補(bǔ)腎止顫方對(duì)帕金森病小鼠模型神經(jīng)保護(hù)及抗興奮性氨基酸作用

劉蕾蕾，田心韻，李文濤

補(bǔ)腎止顫方對(duì)帕金森病小鼠模型神經(jīng)保護(hù)及抗興奮性氨基酸作用

劉蕾蕾，田心韻，李文濤*

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200000

研究補(bǔ)腎止顫方對(duì)帕金森病小鼠模型神經(jīng)保護(hù)及抗興奮性氨基酸作用。采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶鹽酸鹽（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）誘導(dǎo)帕金森病小鼠模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、金剛烷胺（41.1 mg/kg）組和補(bǔ)腎止顫方低、中、高劑量（6.6、9.9、19.8 g/kg）組，每組8只。連續(xù)14 d給藥干預(yù)后，通過(guò)爬桿和自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠行為學(xué)，并選擇補(bǔ)腎止顫方最佳作用劑量用于后續(xù)研究；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腦組織病理變化；ELISA法測(cè)定外周血谷氨酸含量；Western blotting和qRT-PCR法檢測(cè)小鼠黑質(zhì)紋狀體酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（dopamine transporter，DAT）、興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1（excitatory amino acid transporter 1，EAAT1）、YY-1、β-catenin蛋白和、、、mRNA表達(dá)。與模型組比較，補(bǔ)腎止顫方組小鼠行為學(xué)癥狀顯著改善（＜0.05、0.001），紋狀體區(qū)域細(xì)胞整體形態(tài)與排列情況得到改善，黑質(zhì)紋狀體TH、DAT表達(dá)顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），外周血谷氨酸含量顯著降低（＜0.001），黑質(zhì)紋狀體YY1表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01、0.001），EAAT1表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.001），β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。補(bǔ)腎止顫方對(duì)帕金森病小鼠多巴胺能神經(jīng)元有一定保護(hù)作用，其機(jī)制可能與通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控EAAT1表達(dá)，從而減少過(guò)量的谷氨酸有關(guān)。

補(bǔ)腎止顫方；帕金森病；神經(jīng)保護(hù)；興奮性氨基酸毒性；地黃苷D；腺苷；尿囊素；莫諾苷；馬錢(qián)苷；2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2--β--葡萄糖苷；大黃素；松果菊苷；毛蕊花糖苷

帕金森病是僅次于阿爾茨海默病位于第2位的神經(jīng)退行性疾病[1]。隨著人口老齡化，帕金森病患者有不斷增多趨勢(shì)，預(yù)計(jì)2030年全球65歲以上的老年人中3%將會(huì)患有帕金森病[2]，臨床以多巴胺替代治療為主的帕金森病藥物屬于對(duì)癥治療的范疇[3]，但不能阻止疾病發(fā)展。因此研究具有神經(jīng)保護(hù)作用、延緩疾病發(fā)展的藥物具有重要意義。帕金森病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病因與年齡、遺傳、飲食及生活習(xí)慣、環(huán)境等有關(guān)，病變機(jī)制涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、免疫及神經(jīng)炎癥、線粒體功能障礙、興奮性氨基酸神經(jīng)毒性等，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性死亡。

補(bǔ)腎止顫方來(lái)源于經(jīng)典名方六味地黃丸，是本課題組多年臨床治療帕金森病的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎止顫方能改善帕金森病患者的運(yùn)動(dòng)癥狀震顫，強(qiáng)直和動(dòng)作遲緩等精神癥狀，睡眠障礙和自主神經(jīng)功能障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀[4-5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎止顫方聯(lián)合左旋多巴能顯著增強(qiáng)興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1（excitatory amino acid transporter 1，EAAT1）蛋白表達(dá)，而對(duì)EAAT2沒(méi)有增強(qiáng)作用，提示補(bǔ)腎止顫方可能有一定抗興奮性氨基酸毒性作用[6]。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶鹽酸鹽（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）誘導(dǎo)的帕金森病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪怯写硇缘难芯磕Ｐ?，其作用機(jī)制是MPTP進(jìn)入體內(nèi)，在單胺氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化為1-甲基-4-苯基吡啶（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+）產(chǎn)生類似帕金森病癥狀。而且研究發(fā)現(xiàn)，該小鼠模型可檢測(cè)到紋狀體谷氨酸升高，可以作為研究興奮性氨基酸毒性的模型[7]。本研究選擇MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，系統(tǒng)研究補(bǔ)腎止顫方抗興奮性氨基酸毒性的作用，為補(bǔ)腎中藥治療帕金森病的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠48只，7周齡，體質(zhì)量（20±5）g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)20180004064117，許可證號(hào)SCXK（滬）2018-0004。實(shí)驗(yàn)室溫度20～22 ℃，相對(duì)濕度45%～65%，明暗光照。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2021028）。

