指標(biāo)成分重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ含量之和與8種甾體皂苷總和的變化趨勢(shì)一致；用4個(gè)主成分對(duì)不同年限滇重樓藥材進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示7年生樣品在所有樣品中的綜合得分位于前7名。建立了同時(shí)測(cè)定滇重樓中8種甾體皂苷活性成分含量的方法，可用于滇重樓的質(zhì)量評(píng)價(jià)；滇重樓并非種植年限越長(zhǎng)越好，建議以7年生滇重樓采收入藥為最佳。

滇重樓；生長(zhǎng)年限；重樓皂苷Ⅰ；重樓皂苷Ⅱ；重樓皂苷Ⅵ；重樓皂苷Ⅶ；重樓皂苷Ⅲ；重樓皂苷H；重樓皂苷V；纖細(xì)薯蕷皂苷；生物量；定量評(píng)價(jià)；動(dòng)態(tài)變化

重樓作為我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，以“蚤休”之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，是重樓屬植物云南重樓Smithvar.(Franch.) Hand.-Mazz或七葉一枝花Smithvar.(Franch.) Hand.的干燥根莖，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，主要用于跌打傷痛、毒蛇咬傷、驚風(fēng)抽搐等癥的治療[2-3]。云南重樓即滇重樓是中藥重樓的藥用基原植物之一，其中含有豐富的甾體皂苷、黃酮、植物甾醇等藥效成分，是云南白藥、宮血寧膠囊等著名中成藥的重要原料[4]。

隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，滇重樓需求量日益劇增，單靠采集野生資源已難以滿足市場(chǎng)的需求，人工種植成為解決資源匱乏的必然選擇[5]。然而，由于大規(guī)模的人工栽培導(dǎo)致滇重樓質(zhì)量參差不齊，不同年限滇重樓根莖中甾體皂苷含量差異大，不利于滇重樓生產(chǎn)加工過(guò)程中的質(zhì)量控制[6-8]。目前，已有眾多研究表明滇重樓藥效成分的積累與植物自身生長(zhǎng)年限息息相關(guān)[9-12]。然而，關(guān)于不同生長(zhǎng)年限滇重樓根莖的不同生長(zhǎng)部位中甾體皂苷的積累規(guī)律研究鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)分析不同生長(zhǎng)年限滇重樓根莖中不同生長(zhǎng)部位的甾體皂苷類成分含量和生物量，探索不同生長(zhǎng)年限滇重樓生長(zhǎng)量，以及甾體皂苷隨生長(zhǎng)年限的積累狀況，闡明滇重樓生物量和甾體皂苷含量最佳的生長(zhǎng)年限，為滇重樓最佳采收期的確定和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；SB25-12DTD型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-924型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HA225SM-DR型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士普利賽斯公司）；FL-01型高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市富力中藥機(jī)械廠）。

1.2 材料

對(duì)照品重樓皂苷Ⅰ（批號(hào)111590-202105，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥94.50%），重樓皂苷Ⅱ（批號(hào)11591-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥91.40%）、重樓皂苷Ⅶ（批號(hào)111593-202105，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.40%）及重樓皂苷Ⅵ（批號(hào)111592-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97.00%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品重樓皂苷H（批號(hào)201022-111，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.00%）、重樓皂苷V（批號(hào)20120704，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.07）、重樓皂苷Ⅲ（批號(hào)21061701，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.39%）、纖細(xì)薯蕷皂苷（批號(hào)21050807，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.91%）購(gòu)于昆明森嵐科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純、美國(guó)默克公司）；水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

1.3 樣品

30株滇重樓均采自于云南省曲靖市師宗喬林重樓生物科技有限公司的滇重樓種植基地（海拔高度：1876 m，經(jīng)緯度：E 103.989 161 13，N 24.750 341 33），經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)徐福榮研究員鑒定為重樓屬植物云南重樓Smithvar.(Franch.) Hand. -Mazz的新鮮根莖，樣品信息見表1。

