油松體細胞胚胎發(fā)生技術研究進展

龐家舉

（國有新賓滿族自治縣趙家林場，遼寧 新賓 113200）

油松Pinus tabulaeformis隸屬松科松屬，是我國的特有樹種，又叫中國松，廣泛分布于我國東北、華北以及西北地區(qū)。油松是我國重要的造林及用材樹種，并且對惡劣環(huán)境適應能力強，耐干旱瘠薄，具有重要的生態(tài)價值。油松主要采用種子繁殖方式進行造林，這導致繁殖周期長，苗木分化程度大，林相不整齊，影響了造林質量，因此可以采用無性繁殖方式進行油松造林[1]。然而油松無性繁殖困難，對于選育的優(yōu)良無性系難以規(guī)?；敝?，所以不能使用傳統(tǒng)的無性繁殖方式。植物體細胞胚胎發(fā)生技術是一種新興的無性繁殖方式，指植物組織器官經過體外培養(yǎng)形成具有雙極性胚性結構的過程，具有繁殖速度快、數量多、優(yōu)良性狀穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點。已有研究表明，針葉樹種的體胚發(fā)生一般經歷4 個階段，首先是胚性愈傷組織的誘導，其次是胚性愈傷組織的保持與增殖，再次是體細胞胚的成熟，最后是體胚萌發(fā)及植株的再生[2]。本文概述了油松體細胞胚胎發(fā)生技術的研究進展，為后續(xù)的研究提供便利，使體胚發(fā)生技術成為油松大規(guī)?？寺》敝车氖侄巍?/p>

1 油松胚性愈傷組織的誘導

胚性愈傷組織的誘導是體胚發(fā)生的初始步驟，也是整個過程的限速步驟，能否誘導成功取決于外植體的種類、消毒方式、培養(yǎng)基的類型以及植物生長調節(jié)劑種類等。

1.1 外植體種類及消毒

目前，在油松體胚發(fā)生過程中應用最多的外植體包括油松成熟合子胚以及未成熟合子胚。當以成熟合子胚為外植體時，誘導出的大多數是不定芽或非胚性愈傷組織[3-5]，難以獲得胚性愈傷組織。而以未成熟合子胚為外植體時，可以誘導出胚性愈傷組織，且誘導率較高。馬麗源等[6]發(fā)現在7 月10 日左右采集的油松未成熟合子胚中，胚性愈傷組織的誘導率最高，可達88.3%。因此相對于成熟合子胚來說，最好選用未成熟合子胚作為油松體胚發(fā)生的外植體。

確定好外植體后要對其進行消毒，在油松種子采集后先用流水沖洗2 h，然后在超凈工作臺上用75% 酒精浸泡30～60 s，取出后用無菌水沖洗3～5次，之后放入0.1% 的HgCl2溶液中浸泡5～10 min，再用無菌水沖洗3～5 次，置于滅菌的濾紙上備用。

1.2 培養(yǎng)基類型

外植體經過消毒后需要接種到培養(yǎng)基中，研究發(fā)現外植體的類型不同，需要的培養(yǎng)基類型也不同。馬佩[7]發(fā)現以油松成熟胚的子葉-胚軸段為外植體時，1/2MS 培養(yǎng)基誘導效果最好；以下胚軸段為外植體時，SH 培養(yǎng)基誘導效果最好[8]。而以未成熟合子胚為外植體時，mLV 培養(yǎng)基[9]效果最好，且能夠誘導出胚性愈傷組織[10]。

1.3 植物生長調節(jié)劑種類

植物生長調節(jié)劑在體胚發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用，主要包括生長素、細胞分裂素、赤霉素、乙烯和脫落酸，其中在愈傷組織誘導階段主要用到的是生長素和細胞分裂素，常用的生長素包括IAA、IBA、NAA、2，4-D 等；細胞分裂素包括6-BA、ZT、KT 等。將不同質量濃度的生長素和細胞分裂素組合使用對油松胚性愈傷組織的誘導具有較好的效果。此外，在培養(yǎng)基中添加一些營養(yǎng)物質如谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖等也對油松胚性愈傷組織的誘導起著促進作用。李亦軒[10]以未成熟合子胚為外植體，mLV 為基本培養(yǎng)基并添加2 mg·L-12，4-D、1 mg·L-16-BA、0.5 mg·L-1水解酪蛋白、0.5 mg·L-1谷氨酰胺、30 g·L-1蔗糖以及2.5～3 g·L-1植物凝膠，接種后將培養(yǎng)皿放在培養(yǎng)室中進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)室相對濕度60%～70%，溫度（25±3）℃，培養(yǎng)1 個月后油松胚性愈傷組織誘導率可達60%。