1.2 藥材

補(bǔ)腎止顫方由熟地黃、山藥、山茱萸、制何首烏、肉蓯蓉組成，每味中藥均為顆粒，由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，以上藥材經(jīng)該公司質(zhì)量管理部分別鑒定為玄參科植物地黃Libosch的新鮮或干燥塊根的炮制加工品、薯蕷科植物薯蕷Thunb.的干燥根莖、山茱萸科植物山茱萸Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉、蓼科植物何首烏Thunb.的干燥塊根的炮制加工品、列當(dāng)科植物管花肉蓯蓉(Schenk) Wight的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖。

1.3 藥品與試劑

金剛烷胺片（0.1 g/片，批號(hào)H31021561）購(gòu)自上海市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科；MPTP（批號(hào)HY-15608）購(gòu)自美國(guó)Med Chem Express公司；抗兔二抗（批號(hào)A051）、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)AF118）、BCA試劑盒（批號(hào)P0010S）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗體（批號(hào)ab1532Y）、兔抗多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（dopamine transmitter transporter，DAT）抗體（批號(hào)ab184451）、兔抗EAAT1抗體（批號(hào)ab181036）、兔抗YY1抗體（批號(hào)ab10923）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Prime ScriptTMRT Master Mix TaKaRa（批號(hào)RR036A）、SYBR Prime Ex TaqTMTaKaRa（批號(hào)RR420A）購(gòu)自寶生物工程有限公司；10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（批號(hào)PG212）、化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)SQ201）購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；聚偏二氟乙烯膜（批號(hào)PR00509）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；Trizol（批號(hào)15596-026）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；β-catenin抗體（批號(hào)8480）購(gòu)自美國(guó)CST公司；谷氨酸試劑盒（批號(hào)BC1585）購(gòu)自上海索萊寶生化科技有限公司。

1.4 儀器

JX-FSTPRP48型組織勻漿機(jī)（上海凈信科技）；ABI Stepone plus型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；ME1002/02型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；DMIL型倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；E6006型SDS-PAGE蛋白系統(tǒng)裝置（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；ChenmiDoc XRS型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 補(bǔ)腎止顫方的制備

分別取熟地黃、山藥、山茱萸、制何首烏、肉蓯蓉飲片，加水煎煮，濾過(guò)，濾液濃縮成清膏（干浸膏出膏率為44.0%～76.5%），加輔料適量干燥（或干燥粉碎），再加輔料適量混勻，制粒即制成各配方顆粒。每制成1000 g顆粒，所需各中藥飲片分別為熟地黃飲片1300 g、山藥飲片4000 g、山茱萸飲片1200 g、制何首烏飲片4000 g、肉蓯蓉飲片2200 g。補(bǔ)腎止顫方由熟地黃配方顆粒、山藥配方顆粒、山茱萸配方顆粒、制何首烏配方顆粒、肉蓯蓉配方顆粒按照12∶12∶12∶3∶9比例混合制成。

按照《中國(guó)藥典》2020年版通則0512高效液相色譜法測(cè)定各中藥的主要成分含量，作為各中藥配方顆粒的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。其中熟地黃配方顆粒每克含地黃苷D（C27H42O20）為0.70～2.70 mg；山藥配方顆粒每克含腺苷（C10H13N5O4）為0.30～1.50 mg、尿囊素（C4H6N4O3）為7.0～42.0 mg；山茱萸配方顆粒每克含莫諾苷（C17H26O11）和馬錢(qián)苷（C17H26O10）為16.0～31.0 mg；制何首烏配方顆粒每克含2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2--β--葡萄糖苷（C20H22O9）為15.4～55.5 mg、大黃素（C15H10O5）為0.27～1.13 mg；肉蓯蓉配方顆粒每克含松果菊苷（C35H46O20）和毛蕊花糖苷（C29H36O15）為30.0～100.0 mg。

