外源γ-氨基丁酸延緩采后獼猴桃果實冷害及其與活性氧代謝的關(guān)系

夏明輝，張 珅,，趙云峰，汪 瑩，何 凡，陳發(fā)河，林藝芬，陳福泉,

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.鹽城工學院海洋與生物工程學院，江蘇 鹽城 224051；3.亞熱帶特色農(nóng)產(chǎn)品采后生物學（福建農(nóng)林大學）福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002；4.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

獼猴桃為獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）藤本植物，原產(chǎn)于我國，在我國南北方地區(qū)均有大規(guī)模種植，果實產(chǎn)量居世界首位，是重要的大宗經(jīng)濟水果[1]，并且具有很高的營養(yǎng)價值[2]。獼猴桃屬于呼吸躍變型果實，其采后成熟過程的重要特征為接近完熟時果實迅速軟化，導致果實貯運期受限，貨架期和最佳食用期較短[3]，因此在其采收和商品化處理、流通過程中廣泛采用適當早采、單果內(nèi)襯和箱式包裝等方式[4]，以提高果實耐貯運性，并結(jié)合冷藏、氣調(diào)貯藏等手段以延緩后熟過程，延長其保鮮期[3]。作為冷敏型果實，獼猴桃在不適宜的低溫條件下極易發(fā)生冷害，主要表現(xiàn)為果肉顆粒狀木質(zhì)化和水浸狀腐敗，嚴重降低果實的食用品質(zhì)，導致貯藏、運輸、流通和銷售過程中產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟損失[5]。

國內(nèi)外研究人員采用許多化學和物理方法，如1-甲基環(huán)丙烯[9]、臭氧[10]、乙烯[11]、草酸[12]、褪黑素[13]以及氣調(diào)[14]處理等，通過維持活性氧代謝酶系統(tǒng)較高的清除能力延緩果實冷害的發(fā)生。在諸多化學方法中，外部施用植物內(nèi)源調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法具有較廣的適用性，也更有助于深入發(fā)掘果蔬冷害發(fā)生與控制的內(nèi)在調(diào)控點，可產(chǎn)生良好的冷害控制效果，加深對于相關(guān)機制的理論認知[15-17]。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是廣泛存在于生物體內(nèi)的天然氨基酸，具有天然無毒、極易獲取、成本低等特點，并且可調(diào)節(jié)植物體內(nèi)多種脅迫反應[18]。研究表明，GABA可以通過提高抗氧化酶活性[19]、緩解氧化應激反應[19]、維持能量水平[20]、減輕膜脂過氧化程度[21]等作用提高西葫蘆[20]、番石榴[22]、印度油柑[23]等果蔬的組織抗冷性，減輕低溫傷害。但是，目前鮮見將GABA應用于獼猴桃采后冷害控制的報道；GABA是否對冷藏獼猴桃果實活性氧清除系統(tǒng)，尤其是非酶清除系統(tǒng)具有調(diào)控效應，從而調(diào)節(jié)氧化還原平衡，增強組織抗冷性，也值得深入研究。因此，本實驗采用GABA溶液對采后獼猴桃果實進行貯前處理，研究GABA處理對冷藏獼猴桃果實冷害發(fā)生和活性氧產(chǎn)生、活性氧清除酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)的影響，旨在為采后獼猴桃果實冷害控制實踐及調(diào)控機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃果實采自福建省三明市建寧縣聚晟源現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司，果實采收后經(jīng)單果套網(wǎng)袋和瓦楞紙箱包裝，由廂式貨車于5 h內(nèi)運至集美大學農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏實驗室（廈門），選取約9 成熟且形狀大小均一、無機械傷和病蟲害的果實作為實驗材料。