2 方法

2.1 樣品的處理

植株洗凈并去除非藥用部位后，根據(jù)根莖上莖痕數(shù)目的多少，將7年生同株滇重樓樣品進(jìn)一步分為7、6、5、4、3年生者，8、9、11、12、13、14、15年生滇重樓樣品做同樣處理。所有樣品置40 ℃干燥箱干燥至恒定質(zhì)量。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序?yàn)?～10 min，35%～40% B；10～22 min，40%～42% B；22～23 min，42%～40% B；23～38 min，40% B；38～45 min，40%～47% B；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫25 ℃；體積流量0.7 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅲ、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷V和重樓皂苷H對(duì)照品適量，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得含上述對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為2.717、2.058、1.062、1.308、2.692、1.059、0.484、1.101 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

表1 樣品信息

2.4 供試品溶液的制備

取滇重樓粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，至具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液5 mL，稱定質(zhì)量，55 ℃超聲處理（功率400 W、頻率40 kHz）60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.5 方法學(xué)考察

因?yàn)椴煌L(zhǎng)年限的滇重樓樣品間差異較大，僅有極少數(shù)樣品滿足多組分的方法學(xué)考察要求，故選取了2個(gè)樣品（S39、S69）進(jìn)行了系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)，以為了更全面的對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.5.1 專屬性考察 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（S39、S69）和空白溶劑（甲醇），按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果供試品色譜與對(duì)照品色譜具有相同保留時(shí)間的色譜峰，且空白溶劑對(duì)供試品和對(duì)照品均無(wú)干擾（圖1），表明該方法專屬性良好。

A-甲醇溶劑 B-混合對(duì)照品溶液 C-供試樣品S39 D-供試樣品S69 1-重樓皂苷Ⅶ 2-重樓皂苷H 3-重樓皂苷Ⅵ 4-重樓皂苷Ⅱ 5-重樓皂苷Ⅲ 6-纖細(xì)薯蕷皂苷 7-重樓皂苷Ⅰ 8-重樓皂苷V

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密移取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，稀釋成一系列不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定。以各皂苷對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），對(duì)應(yīng)色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 8種重樓皂苷成分線性關(guān)系

2.5.3 精密度試驗(yàn) 精密移取同一混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分峰面積。計(jì)算得到重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅲ、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷V、重樓皂苷H峰面積的RSD值分別為0.06%、0.12%、0.12%、0.30%、0.04%、0.11%、0.12%、0.13%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定S39、S69滇重樓樣品粉末各6份，每份約0.5 g（過(guò)三號(hào)篩），按照“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜峰面積，計(jì)算得到重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅲ、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷V、重樓皂苷H峰面積的RSD值分別為0.76%、1.24%、2.09%、1.68%、1.82%、1.03%、1.15%、1.40%。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取同一供試品溶液（S39、S69），按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，計(jì)算得到重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅲ和纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷V、重樓皂苷H峰面積的RSD值分別為0.45%、1.56%、2.85%、1.65%、1.30%、0.36%、2.91%、0.82%。結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已測(cè)定的S39、S69滇重樓樣品粉末各6份，每份約0.25 g至具塞錐形瓶中，分別加入相當(dāng)量的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、H和纖細(xì)薯蕷皂苷的混合對(duì)照品溶液5 mL。按照“2.4”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜峰面積，計(jì)算回收率，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅲ和纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷V、重樓皂苷H回收率分別為99.97%、99.28%、98.32%、102.18%、102.00%、100.12%、99.12%、99.58%，RSD分別為0.24%、0.65%、2.23%、2.59%、1.14%、0.84%、2.33%、1.98%。

2.6 樣品測(cè)定

取“2.1”項(xiàng)下的滇重樓樣品按上述“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件分析，記錄色譜圖及峰面積，計(jì)算含量。

2.7 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 26和SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析等多元統(tǒng)計(jì)分析；利用Graphpad prism統(tǒng)計(jì)分析和Origin繪圖軟件進(jìn)行折線圖、液相色譜圖等繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 滇重樓根莖生物量隨生長(zhǎng)年限的動(dòng)態(tài)變化

對(duì)73批不同生長(zhǎng)年限滇重樓根莖的生物量進(jìn)行分析。由圖2可知，滇重樓的根莖生物量隨生長(zhǎng)年限的增加而增加。通過(guò)比較不同生長(zhǎng)年限滇重樓根莖的生物量積累速率，滇重樓根莖的生長(zhǎng)可分為3個(gè)階段：第1～4年生長(zhǎng)速度較慢為增長(zhǎng)緩慢期，其生物量年增長(zhǎng)（7.930±4.998）g；第5～10年為增長(zhǎng)快速期，其生物量年增長(zhǎng)（24.129±3.201）g；第11年以后為增長(zhǎng)平緩期，其生物量年增長(zhǎng)（16.756±0.820）g。其中7年生滇重樓根莖生物量增長(zhǎng)最快，平均年增長(zhǎng)量高達(dá)（31.843±14.225）g。