2.2 帕金森病模型的建立、分組及給藥

C57BL/6J小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照文獻(xiàn)方法[8-9]ip MPTP（25 mg/kg）建立帕金森病小鼠模型，對(duì)照組ip等體積生理鹽水，連續(xù)10 d。觀察小鼠行為學(xué)改變，包括震顫、后腿拉直、躬背、豎毛、運(yùn)動(dòng)減少。檢測(cè)小鼠黑質(zhì)及紋狀體區(qū)域TH、DAT表達(dá)，評(píng)估模型是否成功。造模完成后，小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、金剛烷胺片（41.1 mg/kg）組和補(bǔ)腎止顫方低、中、高劑量（6.6、9.9、19.8 g/kg）組，每組8只。各給藥組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d。

2.3 行為學(xué)檢測(cè)

觀察小鼠行為學(xué)改變，包括一過(guò)性的震顫、后腿拉直、躬背、豎毛、運(yùn)動(dòng)減少。

2.3.1 爬桿實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[10]，造模前3 d各組小鼠進(jìn)行適應(yīng)性爬桿實(shí)驗(yàn)，末次給藥1 h后進(jìn)行小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。選取直徑1.5 cm、高60 cm的不銹鋼直立桿，紗布纏裹棉球?yàn)?5 cm左右圓球置于桿頂固定，底部金屬底座固定。將小鼠頭朝上置于爬桿頂部，使其自然順桿而下，記錄小鼠爬向底部時(shí)間。

2.3.2 自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[11]，末次給藥1 h后進(jìn)行自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)。于自制30 cm×30 cm×15 cm的有機(jī)玻璃盒中，底部刻出6 cm×6 cm的格子，在安靜、光線較暗的環(huán)境中檢測(cè)，計(jì)數(shù)5 min內(nèi)小鼠移動(dòng)的格子數(shù)和站立的次數(shù)，連續(xù)測(cè)定3次，取平均值。

2.4 樣品收集

在行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，ip舒泰50（50～75 mg/kg）麻醉小鼠，采用抗凝管取小鼠眼球血，室溫靜置1 h，3000 r/min離心15 min，取上清轉(zhuǎn)入凍存管內(nèi)于?80 ℃保存，作為后續(xù)谷氨酸含量檢測(cè)。在完成小鼠眼球取血后，使用精密的手術(shù)刀片從正中線分離出小鼠的黑質(zhì)和紋狀體組織，然后用鑷子鈍性分離，將分離出的黑質(zhì)和紋狀體放入離心管內(nèi)，經(jīng)過(guò)液氮速冷凍，最后將其放入?80 ℃儲(chǔ)存，用于Western blotting及qRT-PCR檢測(cè)。

2.5 ELISA測(cè)定外周血清谷氨酸含量

取各組小鼠外周血，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定谷氨酸含量。

2.6 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腦組織病理變化

取各組小鼠固定后的腦組織，進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后，用HE染色，顯微鏡下觀察腦組織病理變化。

2.7 Western blotting檢測(cè)黑質(zhì)紋狀體TH、DAT、EAAT1、YY1、β-catenin蛋白表達(dá)

取各組小鼠黑質(zhì)紋狀體，采用含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑蛋白質(zhì)裂解液處理腦組織提取總蛋白，經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量，加入上樣緩沖液混合，100 ℃加熱15 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，然后加入二抗，室溫孵育2 h，采用化學(xué)法發(fā)光試劑進(jìn)行檢測(cè)，凝膠成像儀顯影拍照，Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

2.8 qRT-PCR檢測(cè)黑質(zhì)紋狀體TH、DAT、EAAT1、YY1 mRNA表達(dá)

取各組小鼠黑質(zhì)紋狀體，采用Trizol法提取腦組織中總RNA。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入引物，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒檢測(cè)采用PCR核酸擴(kuò)增儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火45 s，共40個(gè)循環(huán)，采用2?ΔΔCt法進(jìn)行分析，引物序列見(jiàn)表1。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)腎止顫方對(duì)帕金森病小鼠行為學(xué)的影響

