西洋參中2個新型丙二酰人參皂苷的分離鑒定

崔 穎，武建發(fā)，屈春園，李嘉星，李澤文，劉 志

?化學成分?

西洋參中2個新型丙二酰人參皂苷的分離鑒定

崔 穎，武建發(fā)，屈春園，李嘉星，李澤文，劉 志*

吉林農業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118

對西洋參鮮根中丙二酰人參皂苷化學成分進行研究。采用80%乙醇水超聲提取，依次用石油醚和正丁醇萃取，用D101大孔吸附樹脂、硅膠干柱、ODS硅膠柱和半制備型高效液相色譜對提取物進行分離純化；利用高分辨質譜和核磁共振波譜等譜學技術對化合物結構進行解析與鑒定。從西洋參鮮根80%乙醇提取物的D101大孔樹脂60%乙醇水洗脫部位中分離鑒定出2個丙二酰人參皂苷，分別鑒定為3--[6--丙二?；?β吡喃葡萄糖基- (1→2)-β吡喃葡萄糖基]-20--[β吡喃葡萄糖基-(1→6)-β吡喃葡萄糖基]-達瑪-23-烯-3β,12β,20(),25-四醇（1）和3--[6--丙二酰基-β吡喃葡萄糖基-(1→2)-β吡喃葡萄糖基]-20--[β吡喃葡萄糖基-(1→6)-β吡喃葡萄糖基]-達瑪-22-烯-3β,12β,20(),25-四醇（2）?；衔?和2為新化合物，分別命名為丙二酰三七皂苷A（malonyl notoginsenoside A）和丙二酰高麗人參皂苷R2（koryoginsenoside R2）。

西洋參；丙二酰三七皂苷A；丙二酰高麗人參皂苷R2；丙二酰人參皂苷；丙二酰基團

西洋參L. 為五加科多年生草本植物，在中國、美國、加拿大和法國均有種植[1-3]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，西洋參具有抗糖尿病、抗氧化、抗炎和抗腫瘤的活性[4-7]。作為世界性的暢銷藥材之一，西洋參已廣泛應用于臨床用藥和保健食品，在《中國藥典》、和等藥典中均有收錄。植物化學研究表明，中性人參皂苷（如人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3、Rh2和CK）和丙二酰人參皂苷（malonyl ginsenoside，MG，如MG-Rb1、MG-Rb2、MG-Rc、MG-Rd、MG-Rg1和MG-Re）是西洋參中的主要生物活性成分[8]。MG是西洋參中的天然原生苷，約占人參皂苷含量的50%，具有抗糖尿病、調血脂和保護神經系統(tǒng)等作用[9-10]。然而，與中性人參皂苷不同，MG因具有熱不穩(wěn)定性而難以分離、鑒定和檢測，導致西洋參中MG測定的不準確，嚴重影響了西洋參的質量評價及其藥理作用研究。因此，為了充分利用西洋參的藥用資源并擴大其應用范圍，本課題組對西洋參根中的化學成分進行了深入研究，并從其鮮根的80%乙醇提取物的D101大孔樹脂60%乙醇水洗脫部位中分離鑒定了2個新化合物，分別為3--[6--丙二酰基-β吡喃葡萄糖基-(1→2)-β吡喃葡萄糖基]-20--[β吡喃葡萄糖基-(1→6)-β吡喃葡萄糖基]-達瑪-23-烯-3β, 12β,20(),25-四醇{3--[6--malonyl-βglucopyra- nosyl-(1→2)-βglucopyranosyl]-20--[βglucopyra- nosyl-(1→6)-βglucopyranosyl]-dammar-23-ene-3β, 12β,20(),25-tetraol，1}和3--[6--丙二?；?β吡喃葡萄糖基-(1→2)-β吡喃葡萄糖基]-20--[β吡喃葡萄糖基-(1→6)-β吡喃葡萄糖基]-達瑪-22-烯-3β,12β,20(),25-四醇{3--[6--malonyl-βglucopyranosyl-(1→2)-βglucopyranosyl]-20--[βglucopyranosyl-(1→6)-βglucopyranosyl]-dammar- 22-ene-3β,12β,20(),25-tetraol，2}。化合物1和2為新化合物，分別命名為丙二酰三七皂苷A（malonyl notoginsenoside A）和丙二酰高麗人參皂苷R2（koryoginsenoside R2）。