3.2 滇重樓根莖的不同部位中甾體皂苷含量隨生長(zhǎng)年限的動(dòng)態(tài)變化

通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算73批不同生長(zhǎng)年限滇重樓根莖中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、H和纖細(xì)薯蕷皂苷的含量，結(jié)果見表3。由結(jié)果可知，7、8、9、11、12、13、14、15年生等73批滇重樓樣品中均可檢測(cè)出重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、H和纖細(xì)薯蕷皂苷等6種甾體皂苷，有42批樣品中檢測(cè)出重樓皂苷Ⅵ，30批樣品中檢測(cè)出重樓皂苷V；各甾體皂苷在不同生長(zhǎng)年限滇重樓根莖中含量變幅差異大，重樓皂苷Ⅰ的平均值是0.331%，含量變幅為0.056%～0.721%；重樓皂苷Ⅱ的平均值是0.167%，含量變幅為0.066%～0.401%；重樓皂苷Ⅲ的平均值是0.039%，含量變幅為0.011%～0.086%；重樓皂苷V的平均值是0.006%，含量變幅為0.004%～0.031%；重樓皂苷Ⅵ的平均值是0.007%，含量變幅為0.005%～0.070%；重樓皂苷Ⅶ的平均值是0.125%，含量變幅為0.025%～0.346%；重樓皂苷H的平均值是0.067%，含量變幅為0.005%～0.364%；纖細(xì)薯蕷皂苷的平均值是0.084%，含量變幅為0.019%～0.196%。通過(guò)比較滇重樓根莖中甾體皂苷含量隨生長(zhǎng)年限波動(dòng)的變異系數(shù)可得，重樓皂苷Ⅱ（29.401%）＜重樓皂苷Ⅲ（34.231%）＜重樓皂苷Ⅰ（34.734%）＜纖細(xì)薯蕷皂苷（49.957%）＜重樓皂苷Ⅶ（64.418%）＜重樓皂苷H（98.854%）＜重樓皂苷Ⅵ（135.365%）＜重樓皂苷V（144.505%），其中重樓皂苷V和重樓皂苷Ⅵ的變異度較大，變異系數(shù)＞100%，說(shuō)明重樓皂苷V和重樓皂苷Ⅵ隨生長(zhǎng)年限的波動(dòng)幅度大；根據(jù)《中國(guó)藥典》中規(guī)定的中藥重樓檢測(cè)要求，除14年生和15年生滇重樓樣品外，其余6個(gè)生長(zhǎng)年限滇重樓樣品重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ三者總含量高于0.6%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，其中7年生樣品含量最高，高達(dá)（1.079±0.066）%。不同生長(zhǎng)年限滇重樓根莖中甾體皂苷含量隨生長(zhǎng)年限的動(dòng)態(tài)變化見圖3。滇重樓根莖中主要活性成分含量在不同生長(zhǎng)年限的變化呈隨機(jī)波動(dòng)，無(wú)規(guī)律，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ三者含量之和的變化趨勢(shì)同總皂苷的變化趨勢(shì)大致相似；除7年生、11年生外，同一年生長(zhǎng)年限滇重樓的不同生長(zhǎng)部位根莖中總皂苷含量隨生長(zhǎng)年限增加整體呈先升高后降低的趨勢(shì)。

圖2 不同生長(zhǎng)年限滇重樓生物量累積曲線

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

續(xù)表3

圖3 不同生長(zhǎng)年限滇重樓根莖中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ含量之和和總皂苷含量