模型小鼠行為上都表現(xiàn)出一定程度的震顫、后腿拉直、躬背、豎毛、運(yùn)動(dòng)減少等帕金森病典型表征，說(shuō)明造模成功。如圖1所示，與模型組比較，補(bǔ)腎止顫方高劑量組和金剛烷胺組小鼠爬桿時(shí)間顯著縮短（＜0.001），補(bǔ)腎止顫方高劑量組小鼠自主活動(dòng)步數(shù)顯著增多（＜0.001）。因此，選擇補(bǔ)腎止顫方高劑量組進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)觀察。

表1 引物序列

3.2 補(bǔ)腎止顫方對(duì)帕金森病小鼠腦組織病理變化的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠紋狀體區(qū)域細(xì)胞數(shù)量減少，排列疏松，胞體輪廓模糊，胞核固縮與空泡變性增多；與模型組比較，金剛烷組小鼠紋狀體區(qū)域細(xì)胞狀態(tài)改善不明顯，補(bǔ)腎止顫方高劑量組小鼠紋狀體區(qū)域細(xì)胞整體形態(tài)及排列情況得到改善。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，下圖同

圖2 補(bǔ)腎止顫方對(duì)帕金森病小鼠腦組織病理變化的影響(HE, ×100)

3.3 補(bǔ)腎止顫方對(duì)帕金森病小鼠黑質(zhì)紋狀體TH、DAT蛋白和mRNA表達(dá)的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠黑質(zhì)紋狀體TH、DAT蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01、0.001）；與模型組比較，補(bǔ)腎止顫方高劑量組小鼠黑質(zhì)紋狀體TH、DAT蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001）。

3.4 補(bǔ)腎止顫方對(duì)帕金森病小鼠外周血谷氨酸含量的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠外周血谷氨酸含量顯著增加（＜0.001）；與模型組比較，補(bǔ)腎止顫方高劑量組外周血谷氨酸含量顯著減少（＜0.001）。

圖3 補(bǔ)腎止顫方對(duì)帕金森病小鼠黑質(zhì)紋狀體TH、DAT蛋白和mRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

圖4 補(bǔ)腎止顫方對(duì)帕金森病小鼠外周血谷氨酸含量的影響(, n = 3)

3.5 補(bǔ)腎止顫方對(duì)帕金森病小鼠黑質(zhì)紋狀體EAAT1、YY1、β-catenin蛋白和EAAT1、YY1 mRNA表達(dá)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠黑質(zhì)紋狀體EAAT1蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.001），YY1蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.001），β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎止顫方高劑量組黑質(zhì)紋狀體YY1蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01、0.001），EAAT1蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.001），β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。

4 討論

帕金森病是由遺傳、感染、藥物、氧化應(yīng)激等導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元中多巴胺含量下降或相應(yīng)受體退行性改變而引起的一種神經(jīng)元退行性病變[12-13]。目前治療方法有藥物治療、外科手術(shù)、細(xì)胞移植及基因治療等[3]，外科手術(shù)如立體定向蒼白球或丘腦損毀術(shù)創(chuàng)傷較大，代價(jià)昂貴，適應(yīng)對(duì)象受限，不是一種理想方法。而細(xì)胞移植及基因技術(shù)目前還不成熟，主要在實(shí)驗(yàn)階段，因此以多巴胺替代的藥物治療仍是主要方法，雖然短期內(nèi)可以減輕患者癥狀，但多巴制劑長(zhǎng)期應(yīng)用后會(huì)帶來(lái)癥狀波動(dòng)、運(yùn)動(dòng)障礙、精神癥狀等多種不良反應(yīng)，不但療效減退，也無(wú)法延緩疾病進(jìn)展，因此臨床上迫切需要能延緩疾病發(fā)展、不良反應(yīng)小、適宜長(zhǎng)期服用的有效藥物[14]。

圖5 補(bǔ)腎止顫方對(duì)帕金森病小鼠黑質(zhì)紋狀體EAAT1、YY1、β-catenin蛋白和EAAT1、YY1 mRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