氫氧化鈉、鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、乙酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、α-萘胺、亞硝酸鉀、二甲酚橙、硫酸亞鐵銨、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、H2O2、二硫蘇代糖醇、蛋氨酸、氮藍四唑 國藥集團化學試劑有限公司；核黃素、二硫代硝基苯酸鉀、GSH、氧化型谷胱甘肽、還原型輔酶II四鈉鹽、AsA、還原型輔酶I、抗壞血酸氧化酶、單脫氫抗壞血酸（monodehydroascorbic acid，MDHA）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 阿拉?。ㄉ虾＃┰噭┯邢薰?；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

質(zhì)構(gòu)儀 廈門超技儀器設(shè)備有限公司；全自動分析天平 上?；ǔ睂崢I(yè)有限公司；UV-8000紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；SYG-1220數(shù)顯恒溫水浴鍋 美國精騏有限公司；JM-05D-80超聲波清洗機廣東潔盟超聲實業(yè)有限公司；PSX-330H智能恒溫恒濕箱寧波萊?？萍加邢薰?；DDS-11A電導率儀 上海大普儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果實采后處理及貯藏

前期預實驗已篩選出2.0 mmol/L為較適宜的GABA處理濃度。將獼猴桃果實隨機分為兩組，每組300 個果實。一組果實用2.0 mmol/L GABA溶液浸泡20 min，另一組果實以蒸餾水代替GABA溶液浸泡作為對照組，處理后的果實在20 ℃下靜置1 h，自然晾干，然后置于（4±1）℃、（85±5）%相對濕度的冷庫中貯藏。貯藏期內(nèi)每10 d隨機取40 個獼猴桃果實樣品進行相關(guān)指標的測定。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 細胞膜透性

參照Zhang Zhengke等[24]的方法，隨機選取10 個獼猴桃果實，用打孔器（8 mm）在每個果實赤道面上取3 片2 mm厚的薄片，用電導率儀分別測定自然滲出電解質(zhì)溶液和組織破壞后滲出電解質(zhì)溶液的電導率，結(jié)果以相對電導率表示。

1.3.2.2 冷害指數(shù)

參考Li Ziying等[25]的方法，根據(jù)獼猴桃果實去皮后表面凹陷和水漬狀部分占整果表面積比例，將冷害指數(shù)分為4 級：0級為無冷害癥狀；1級為冷害發(fā)生面積比例小于25%；2級為冷害發(fā)生面積比例大于25%且小于50%；3級為冷害面積比例大于50%且小于75%；4級為冷害發(fā)生面積比例大于75%。貯藏過程中及時剔除因微生物侵染而腐爛的果實，之后不再列入統(tǒng)計。冷害指數(shù)按式（1）計算。

1.3.2.3 丙二醛含量

參考Lin Yu zhao 等[26]的方法進行丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定，隨機從20 個獼猴桃果實中取2.0 g果肉，采用硫代巴比妥酸比色法測定其在532 nm波長處的吸光度，分別在420 nm和600 nm波長處測定吸光度用于消除誤差，結(jié)果以μmol/g為單位。

H2O2含量參考王俊文[28]的方法，隨機從20 個獼猴桃果實中取2.0 g果肉，采用二甲酚橙顯色法進行測定，以H2O2標準品作標準曲線，結(jié)果以μmol/g為單位。

1.3.2.5 可溶性蛋白含量

參考Lin Yifen等[27]的方法，采用考馬斯亮藍G-250比色法測定可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白作標準曲線，其含量用于后續(xù)酶活力計算。

1.3.2.6 活性氧清除酶活力

SOD活力的測定參考楊乾等[29]的方法，隨機從20 個獼猴桃果實中取2.0 g果肉，以每分鐘酶反應體系對氮藍四唑光化學還原抑制50%為1 個活力單位（1 U）。CAT活力的測定參考Cakmak等[30]的方法，以每分鐘反應溶液在240 nm波長處吸光度變化0.01為1 U。APX活力的測定參考Ren Yanfang等[31]的方法，以每分鐘反應體系在290 nm波長處OD值變化0.01為1 U。上述酶活力結(jié)果均以U/mg pro為單位。