3.3 主成分分析

為全面評(píng)價(jià)滇重樓藥材的質(zhì)量，對(duì)73批不同年限滇重樓樣品進(jìn)行主成分分析，以累積方差貢獻(xiàn)率≥85%為提取原則，取得4個(gè)主成分并計(jì)算主成分得分，初始特征值和方差貢獻(xiàn)率結(jié)果見表4，主成分得分和綜合得分結(jié)果見表5。由表4可知，前4個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)85.247%，說(shuō)明提取的4個(gè)主成分具有良好的代表性，可以反映不同年限滇重樓樣品的綜合質(zhì)量。由表5結(jié)果顯示，7年生滇重樓樣品（S1～S5）的綜合得分均位列前7，表明7年生滇重樓樣品整體質(zhì)量較其他年限藥材最好。

表4 特征值和方差貢獻(xiàn)率

4 討論

選取合理的指標(biāo)性成分或有效成分進(jìn)行HPLC分析是中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)研究的重要前提[13]。據(jù)報(bào)道滇重樓具有抗腫瘤[14-15]、抗菌[16-17]、抗病毒[18]、抗炎[19-20]等藥理作用，其中重樓皂苷Ⅰ能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，并有望成為奧希替尼治療肺癌時(shí)產(chǎn)生耐藥性的治療劑[21-22]；重樓皂苷Ⅱ通過(guò)調(diào)節(jié)EMT相關(guān)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）抑制膀胱癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[23-24]；重樓皂苷Ⅲ除免疫調(diào)節(jié)外，能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[25]。重樓皂苷Ⅵ可有效地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[26]。重樓皂苷V和重樓皂苷Ⅵ對(duì)白色念珠菌具有顯著的抗真菌作用[27]。重樓皂苷Ⅶ可抑制破骨細(xì)胞分化，可治療骨質(zhì)疏松癥[28]。重樓皂苷H能引起血小板聚集，產(chǎn)生止血作用[29-30]。纖細(xì)薯蕷皂苷有調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤等作用[31]、能夠抑制破骨細(xì)胞的生成及其骨吸收功能[32]。因此除《中國(guó)藥典》2020年版[2]中重樓藥材的3種質(zhì)控指標(biāo)外，滇重樓中其他皂苷的質(zhì)量控制對(duì)臨床應(yīng)用也有一定指導(dǎo)意義。

表5 主成分和主成分得分

本研究以《中國(guó)藥典》2015年版[33]、2020年版[2]規(guī)定的中藥重樓評(píng)價(jià)性指標(biāo)成分重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ作為基礎(chǔ)[2]，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[34-35]常用于滇重樓質(zhì)量評(píng)價(jià)的重樓皂苷Ⅲ、V、H和纖細(xì)薯蕷皂苷共8種甾體皂苷作為HPLC分析的有效成分。本方法通過(guò)考察了不同的色譜柱（Agilent SB-C18柱和Agilent ZORBAX SB-Aq柱）、柱溫（21、25、30 ℃）、體積流量（0.6、0.7、0.8、1.0 mL/min）、流動(dòng)相比例體系，以峰面積的大小、峰型、出峰時(shí)間等為選擇標(biāo)準(zhǔn)，綜合考慮最終確定了最佳的色譜條件，柱溫為25 ℃，體積流量是0.70 mL/min，流動(dòng)相是水（A）和乙腈（B），梯度洗脫程序?yàn)?～10 min，35%～40%B；10～22 min，40%～42%B；22～23 min，42%～40% B；23～38 min，40%B；38～45 min，40%～47% B；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。本方法相較于李懿等[36]建立的6種甾體皂苷（重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、PA、H）含量分析方法的時(shí)間縮短至1/3；較金琳等[37]建立的7種甾體皂苷（重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H）含量分析方法，新增了纖細(xì)薯蕷皂苷，且最后一個(gè)成分重樓皂苷V的出峰時(shí)間提前15 min。本方法采用梯度洗脫法分離滇重樓根莖中8種主要甾體皂苷成分，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H和纖細(xì)薯蕷皂苷在30 min內(nèi)即可完成良好的分離，較黃圓圓等[38]建立的8種甾體皂苷含量UPLC分析方法提前了5 min，達(dá)到了快速分析的要求。本實(shí)驗(yàn)基于HPLC建立的滇重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H和纖細(xì)薯蕷皂苷等8種甾體皂苷的含量測(cè)定方法具有良好的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、和準(zhǔn)確度，為進(jìn)一步全面評(píng)價(jià)滇重樓藥材質(zhì)量提供了一個(gè)新方法。