帕金森病屬于中醫(yī)“顫病”范疇，在古籍中關(guān)于帕金森病因有諸多記載，如《素問(wèn)·至真要大論》“諸暴強(qiáng)直，皆屬于風(fēng)”“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”[15]指出肝風(fēng)與帕金森病關(guān)系密切。明代孫一奎提出“木火上盛，腎陰不充，實(shí)為痰火，下虛上實(shí)，虛則腎虧”，指出帕金森病的病變可能與肝腎有關(guān)[16]。課題組在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，肝腎虧虛是帕金森病的根本內(nèi)因，不但震顫等運(yùn)動(dòng)癥狀與肝腎虧虛有關(guān)，也是各種非運(yùn)動(dòng)癥狀及運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥治療取效的關(guān)鍵[17-18]，臨床薈萃分析的證候研究中發(fā)現(xiàn)“肝腎虧虛”是帕金森病最主要的證候[19]。近年來(lái)，在帕金森病相關(guān)中醫(yī)專家共識(shí)[20-21]中也指出帕金森病以肝腎不足為本，風(fēng)、痰、瘀等為標(biāo)。治療強(qiáng)調(diào)滋補(bǔ)肝腎為根本治法，同時(shí)結(jié)合辨證論治以達(dá)到調(diào)整臟腑功能及氣血陰陽(yáng)平衡，以及延緩疾病發(fā)展。

補(bǔ)腎止顫方來(lái)源于經(jīng)典補(bǔ)腎名方六味地黃丸，由熟地黃、山藥、山茱萸、制何首烏、肉蓯蓉組成。在六味地黃丸主要藥物熟地黃、山藥、山茱萸基礎(chǔ)上，加肉蓯蓉溫補(bǔ)腎陽(yáng)，制何首烏補(bǔ)肝腎，益精血。全方補(bǔ)腎為主，肝腎兼顧；滋陰為主，陰陽(yáng)并補(bǔ)，能夠改善帕金森病患者的運(yùn)動(dòng)及非運(yùn)動(dòng)癥狀，顯示出一定治療帕金森病的作用[22]，臨床研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎止顫方有效改善帕金森病非運(yùn)動(dòng)癥狀和生活質(zhì)量，并可能有延緩帕金森病進(jìn)展的作用[4-5]。

帕金森病機(jī)制復(fù)雜且尚未完全清楚，但興奮性氨基酸的過(guò)度活躍是其主要機(jī)制之一[23]。谷氨酸作為中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，參與神經(jīng)元生理功能[24]。過(guò)量的谷氨酸使得興奮性氨基酸受體（excitatory amino acid receptor，EAAR）被持續(xù)激活，離子通道開(kāi)放，大量鈣離子內(nèi)流，導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度持續(xù)增加，使脫氧核糖核酸酶、蛋白酶和磷酯酶等激活，引起DNA、蛋白質(zhì)和磷脂降解，最終使神經(jīng)元變性或壞死[25-26]。EAATs能將過(guò)量的谷氨酸清除，其中EAAT1是主要轉(zhuǎn)運(yùn)體之一，位于星形膠質(zhì)細(xì)胞胞膜上，對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)中谷氨酸穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[24]，但EAAT1在翻譯和轉(zhuǎn)錄水平上受到多種機(jī)制的調(diào)節(jié)，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控是主要機(jī)制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠表現(xiàn)出一定程度的震顫、后腿拉直、躬背、豎毛、運(yùn)動(dòng)減少等帕金森病表征。同時(shí)多巴胺前體物質(zhì)TH、DAT作為多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)志物，在模型小鼠中表達(dá)顯著增加表明該模型具備帕金森病的臨床及病理特征。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎止顫方高劑量組小鼠的自主活動(dòng)步數(shù)顯著增多，爬桿時(shí)間顯著減少，運(yùn)動(dòng)遲緩及震顫等帕金森病臨床癥狀得到緩解。表明高劑量的補(bǔ)腎止顫方能顯著改善小鼠的行為癥狀。與模型組比較，補(bǔ)腎止顫方組小鼠紋狀體區(qū)域細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量及排列情況得到改善，TH、DAT蛋白及mRNA表達(dá)顯著增高，表明該方具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎止顫方組谷氨酸水平顯著降低，同時(shí)EAAT1蛋白及mRNA表達(dá)水平升高，β-catenin蛋白表達(dá)水平升高，YY1蛋白及mRNA表達(dá)水平降低，表明補(bǔ)腎止顫方可能通過(guò)調(diào)控β-catenin及YY1轉(zhuǎn)錄因子，提高EAAT1的表達(dá)，從而清除過(guò)量的谷氨酸，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和治療帕金森病的作用，但該機(jī)制仍需通過(guò)進(jìn)一步的敲減或過(guò)表達(dá)模型來(lái)證實(shí)。