1.3.2.7 AsA和GSH含量

參考胡苗等[32]的方法，隨機從20 個獼猴桃果實中取2.0 g果肉，采用比色法進行AsA含量的測定，對其還原的亞鐵離子與紅菲咯啉反應生成物進行比色；通過與5.5’-二硫雙對硝基苯甲酸（5.5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）反應測定GSH含量，分別以AsA和GSH標準品作標準曲線，AsA和GSH含量分別以mg/100 g和μmol/g為單位。

1.3.2.8 AsA-GSH循環(huán)相關(guān)酶活力

參考王懿等[33]的方法，隨機從20 個獼猴桃果實中取2.0 g果肉，谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活力以每分鐘反應體系在340 nm波長處吸光度減少0.01為1 U；MDHA還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）活力以消耗1 μmol NADH為1 U；脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）活力以生成1 μmol的AsA為1 U。結(jié)果均以U/mg pro為單位。

1.3.2.9 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率和總還原力

參考Chen Chen等[34]的方法，隨機從20 個獼猴桃果實中取2.0 g果肉，采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除法和亞鐵離子法分別測定DPPH自由基清除率及總還原力，分別在517 nm和700 nm波長處測定吸光度，DPPH自由基清除率采用公式（2）計算?？傔€原力以700 nm波長處吸光度表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組實驗進行3 次重復，使用Microsoft Excel 2019軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理并繪圖。采用SPSS Statistics 26軟件中單因素方差分析對結(jié)果進行差異顯著性分析。采用Origin 2021軟件對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析和主成分分析（principal components analysis，PCA）并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GABA處理對冷藏獼猴桃果實冷害的影響

如圖1A所示，冷藏獼猴桃果實的冷害指數(shù)隨著貯藏時間的延長逐漸增加，與對照組果實相比，處理組果實的冷害指數(shù)在20～40 d和60 d時顯著較低（P＜0.05，P＜0.01）。圖1B顯示，對照組獼猴桃果實的細胞膜透性在0～10 d迅速上升，隨后緩慢升高。由于采后果實接近完熟時細胞膜透性會快速上升，可推斷本研究供試果實冷藏條件下的快速后熟期為貯藏0～10 d。GABA處理組果實細胞膜透性的變化趨勢與對照組一致，且在整個貯藏期內(nèi)顯著低于對照組（P＜0.05，P＜0.01）。由圖1C可知，獼猴桃果實MDA含量隨貯藏時間的延長逐漸增加；與對照組相比，經(jīng)GABA處理的果實MDA含量在貯藏0～30 d緩慢升高，其中在10～30 d和60 d時顯著較低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 GABA處理對冷藏獼猴桃果實冷害指數(shù)（A）、細胞膜透性（B）和MDA含量（C）的影響Fig.1 Effect of GABA treatment on chilling injury index (A),cell membrane permeability (B),and MDA content (C) in kiwifruit during cold storage

2.2 GABA處理對冷藏獼猴桃果實產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

圖2 GABA處理對冷藏獼猴桃果實產(chǎn)生速率（A）和H2O2含量（B）的影響Fig.2 Effect of GABA treatment on superoxide anion radical production rate (A) and H2O2 content (B) in kiwifruit during cold storage