甾體皂苷作為滇重樓藥材的主要次生代謝產(chǎn)物，其含量的高低影響了滇重樓品質(zhì)的優(yōu)劣[39]。目前《中國(guó)藥典》2020年版[2]重樓標(biāo)準(zhǔn)采用重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ作為質(zhì)量控制指標(biāo)，較《中國(guó)藥典》2015年版[33]則刪除了重樓皂苷Ⅵ。Yue等[40]和黃圓圓等[38]研究結(jié)果顯示不同的采收期、產(chǎn)地滇重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ含量及檢出率均比重樓皂苷Ⅵ高。本研究通過(guò)分析不同生長(zhǎng)年限滇重樓根莖中甾體皂苷含量發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷V和重樓皂苷Ⅵ僅在部分根莖中檢出且含量較低。該結(jié)果與前人報(bào)道一致，說(shuō)明重樓皂苷Ⅵ檢出含量對(duì)滇重樓藥材是否符合限度標(biāo)準(zhǔn)并未造成影響。此外，通過(guò)比較滇重樓根莖的不同部位中8種甾體皂苷總量和重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ三者總量隨生長(zhǎng)年限的變化可知，兩者隨生長(zhǎng)年限的變化趨勢(shì)一致。以上結(jié)果進(jìn)一步證明了《中國(guó)藥典》2020年版[2]刪除重樓皂苷Ⅵ，將重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ作為滇重樓的質(zhì)量控制指標(biāo)是科學(xué)合理的，此舉對(duì)于滇重樓藥材的質(zhì)量控制具有重要的意義。

甾體皂苷作為滇重樓藥材的主要活性成分，其形成和積累與栽培年限密切相關(guān)[41]。Yang等[42]研究發(fā)現(xiàn)4～8年生滇重樓中總皂苷（重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ）含量逐年增加，8～12年生則是逐年遞減。Wu等[43]分析4～13年生滇重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量結(jié)果顯示，重樓總皂苷含量隨著年限的增加先成倍增加，再逐漸減少，最后呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì)，其中8年生達(dá)到最高。本研究發(fā)現(xiàn)滇重樓中甾體皂苷活性成分含量變化隨生長(zhǎng)年限的增加整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，7年生總皂苷（I、II、VII）含量最高，這與前人的研究結(jié)果不盡相同，可能是與藥材的品種和產(chǎn)地有關(guān)。李燕敏等[44]基于莖痕分別對(duì)3～7年、3～8年和3～9年的七葉一枝花樣品進(jìn)行皂苷（重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ）含量分析，結(jié)果顯示不同年限七葉一枝花甾體皂苷的含量總體上呈現(xiàn)隨年限增長(zhǎng)而增加的趨勢(shì)。但本研究表明，甾體皂苷活性成分含量并不是隨著年限的增長(zhǎng)而不斷增加或者降低，而是呈“波浪式”變化，無(wú)規(guī)律。這可能是因?yàn)檠芯繉?duì)象不一致，且不同居群生長(zhǎng)地生態(tài)環(huán)境存在差異。夏從龍等[45]和張燁等[17]研究發(fā)現(xiàn)，滇重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和生長(zhǎng)年限中的積累處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，該結(jié)果與本研究一致，說(shuō)明滇重樓中甾體皂苷的積累與植物自身的生長(zhǎng)年限有關(guān)，但并不意味著種植年限越長(zhǎng)，越有利于重樓皂苷的積累。

傳統(tǒng)認(rèn)為以根莖為藥用部位的藥材，根重大則質(zhì)量?jī)?yōu)，其根重即生物量可作為評(píng)價(jià)藥材優(yōu)劣的重要指標(biāo)[46]。本研究發(fā)現(xiàn)，7～15年生滇重樓根莖生物量均隨生長(zhǎng)年限的增加而增加，可呈增長(zhǎng)緩慢期（第1～4年）、增長(zhǎng)快速期（第5～10年）和增長(zhǎng)平緩期（第11年之后）3個(gè)階段式變化，其中7年生滇重樓根莖生物量增長(zhǎng)速度最快，年增長(zhǎng)量達(dá)（31.843±14.225）g。王元忠等[47]和陳翠等[48]研究發(fā)現(xiàn)，滇重樓植株的根莖生物量均隨生長(zhǎng)年限增加而增加，自6年以后植株根莖生物量積累速度變慢。本研究與之不同，滇重樓種植6年后根莖生物量仍處于增長(zhǎng)快速期，分析原因可能是本次研究的滇重樓藥材栽培年限較長(zhǎng)。