綜上，以滋補(bǔ)肝腎立方的補(bǔ)腎止顫方初步顯示出對(duì)帕金森病的治療作用，其機(jī)制可能與抗興奮性氨基酸毒性有關(guān)。帕金森病病機(jī)與“風(fēng)痰瘀虛毒”等有關(guān)，肝腎虧虛是根本，風(fēng)陽(yáng)化熱、痰瘀滯化毒為標(biāo)。從滋補(bǔ)肝腎入手，有可能為延緩帕金森病的發(fā)展，提供一種中醫(yī)藥的治療方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1]Lill C M, Klein C. Epidemiologie und ursachen der Parkinson-erkrankung [J]., 2017, 88(4): 345-355.

[2]Qi S G, Yin P, Wang L H,. Prevalence of Parkinson’s disease: A community-based study in China [J]., 2021, 36(12): 2940-2944.

[3]Fox S H, Katzenschlager R, Lim S Y,. International Parkinson and movement disorder society evidence-based medicine review: Update on treatments for the motor symptoms of Parkinson’s disease [J]., 2018, 33(8): 1248-1266.

[4]高晗, 蔡麗, 王煒為, 等. 補(bǔ)腎止顫方加減治療肝腎不足型帕金森病的隨機(jī)對(duì)照研究 [J]. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2021, 35(2): 8-11.

[5]張凌凌, 高晗, 索李慧, 等. 補(bǔ)腎止顫方顆粒治療肝腎不足型帕金森病的療效觀察 [J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2021, 36(2): 256-259.

[6]Li W H, Gao H, Li W T. Effects of combined Bushen Zhichan Recipe and levodopa in a rodent model of Parkinson disease: Potential mechanisms [J]., 2020, 26: e922345.

[7]Bagga P, Pickup S, Crescenzi R,.GluCEST MRI: Reproducibility, background contribution and source of glutamate changes in the MPTP model of Parkinson’s disease [J]., 2018, 8: 2883.

[8]阮克鋒, 張丹, 洪燕龍, 等. 止顫顆粒聯(lián)合美多芭對(duì)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶引起亞急性帕金森病模型小鼠的藥效學(xué)研究 [J]. 中草藥, 2016, 47(19): 3456-3462.

[9]Jackson-Lewis V, Przedborski S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson’s disease [J]., 2007, 2(1): 141-151.

[10]Meng F H, Wang J H, Ding F X,. Neuroprotective effect of matrine on MPTP-induced Parkinson’s disease and on Nrf2 expression [J]., 2017, 13(1): 296-300.

[11]Kawai H, Makino Y, Hirobe M,. Novel endogenous 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline derivatives: Uptake by dopamine transporter and activity to induce Parkinsonism [J]., 2002, 70(2): 745-751.

[12]Beal M F. Experimental models of Parkinson’s disease [J]., 2001, 2(5): 325-332.

[13]Dauer W, Przedborski S. Parkinson’s disease: Mechanisms and models [J]., 2003, 39(6): 889-909.

[14]李文濤, 李如奎. 帕金森病中醫(yī)治療之管見(jiàn) [J]. 陜西中醫(yī), 2006, 27(3): 315-317.

[15]李元, 王順, 白妍, 等. 帕金森病藥源性異動(dòng)癥中醫(yī)治療研究進(jìn)展 [J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2023, 25(4): 68-72.

[16]王雯, 邱志新, 鄭建彪, 等. 芪參還五膠囊治療氣血虧虛型帕金森病的臨床效果 [J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2023, 20(5): 67-70.

[17]崔笑玉, 李文濤, 李如奎. 中西醫(yī)結(jié)合治療肝腎陰虛型帕金森病非運(yùn)動(dòng)癥狀38例臨床研究 [J]. 江蘇中醫(yī)藥, 2015, 47(2): 30-31.

[18]崔笑玉, 李文濤. 李如奎教授帕金森病辨治思路及組方研究 [J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志, 2015, 13(11): 1349-1350.

[19]顧超, 袁燦興. 帕金森病的中醫(yī)證型分布和用藥規(guī)律探析 [J]. 上海中醫(yī)藥雜志, 2013, 47(7): 12-14.

[20]雒曉東, 李哲, 朱美玲, 等. 帕金森病 (顫拘病) 中醫(yī)臨床診療專家共識(shí) [J]. 中醫(yī)雜志, 2021, 62(23): 2109-2116.