2.3 GABA處理對冷藏獼猴桃果實活性氧清除酶活力的影響

如圖3A所示，對照組和GABA處理組果實的SOD活力均在0～10 d上升，之后隨著貯藏時間的延長不斷下降；與對照組相比，GABA處理組果實的SOD活力在10～30 d和50 d時顯著較高（P＜0.05，P＜0.01）。由圖3B可知，對照組果實CAT活力在整個貯藏期內(nèi)逐漸下降，而GABA處理組果實CAT活力在0～10 d升高，10～20 d迅速下降，隨后呈緩慢降低趨勢，并且在整個貯藏期內(nèi)與對照組相比顯著較高（P＜0.05，P＜0.01）。圖3C顯示，在整個貯藏期間，對照組和GABA處理組果實APX活力均在貯藏0～20 d上升并到達高峰，20～60 d逐漸下降；相較于對照組，GABA處理組果實APX活力在20 d和40～60 d時顯著較高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 GABA處理對冷藏獼猴桃果實SOD（A）、CAT（B）和APX（C）活力的影響Fig.3 Effect of GABA treatment on SOD (A),CAT (B) and APX (C)activities in kiwifruit during cold storage

2.4 GABA處理對冷藏獼猴桃果實AsA和GSH含量的影響

如圖4A所示，對照組果實AsA含量在0～10 d快速升高，10～30 d緩慢上升，30～60 d不斷下降；與對照組相比，GABA處理組果實AsA含量在0～10 d升高較快，10～30 d維持在較高水平，隨后逐漸下降，且在貯藏10～60 d極顯著較高（P＜0.01）。由圖4B可知，對照組和GABA處理組果實的GSH含量均在0～40 d逐漸上升，40～60 d迅速下降，且與對照組相比GABA處理組果實GSH含量在10～40 d和60 d時顯著較高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 GABA處理對冷藏獼猴桃果實AsA（A）和GSH（B）含量的影響Fig.4 Effect of GABA treatment on the contents of AsA (A) and GSH (B)in kiwifruit during cold storage

2.5 GABA處理對冷藏獼猴桃果實AsA-GSH循環(huán)酶活力的影響

如圖5A所示，對照組果實GR活力在貯藏0～40 d緩慢升高，40～60 d快速下降；而GABA處理組果實的GR活力在0～30 d迅速上升，30～60 d迅速下降。與對照組相比，GABA處理組果實的GR活力在30～40 d極顯著較高（P＜0.01）。圖5B顯示，對照組果實MDHAR活力在0～30 d上升并達到高峰，30～50 d迅速下降后趨于穩(wěn)定；GABA處理組果實的MDHAR活力變化趨勢與對照組一致，并在20～30 d顯著較高（P＜0.05，P＜0.01）。由圖5C可知，對照組果實DHAR活力在貯藏期內(nèi)變化較平穩(wěn)，0～40 d緩慢升高，隨后有所降低；與對照組相比，GABA處理組果實DHAR活力在0～30 d快速上升并達到峰值，30～40 d迅速下降，隨后較為穩(wěn)定，且在整個貯藏期間均極顯著較高（P＜0.01）。

圖5 GABA處理對冷藏獼猴桃GR（A）、MDHAR（B）和DHAR（C）活力的影響Fig.5 Effect of GABA treatment on the activities of GR (A),MDHAR (B) and DHAR (C) in kiwifruit during cold storage

2.6 GABA處理對冷藏獼猴桃果實DPPH自由基清除率和總還原力的影響

如圖6所示，對照組和GABA處理組果實的DPPH自由基清除率和總還原力均隨著貯藏時間的延長而下降，表明果實抗氧化性逐漸降低。而在相同貯藏期內(nèi)，與對照組相比，GABA處理組果實具有顯著較高的抗氧化性（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 GABA處理對冷藏獼猴桃果實DPPH自由基清除能力（A）和總還原力（B）的影響Fig.6 Effect of GABA treatment on DPPH radical scavenging capacity (A)and total reducing power (B) in kiwifruit during cold storage