1 儀器與材料

Bruker AV III 600型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司），LCMS-IT-TOF型質譜儀（析邁科學儀器有限公司），COSMOSIL 5C18-MS-II型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本Nacalai Tesque公司），KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器公司），LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司），ELSD-UM5800 Plus型蒸發(fā)光檢測器（上海通微分析技術有限公司），Telstar*LyoQuest型冷凍干燥機（北京昊諾斯科技有限公司），METTLER TOLEDO型電子分析天平（梅特勒-托利多國際貿易有限公司），D101大孔樹脂（青島海洋化工廠），ODS反相硅膠色譜柱（日本YMC公司），薄層硅膠板（青島海洋化工廠），200～300目柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；色譜純乙腈（美國Fisher公司），分析純甲醇、無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、醋酸、醋酸乙酯（北京化工廠）。

西洋參于2021年采購自吉林省撫松縣，經吉林農業(yè)大學中藥材學院鄭毅男教授鑒定為4年生西洋參L. 的新鮮根部。

2 方法

2.1 提取與分離

取5 kg西洋參鮮根切碎，用10倍量的80%乙醇水超聲提取5次，每次1 h；將濾液合并濃縮至干，加入適量水溶解后用等體積的石油醚反復萃取4～5次，再用水飽和正丁醇反復萃取4～5次后得到正丁醇層和水層部分。水層部分濃縮后，用D101大孔樹脂柱進行柱色譜，依次以水、30%乙醇水和60%乙醇水為流動相梯度洗脫，收集洗脫液濃縮得到水相、30%乙醇水相和60%乙醇水相。

將60%乙醇水相減壓回收至無醇味后冷凍干燥，稱取10 g凍干粉末，甲醇溶解，采用ODS反相硅膠柱，以甲醇-水（20%～80%）梯度洗脫，得到3個流分Fr. 1～3。取流分Fr. 1（0.68 g）采用硅膠干柱色譜，以三氯甲烷-甲醇-水（6∶4∶1）為流動相等度洗脫，得到4個組分Fr. 1-1～1-4。組分Fr. 1-1采用半制備高效液相制備純化（203 nm，35%乙腈，COSMOSIL 5C18-MS-II，2.5 mL/min），得到化合物1（15 mg，R＝12.4 min，2 mL/min）和2（17 mg，R＝13.6 min，2 mL/min）。

2.2 化合物的酸水解反應

稱取待測化合物2 mg，加濃度為2 mol/L的H2SO4溶液2 mL，90 ℃回流反應2 h，然后用NaOH溶液中和至pH 7，用等體積的醋酸乙酯萃取3次。收集水層濃縮至干，采用HPLC-ELSD測定糖的種類。

3 結構鑒定

化合物1：白色無定形粉末，熔點197～200 ℃，極易溶于甲醇，Libermann-Burchard和Molish反應均為陽性，與10%的濃硫酸-乙醇溶液于薄層色譜硅膠板上加熱后顯紫紅色，提示該化合物可能為三萜皂苷類化合物。由高分辨質譜得1 249.561 1 [M＋K]+（理論值1 249.562 0，C57H94KO27），結合其1H-和13C-NMR譜圖，確定其分子式為C57H94O27。

化合物1的13C-NMR (100 MHz, Pyr-5) 譜共給出57個碳信號，低場區(qū)觀察到142.58 和123.72特征雙鍵碳信號，提示分子中可能存在雙鍵，以及羰基的特征碳信號172.90 和171.28，同時還觀察到105.46、106.29、98.68、105.30，推測為糖基的端基碳信號；結合DEPT譜圖，在低場區(qū)觀察到8個甲基碳信號16.83、17.13、17.37、17.94、24.13、28.90、30.89和31.17。結合1H-NMR (400 MHz, Pyr-d) 譜中高場區(qū)給出的8個特征單峰甲基質子信號0.91 (3H, s)、0.98 (3H, s)、1.11 (3H, s)、1.16 (3H, s)、1.36 (3H, s)、1.71 (3H, s)、1.70 (6H, s)，根據HMQC和HMBC譜，將其分別歸屬于C-18 (16.83)、C-30 (17.94)、C-29 (17.37)、C-19 (17.13)、C-28 (28.90)、C-21 (24.13)、C-26 (31.17)、C-27 (31.17)，綜上推測該化合物為含有2個羰基和1個碳碳雙鍵的達瑪烷型四環(huán)三萜四糖苷。