2 油松胚性愈傷組織的增殖

油松體胚發(fā)生體系的進一步成熟和萌發(fā)再生需要大量的胚性愈傷組織作為基礎材料，因此對誘導出的油松胚性愈傷組織進行增殖十分關鍵。目前，常用的兩種增殖方式為固體培養(yǎng)基培養(yǎng)以及液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，二者都伴隨有褐化現象。褐化的出現將影響其它健康組織的生長，甚至導致其死亡，危害性較大。為了控制油松胚性愈傷組織增殖過程中的褐化，付雙彬[11]等對培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化并發(fā)現，以mLV 為基本培養(yǎng)基添加2.5 g·L-1植物凝膠、10 g·L-1蔗糖，pH 控制在5.9，且在90 mm 培養(yǎng)皿中放置7 塊愈傷組織時，褐化率最低，增殖率和利用率最高。

利用錐形瓶進行懸浮培養(yǎng)，相對于固體培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)速度較快，但仍然難以滿足生產實驗的大量需求，并且也遭受褐化影響，而使用氣動生物反應器進行培養(yǎng)可以避免這些問題。氣動生物反應器是一種新型培養(yǎng)方式，主要原理是空氣進入生物反應器，在液體培養(yǎng)物中產生小氣泡，這些氣泡既攪動胚胎細胞團防止材料堆積，又向培養(yǎng)物提供空氣[12]。李亦軒等[13]利用氣動生物反應器對油松胚性愈傷組織進行增殖，發(fā)現每100 mL 液體培養(yǎng)基內接種10 g 油松胚性愈傷組織，添加0.2 mg·L-12，4-D，并保留20%的原培養(yǎng)基時增殖率最高，可達216.18%，且愈傷組織穩(wěn)定優(yōu)質。

3 油松體細胞胚的成熟

體細胞胚的成熟是植物體胚發(fā)生體系中至關重要的一步，是限制體胚技術商業(yè)化生產應用的重要因素，畸形胚和發(fā)育不完全胚將會影響后期體胚的萌發(fā)與植株再生[14]。影響油松體細胞胚成熟的因素主要包括ABA 濃度、愈傷組織生長情況、培養(yǎng)基滲透壓和細胞系的基因型等。眾多樹種的體胚發(fā)生研究中均發(fā)現ABA 在體細胞成熟階段發(fā)揮關鍵作用，尤其是在針葉樹種中[14～15]。此外，在體胚成熟階段經常通過添加PEG 來調節(jié)培養(yǎng)基滲透壓，有研究表明經PEG 處理的愈傷組織細胞活力和有絲分裂能力均較高，有利于后續(xù)成熟培養(yǎng)[16]。李亦軒等[17]根據這些因素對油松體細胞胚成熟過程進行了優(yōu)化，并發(fā)現在mLV 基本培養(yǎng)基中添加16 mg·L-1ABA、75 g·L-1PEG、5 g·L-1植物凝膠、（10+30）g·L-1麥芽糖和蔗糖時，油松體細胞胚的成熟效率最高，與對照相比提高了0.8 倍。

4 油松的遺傳轉化

油松作為一種針葉樹種，傳統(tǒng)育種周期長，難以滿足樹木遺傳改良的需求，因此需要通過基因工程引入分子育種途徑。建立油松遺傳轉化體系是實現這一途徑的基礎，而高效穩(wěn)定的體細胞胚胎發(fā)生體系是油松遺傳轉化體系構建的重要前提。胚性愈傷組織是遺傳轉化體系最佳的受體材料，因為其再生能力強大，容易調控分化表達全能性，已被廣泛應用于其它針葉樹種的遺傳轉化研究[18]。目前，油松的體胚發(fā)生體系逐漸優(yōu)化，可以較高效地獲得油松胚性愈傷組織，這也為油松的遺傳轉化研究提供了實驗材料。由于針葉樹的遺傳轉化難度大，仍處于初步探索階段。李亦軒[10]采用農桿菌轉化法，以油松固體愈傷組織和液體懸浮組織為材料，研究發(fā)現卡那霉素Kan=50～75 mg·L-1時有利于轉化，當OD 值在0.4～0.6，侵染時間為5～15 min，共培養(yǎng)時間為48 h，農桿菌與胚性愈傷組織狀態(tài)良好，并能得到GUS 陽性的愈傷組織。盡管只有一種處理的轉化效率相對較高，但是其愈傷組織可以被GUS 染液染成藍色，說明結果可信，這對后續(xù)的實驗提供了一個積極的影響，奠定了良好的遺傳轉化基礎。

5 展 望

目前，油松胚性愈傷組織的誘導、增殖以及成熟3 個階段已經被廣泛研究并取得了較大的進步，可以獲得大量的優(yōu)質胚性愈傷組織，并篩選出了油松體細胞胚成熟的最佳條件。然而，體細胞胚的進一步萌發(fā)以及植株再生還沒有實現，這制約著油松體胚發(fā)生技術的應用。此外，對油松胚性愈傷組織遺傳轉化的研究也停留在初步階段。因此，在今后的研究中應該把重點放在體胚萌發(fā)及植株再生，并繼續(xù)對油松遺傳轉化各階段條件進行篩選，逐步完善油松體細胞胚胎發(fā)生體系。