綜上，基于HPLC建立的滇重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H和纖細(xì)薯蕷皂苷8種重樓皂苷的含量分析方法具有良好的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度，便于滇重樓的定量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制；確定適宜的采收期是保證中藥材優(yōu)質(zhì)和保障中藥臨床用藥有效性的重要環(huán)節(jié)，如何把握好中藥材的適宜采收時(shí)機(jī)需要從產(chǎn)量和質(zhì)量?jī)蓚€(gè)方面進(jìn)行綜合考慮[49-50]。本研究結(jié)果顯示，7年生滇重樓根莖中總皂苷含量較高，兼顧根莖生物量與總皂苷含量，建議采收7年生藥材為宜。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Accumulation of steroidal saponins and biomass invar.with different growth years

ZHAO Yan-li, LAI Jia-hui, CAI Chui, ZHANG Bao-de, WEI Chun-mian, PENG Shou-jie, XU Fu-rong

Yunnan Key Laboratory of Southern Medicinal Utilization, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China

To investigate the accumulation regularities of active steroidal saponins and biomass in the rhizomes ofvar.(Franch.) Hand. -Mazz. (PPY) with different growth years, and provide a scientific basis for the quality control of PPY.The 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14 and 15 years old of PPYwere used as the subjects of the study. The content of polyphyllin Ⅰ, polyphyllin Ⅱ, polyphyllin Ⅵ polyphyllin Ⅶ, polyphyllin IⅡ (dioscin), polyphyllin H, polyphyllin V and gracillin in rhizomes of PPYwere determined by HPLC. A direct weighing method was used to determine the dry weight accumulation of PPYwith different growth years.The standard calibration curves of the deteced components were linearly good (2≥0.999 5), and RSDs of precision, reproducibility, stability and average recoveries tests were all lower than 3%, which verified the feasibility of the method. The rhizome biomass of PPY increased with the growing ages. Biomass accumulations of the rhizome could be divided into three stages: slow phase (1st to 4th year), rapid phase (5th to 10th year), steady phase (after 11th year), in which the biomass of 7-year-old rhizome of PPY grew the fastest, with an average annual growth of (31.843 ± 14.225) g. The content of the eight steroidal saponins in the rhizomes of PPY showed random fluctuations and irregularities at different growth years. The total content of polyphyllins (Ⅰ + Ⅱ + Ⅶ) % of the quality control standard ofprescribed by(2020 edition) was consistent with the trend of the sum of the eight steroidal saponins. A comprehensive evaluation of PPYwith different growth years using four principal components showed that the 7-year-old samples were in the top seven of all samples in terms of comprehensive score.In this study, a method was established for the simultaneous determination of the content of eight steroidal saponins in the rhizoms of PPY, which can be used for the quality evaluation of PPYPPY is not planted for a longer period of time the better, it is recommended that the optimum cultivation period is seven years.

Smithvar.(Franch.) Hand.-Mazz.; growing years; polyphyllin Ⅰ; polyphyllin Ⅱ; polyphyllin Ⅵ; polyphyllin Ⅶ; polyphyllin IⅡ; polyphyllin H; polyphyllin V; biomass; quantitative evaluations; dynamic changes

R286.2

A

0253 - 2670(2023)21 - 7156 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.024

2023-03-03

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（82060694）；國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（81860674）；云南省教育廳研究生項(xiàng)目（2022Y365）；云南省科技人才和平臺(tái)計(jì)劃（202105AG070012）；云南省科學(xué)技術(shù)廳中醫(yī)藥聯(lián)合專項(xiàng)-面上項(xiàng)目（202101AZ070001-208）

趙艷麗（1997—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴?、民族藥、天然產(chǎn)物活性及機(jī)制研究。Tel: 15987026834 E-mail: zyl15987026834@163.com

通信作者：徐福榮（1971—），研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)橹兴庂Y源研究與開發(fā)。Tel: 13759178255 E-mail: xfrong99@163.com

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