2.7 相關(guān)性分析及PCA

如圖7A所示，在冷藏期間，對照組獼猴桃果實冷害指數(shù)與細胞膜透性呈顯著正相關(guān)（r＝0.83，P＜0.05）。細胞膜透性和MDA含量呈顯著正相關(guān)（r＝0.87，P＜0.05），MDA含量與產(chǎn)生速率（r＝0.94）、H2O2含量（r＝0.97）均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。產(chǎn)生速率與SOD活力呈顯著負相關(guān)（r＝-0.86，P＜0.05）。H2O2含量與CAT活力呈顯著負相關(guān)（r＝-0.93，P＜0.05）。MDHAR和DHAR活力均與AsA含量呈正相關(guān)，GR活力與GSH含量呈顯著正相關(guān)（r＝0.94，P＜0.05）。冷害指數(shù)（r＝-0.96）和細胞膜透性（r＝-0.93 ）均與總還原力呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）?？傔€原力與產(chǎn)生速率（r＝-0.95）和H2O2含量（r＝-0.99）均呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），并與SOD活力（r＝0.84）和CAT活力（r＝0.91）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。采用PCA法分析了對照組和GABA處理組獼猴桃果實冷害相關(guān)指標和活性氧代謝相關(guān)酶的活力。如圖7B所示，通過分析協(xié)方差矩陣的特征值，發(fā)現(xiàn)兩個主成分（PC）占數(shù)據(jù)集總方差的86.6%，表明降維后的數(shù)據(jù)能夠很好地表征原始數(shù)據(jù)。PC1涵蓋了數(shù)據(jù)集中53.6%的方差，主要體現(xiàn)果實冷害、活性氧水平和活性氧清除酶活力的特征值變化。隨著貯藏時間的延長，對照組和GABA處理組的負荷值在PC1上均不斷增大，表明活性氧清除酶活力逐漸下降，活性氧不斷積累，冷害指數(shù)升高。與對照組相比，GABA處理組果實能夠維持較低的負荷值，說明GABA處理能夠較好地維持冷藏獼猴桃果實活性氧清除酶系統(tǒng)的清除能力，延緩活性氧積累，減緩冷害的發(fā)生。PC2涵蓋了數(shù)據(jù)集中33.0%的方差，主要體現(xiàn)活性氧清除非酶系統(tǒng)（AsA-GSH循環(huán)）與冷害和活性氧水平之間的關(guān)系。隨著貯藏時間的延長，對照組和GABA處理組的負荷值在PC2上均先增大后減小，AsA-GSH循環(huán)中相應物質(zhì)含量和酶活力在貯藏中期均達到高峰。與對照組相比，GABA處理組果實能夠使以上指標維持較高的負荷值，說明GABA處理能夠提高AsAGSH循環(huán)的活力，延緩活性氧的積累及冷害的發(fā)生。

圖7 冷藏獼猴桃果實冷害和活性氧代謝相關(guān)指標的相關(guān)性分析（A）和PCA（B）Fig.7 Correlation analysis (A) and principal components analysis plot(B) of chilling injury related indexes versus ROS of postharvest kiwifruit during cold storage