[21]劉振國(guó), 李文濤. 帕金森病運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥中西醫(yī)結(jié)合診治專家共識(shí) (2020) [J]. 中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志, 2020, 27(4): 247-252.

[22]薛紅, 虢周科, 劉璇. 六味地黃丸對(duì)帕金森患者自主神經(jīng)功能的影響 [J]. 中醫(yī)學(xué)報(bào), 2010, 25(2): 283-285.

[23]Carrillo-Mora P, Silva-Adaya D, Villase?or-Aguayo K. Glutamate in Parkinson’s disease: Role of antiglutamatergic drugs [J]., 2013, 3(3): 147-157.

[24]Wang J, Wang F S, Mai D M,. Molecular mechanisms of glutamate toxicity in Parkinson’s disease [J]., 2020, 14: 585584.

[25]Parkin G M, Udawela M, Gibbons A,. Glutamate transporters, EAAT1 and EAAT2, are potentially important in the pathophysiology and treatment of schizophrenia and affective disorders [J]., 2018, 8(2): 51-63.

[26]Iovino L, Tremblay M E, Civiero L. Glutamate-induced excitotoxicity in Parkinson’s disease: The role of glial cells [J]., 2020, 144(3): 151-164.

Effect of Bushen Zhichan Prescription on neuroprotection and anti-excitatory amino acid in mice with Parkinson’s disease

LIU Lei-lei, TIAN Xin-yu, LI Wen-tao

Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200000, China

To study the effect of Bushen Zhichan Prescription (補(bǔ)腎止顫方) on neuroprotection and anti-excitatory amino acid in mice model with Parkinson’s disease.A mouse model of Parkinson’s disease was induced by 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine hydrochloride (MPTP). The mice were randomly divided into control group, model group, amantadine hydrochloride (41.1 mg/kg) group, and Bushen Zhichan Prescription low-, medium-, high-dose (6.6, 9.9, 19.8 g/kg) groups, with eight mice in each group. After 14 consecutive days of administration intervention, the behavior of mice was evaluated through pole climbing and autonomous activity experiments, and the optimal dosage of Bushen Zhichan Prescription was selected for subsequent research; Hematoxylin eosin (HE) staining was used to observe pathological changes in brain tissue; ELISA method was used to measure the content of glutamate in peripheral blood; Western blotting and qRT-PCR methods were used to detect tyrosine hydroxylase (TH), dopamine transporter (DAT), excitatory amino acid transporter 1 (EAAT1), YY-1, β-catenin protein and,,,mRNA expressions in nigrostriatal tissue of mice.Compared with model group, the behavioral symptoms of mice in Bushen Zhichan Prescription group were significantly improved (< 0.05, 0.001), the overall morphology and arrangement of cells in striatum area were improved, the expressions of TH and DAT in nigrostriatal tissue were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001), glutamine content in peripheral blood was significantly reduced (< 0.001), YY1 expression level in nigrostriatal tissue was significantly reduced (< 0.01, 0.001), EAAT1 expression level was significantly increased (< 0.05, 0.001), β-catenin expression level was significantly increased (< 0.05).Bushen Zhichan Prescription has a certain protective effect on dopaminergic neurons in mice with Parkinson’s disease, and its mechanism may be related to reducing excessive glutamate through transcriptional regulation of EAAT1 expression.

Bushen Zhichan Prescription; Parkinson’s disease; neuroprotection; excitatory amino acid toxicity; rehmannioside D;adenosine; allantoin;morroniside; loganin;2,3,5,4′-tetrahydroxyl diphenylethylene-2--β--glucoside;emodin;echinacoside;verbascoside

R285.5

A

0253 - 2670(2023)21 - 7096 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.018

2023-07-23

上海市科委自然基金項(xiàng)目（22ZR1459300）；上海市十三五重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目（shslczdzk04901）；上海市中醫(yī)醫(yī)院未來(lái)計(jì)劃項(xiàng)目（WL-HBBD-2021002K）

劉蕾蕾，碩士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥治療神經(jīng)系統(tǒng)疑難病。E-mail: 857591844@qq.com

通信作者：李文濤，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥治療神經(jīng)系統(tǒng)疑難病。E-mail: lwt1132@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]