與文獻對比后，化合物1與三七皂苷A（notoginsenoside A）[11]的碳信號基本一致，但多出3個碳信號171.2、5.60和172.90，與MG-Rb1[12]對比后發(fā)現(xiàn)，這些信號為丙二酰基的特征碳信號。酸水解實驗結果表明分子中有葡萄糖的存在，結合13C-NMR及1H-NMR低場區(qū)的4個端基質子信號4.96 (1H, d,= 7.2 Hz), 5.33 (1H, d,= 7.7 Hz), 5.26 (1H, d,= 7.6 Hz), 5.10 (1H, d,= 7.8 Hz)，進一步確定結構中存在4個葡萄糖基（Glc），且根據偶合常數判斷其端基質子均為β構型。由HMBC譜（圖1）可知，葡萄糖基（Glc′）的端基質子信號4.96 (1H, d,= 7.2 Hz) 與母核C-3 (90.56) 存在遠程相關，因此判斷該糖基連接在皂苷元母核的C-3位；另一葡萄糖基（Glc′′）的端基質子信號5.33 (1H, d,= 7.7 Hz) 與Glc′的C-2′ (84.16) 存在遠程相關，推測其連接方式為C-1′′→C-2′；同時由于丙二?；挠绊懀珻-6′′的化學位移向高場移動至65.47，說明其丙二?；稽c位于連接Glc′′的C-6′′-OH處；此外，葡萄糖基（Glc′′′）的端基質子信號5.26 (1H, d,= 7.6 Hz) 與母核C-20 (84.66) 存在遠程相關，因此判斷Glc′′′連接在皂苷元母核的C-20位，另一葡萄糖基（Glc′′′′）的端基質子信號5.10 (1H, d,= 7.8 Hz) 與Glc′′′的C-6′′′ (71.29) 存在遠程相關，推測其連接方式為C-1′′′′→C-6′′′。

圖1 化合物1的主要HMBC和1H-1H COSY相關

因此，化合物1被確定為3--[6--丙二酰基-β吡喃葡萄糖基-(1→2)-β吡喃葡萄糖基]-20--[β吡喃葡萄糖基-(1→6)-β吡喃葡萄糖基]-達瑪-23-烯-3β,12β,20(),25-四醇{3--[6-- malonyl-βglucopyranosyl-(1→2)-βglucopyrano-syl]-20--[βglucopyranosyl-(1→6)-βglucopyra- nosyl]-dammar-23-ene-3β,12β,20(),25-tetraol}。因其與三七皂苷A（notoginsenoside A）僅相差1個丙二?；虼嗣麨楸Ｈ咴碥誂（malonyl notoginsenoside A），結構如圖1所示。

化合物2：白色無定形粉末，mp 195～202 ℃，極易溶于甲醇，Libermann-Burchard和Molish反應均為陽性，與10%的濃硫酸-乙醇溶液于薄層色譜硅膠板上加熱后顯紫紅色，提示該化合物可能為三萜皂苷類化合物。由高分辨質譜得/1 249.560 9 [M＋K]+（理論值1 249.562 0，C57H94KO27），結合其1H-和13C-NMR譜圖，確定其分子式為C57H94O27。

化合物2的13C-NMR (100 MHz, Pyr-d) 譜共給出57個碳信號，低場區(qū)觀察到138.67 和127.62特征雙鍵碳信號，提示分子中可能存在雙鍵，以及羰基的特征碳信號171.96 和173.60，同時還觀察到105.41、106.21、98.73、105.49，推測為糖基的端基碳信號；結合DEPT譜圖，在低場區(qū)觀察到8個甲基碳信號16.89、17.18、17.43、17.99、24.18、25.86、26.30和28.96。結合1H-NMR (400 MHz, Pyr-d) 譜中高場區(qū)給出的8個特征單峰甲基質子信號0.91 (3H, s)、1.01 (3H, s)、1.14 (3H, s)、1.00 (3H, s)、1.74 (3H, s)、1.35 (3H, s)、1.72 (6H, s)，根據HMQC和HMBC譜，將其分別歸屬于C-19 (16.89)、C-18 (17.18)、C-29 (17.43)、C-30 (17.99)、C-21 (24.18)、C-28 (28.96)、C-26 (26.30)、C-27 (25.86)，綜上推測該化合物為含有2個羰基和1個碳碳雙鍵的達瑪烷型四環(huán)三萜四糖苷。

與文獻對比后發(fā)現(xiàn)，化合物2與高麗人參皂苷R2（koryoginsenoside R2）[13]的碳信號基本一致，僅多出的171.96、45.77和173.60信號與之不同，與MG-Rb1[12]對比后發(fā)現(xiàn)，這些信號為丙二?；奶卣魈夹盘枴Ｋ崴鈱嶒灲Y果表明分子中有葡萄糖基的存在，結合13C-及1H-NMR低場區(qū)的4個端基質子信號5.53 (1H, d,= 8.2 Hz)、5.33 (1H, d,= 7.1 Hz)、5.26 (1H, d,= 7.0 Hz)、5.08 (1H, d,= 7.1 Hz)，進一步確定結構中存在4個Glc基，且根據耦合常數判斷其端基質子均為β構型。由HMBC譜（圖2）可知，Glc′的端基質子信號5.53 (1H, d,= 8.2 Hz) 與母核C-3 (90.69) 存在遠程相關，因此判斷該糖基連接在皂苷元母核的C-3位；Glc′′的端基質子信號5.33 (1H, d,= 7.1 Hz) 與Glc′的C-2′ (84.03) 存在遠程相關，推測其連接方式為C-1′′→C-2′；同時由于丙二?；挠绊懀珻-6′′的化學位移向高場移動至65.40，說明其丙二?；稽c位于連接Glc′′的C-6′′-OH處；此外，Glc′′′的端基質子信號5.26 (1H, d,= 7.0 Hz) 與母核C-20 (84.75) 存在遠程相關，因此判斷Glc′′′連接在皂苷元母核的C-20位，Glc′′′′的端基質子信號5.08 (1H, d,= 7.1 Hz) 與Glc′′′的C-6′′′ (70.61) 存在遠程相關，推測其連接方式為C-1′′′′→C-6′′′。