3 討論

細胞膜是果實細胞內(nèi)外生理生化狀態(tài)變化的重要反映者，是維持細胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵屏障，而果蔬冷害發(fā)生的初級與次級反應均與細胞膜的相態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能等變化有關(guān)[35]。作為植物低溫脅迫下的主要次級反應，活性氧的大量產(chǎn)生與積累會直接影響細胞膜系統(tǒng)和生物大分子，造成細胞結(jié)構(gòu)和功能損傷，導致膜透性升高[12]。MDA作為活性氧攻擊細胞膜脂的產(chǎn)物，也具有較強的氧化性，會進一步加重細胞膜的損傷，從而加劇冷害癥狀。研究表明，外源GABA處理能夠延緩櫻桃[19]、番石榴[22]和桃[36]等果實冷藏期間冷害指數(shù)、細胞膜透性和MDA含量的上升，從而延緩果實冷害。Huang Hua等[37]研究發(fā)現(xiàn)，采用蘋果酸處理可以延緩香蕉果實產(chǎn)生速率和H2O2含量的上升，從而減緩冷害進程。本研究結(jié)果表明，獼猴桃果實冷害指數(shù)、細胞膜透性和MDA含量在低溫貯藏過程中都隨著時間的延長而升高（圖1），同時產(chǎn)生速率和H2O2含量不斷上升（圖2）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，細胞膜透性與冷害指數(shù)和MDA含量在整個貯藏期間均呈顯著正相關(guān)，而MDA含量與產(chǎn)生速率和H2O2含量在整個貯藏期內(nèi)均呈顯著正相關(guān)（圖7A）。由PCA結(jié)果可知，冷害指數(shù)、細胞膜透性、MDA含量、產(chǎn)生速率和H2O2含量都在PC1中具有較高的正載荷值，且GABA處理組果實的正載荷值低于對照組果實（圖7B）。由此推斷，獼猴桃果實冷害的發(fā)生與冷藏過程中活性氧大量積累從而加劇膜脂過氧化，進而破壞細胞膜結(jié)構(gòu)有關(guān)。GABA處理顯著抑制了冷藏獼猴桃果實冷害指數(shù)、細胞膜透性和MDA含量的上升（圖1），同時延緩了產(chǎn)生速率和H2O2含量的上升（圖2），說明GABA處理可以通過延緩活性氧的積累，減少果實組織中MDA的產(chǎn)生，減輕細胞膜脂過氧化反應，保持細胞膜較好的完整性，減輕果實在低溫脅迫下的功能失調(diào)。

低溫脅迫條件下，植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除的不平衡會引發(fā)哈密瓜[8]、甜瓜[29]和杏[38]等果實體內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫，加劇其生理失調(diào)與冷害癥狀。許多研究表明，減輕氧化脅迫對維持冷敏型果實細胞膜完整性、提高其抗冷性、延緩低溫冷害有重要作用，其內(nèi)在主導因素為酶和非酶系統(tǒng)組成的活性氧清除系統(tǒng)[29]?；钚匝跚宄赶到y(tǒng)是主要的活性氧清除方式，其中SOD專一歧化形成H2O2，CAT和APX可將H2O2還原為H2O和O2[39]，從而減輕氧化損傷。何歡等[38]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素處理能夠維持杏果實較高的SOD、CAT和APX活性，延緩產(chǎn)生速率和H2O2含量的上升，減輕細胞膜損傷，延緩果實冷害。Vali等[19]報道，采用GABA處理延緩了櫻桃果實中和H2O2的累積，并且伴隨著SOD、CAT和APX活性的增加，表明GABA可以通過調(diào)節(jié)活性氧清除酶系統(tǒng)活性來延緩櫻桃果實的冷害。本研究中，對照組果實在貯藏期內(nèi)不斷升高的產(chǎn)生速率與SOD活力呈顯著負相關(guān)，同樣持續(xù)增加的H2O2含量與不斷下降的CAT活力呈顯著負相關(guān)（圖7A）。PCA結(jié)果表明，在PC1中產(chǎn)生速率和H2O2含量具有較高的正載荷值，SOD和CAT活力具有較高的負載荷值，并且GABA處理組上述各點的載荷值均低于對照組（圖7B）。由此可知，冷藏獼猴桃果實活性氧清除酶（SOD、CAT和APX）活力在果實快速成熟的0～10 d期間均升高，可能是由于接近完熟時相關(guān)調(diào)控基因的表達與蛋白合成增加，以應對較高的活性氧產(chǎn)生速率，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，減輕細胞損傷；隨后SOD和CAT活力隨著貯藏時間的延長迅速降低，APX活力在20 d后快速下降，表明活性氧清除酶系統(tǒng)活力下降，活性氧大量積累，細胞氧化損傷加劇，果實冷害進程加快。與對照組相比，GABA處理延緩了果實產(chǎn)生速率和H2O2含量的上升（圖2），并且增大了SOD、CAT和APX的活力（圖3）。由此可推斷，GABA處理可以通過增強冷藏獼猴桃果實活性氧清除酶系統(tǒng)的能力延緩活性氧積累，從而減輕獼猴桃果實的冷害癥狀。

AsA和GSH作為采后果實中的重要抗氧化活性物質(zhì)，在非酶促活性氧清除系統(tǒng)中起著重要的作用[40]。AsA可通過自身還原性或作為電子供體在APX催化下清除H2O2[33,41]，氧化生成MDHA。MDHA可由MDHAR以NADH為電子供體催化還原，重新形成AsA[33]，或進一步氧化成脫氫AsA，而后者通過DHAR作用亦可還原為AsA，使AsA再生；DHAR也可將GSH氧化成氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG），GSSG可由GR催化還原為GSH，構(gòu)成AsA-GSH循環(huán)[42]。此外，GSH自身也可清除活性氧，生成GSSG[29]。采用甘氨酸甜菜堿或NO處理均能通過提高冷藏桃果實MDHAR、DHAR和GR活性來維持AsA和GSH水平，減少活性氧積累，延緩冷害進程[33,43]。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組獼猴桃果實AsA含量在后熟期不斷增加（圖4A），在0～10 d快速升高，并于10～30 d維持在較高水平，APX、MDHAR、DHAR活力分別在0～20 d、0～30 d和0～40 d逐漸增加達到高峰，隨后逐漸下降（圖3C及圖5B、C）；而GSH含量和GR活力均在0～40 d快速增加，隨后下降（圖4 B、5 A）。相關(guān)性分析表明，對照組果實的MDHAR（r＝0.60）和DHAR活力（r＝0.61）在貯藏期內(nèi)與AsA含量呈正相關(guān)，DHAR活力和GSH含量呈顯著正相關(guān)（r＝0.86，P＜0.05），GR活力和GSH含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）（圖7A）。PCA結(jié)果表明，在PC2中AsA和GSH含量與MDHAR、DHAR和GR活力都具有較高的正載荷值，其中對照組和GABA處理組果實的上述載荷值在貯藏30～40 d時最高，且GABA處理組的正載荷值均高于對照組（圖7B）。由此可推斷，在獼猴桃果實快速后熟期（0～10 d），MDHAR、DHAR和GR活力的快速上升促進了AsA和GSH積累，這可能與冷藏初期果實對低溫脅迫的響應有關(guān)；隨著冷藏的進行，MDHAR、DHAR和GR活力在貯藏中期果實完熟時（30～40 d）達到高峰，此時AsA-GSH循環(huán)的活性氧清除能力最高，以抵御低溫導致的活性氧爆發(fā)；而后隨著貯藏時間延長，AsA和GSH含量以及MDHAR、DHAR和GR活力下降，即AsA-GSH循環(huán)活性氧清除能力降低，致使活性氧加速積累，細胞膜損傷加劇。GABA處理組果實相較于對照組保持了較高的AsA和GSH水平（圖4）以及MDHAR、DHAR和GR活力（圖5），說明GABA處理能夠促進AsAGSH循環(huán)運行，提升活性氧非酶清除系統(tǒng)的活性，從而減輕冷害。

果實組織的DPPH自由基清除率和總還原力可用來衡量其抗氧化能力[26]。本研究中，在貯藏期內(nèi)不斷降低的DPPH自由基清除率和總還原力與冷害指數(shù)、細胞膜透性、產(chǎn)生速率和H2O2含量呈顯著負相關(guān)（圖7A），與活性氧代謝酶（SOD和CAT）活力呈顯著正相關(guān)（圖7A）。推測獼猴桃果實冷害進程中，果實內(nèi)活性氧大量積累，活性氧清除能力降低，導致了組織抗氧化能力減弱。GABA處理能夠使枇杷果實在冷藏期間維持較高的DPPH自由基清除率和總還原力（圖6），說明GABA處理維持了果實的抗氧化能力，從而減輕氧化脅迫，延緩細胞膜損傷，延遲果實冷害進程。