圖2 化合物2的主要HMBC和1H-1H COSY相關

因此，化合物2被確定為3--[6--丙二?；? β吡喃葡萄糖基-(1→2)-β吡喃葡萄糖基]-20--[β吡喃葡萄糖基-(1→6)-β吡喃葡萄糖基]-達瑪-22-烯-3β,12β,20(),25-四醇{3--[6-- malonyl-βglucopyranosyl-(1→2)-βglucopyra-nosyl]-20--[βglucopyranosyl-(1→6)-βgluco-pyranosyl]-dammar-22-ene-3β,12β,20(),25-tetraol}。因其與高麗人參皂苷R2（koryoginsenoside R2）僅相差1個丙二酰基，因此命名為丙二酰高麗人參皂苷R2（malonyl koryoginsenoside R2），結構如圖2所示。

上述結合1D和2D（HSQC、HMBC和COSY）核磁譜圖，對化合物1和2進行碳氫歸屬，見表1。

表1 化合物1和2的1H-NMR (400 MHz) 和13C-NMR (100 MHz) 數據(C5D5N＋D2O)

續(xù)表1

4 討論

本研究從西洋參鮮根的80%乙醇水提取液中分離出2個新型丙二酰人參皂苷。丙二酰人參皂苷是天然人參皂苷，存在于鮮西洋參和生曬西洋參中，以前發(fā)表的研究表明，西洋參中的丙二酰人參皂苷的含量占總皂苷的50%[14-15]。丙二酰人參皂苷是西洋參的主要活性成分，文獻報道具有抗氧化、抗糖尿病、調血脂等藥理活性[9,16]。本研究為丙二?；藚⒃碥盏奶崛》蛛x純化提供了基礎數據，同時為合理開發(fā)和利用西洋參資源提供了科學的依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Isolation and identification of two new malonyl ginsenosides from

CUI Ying, WU Jian-fa, QU Chun-yuan, LI Jia-xing, LI Ze-wen, LIU Zhi

College of Chinese Medicine Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China

To investigate the chemical compositions of malonyl ginsenosides from the fresh roots of.Thewere extracted by ultrasonic extraction with 80% ethanol, followed by petroleum ether and-butanol, and separated and purified using D101 macroporous sorbent resin, silica gel dry column, ODS silica gel column and semi-preparative high performance liquid chromatography. The structures of the compounds were resolved and identified using spectroscopic techniques such as high-resolution mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy.Two malonyl ginsenosides were isolated and identified from the 60% ethanol water elution site of D101 macroporous resin of 80% ethanol extracts of the fresh root of. The structures of the new compounds were identified as 3--[6--malonyl-βglucopyranosyl-(1→2)-βglucopyranosyl]-20--[βglucopyranosyl-(1→6)-βglucopyranosyl]-dammar-23-ene-3β,12β,20(),25-tetraol (1), and 3--[6--malonyl-βglucopyranosyl-(1→2)-βglucopyranosyl]-20--[βglucopyranosyl- (1→6)-βglucopyranosyl]-dammar-22-ene-3β,12β,20(),25-tetraol (2), respectively.Compound 1 and 2 are new compounds named as malonyl notoginsenoside A and malonyl koryoginsenoside R2.

L.; malonyl notoginsenoside A; malonyl koryoginsenoside R2; malonyl ginsenoside; malonyl group

R284.1

A

0253 - 2670(2023)21 - 6940 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.002

2023-07-09

國家自然科學基金資助項目（31770378）；吉林省自然科學基金資助項目（20180101183JC）；吉林省科技發(fā)展計劃項目（20200301037RQ）

崔 穎，碩士生，研究方向為中藥化學。E-mail: cuiying626@163.com

通信作者：劉 志，副教授，碩士生導師，主要從事中藥藥效物質基礎與作用機制。E-mail: lzhiiu@126.com

[責任編輯 王文倩]