• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    利用透性化黑曲霉細(xì)胞制備稀有人參皂苷Rh1的方法研究

    2019-10-08 03:03:22耿瑜蔣明星熊正紅文孟良
    關(guān)鍵詞:透性黑曲霉通透性

    耿瑜, 蔣明星, 熊正紅, 文孟良*

    ( 1.云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 云南 昆明 650500; 2.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 云南 昆明 650214 )

    0 引言

    三七人參皂苷是三七的主要藥效成分之一,包括Rb1、Rb2、Rg1、R1等常量人參皂苷組分[1-2].研究表明,常量人參皂苷在人體內(nèi)代謝后,其產(chǎn)生的稀有人參皂苷在抗炎、抗腫瘤、抗氧化以及提高免疫方面具有顯著的療效[3-7].目前,稀有人參皂苷Rh1主要是通過合成和轉(zhuǎn)化的方法來獲取[8],其中微生物轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)體系穩(wěn)定、菌種生長迅速、轉(zhuǎn)化周期短且無需分離純化酶液等優(yōu)點,受到眾多研究者的青睞[9].目前,我國利用微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)生產(chǎn)稀有人參皂苷的研究仍處于初期階段[3],相關(guān)研究多集中于把分離純化得到的單一常量人參皂苷轉(zhuǎn)化為另一種稀有人參皂苷.例如,利用Mucilaginibacter sp.(鞘氨醇單胞菌)和Microbacterium esteraromaticum(酯香微桿菌)的β -glucosidase重組酶將Re、Rg1轉(zhuǎn)化為Rg2和Rh1[10-11];利用Aspergillus niger(黑曲霉菌)中的β -glucosidase將Rf轉(zhuǎn)化為Rh1[12].本文以三七的三醇組常量人參皂苷(含Re、Rg1、R1)為底物,以透性化處理的黑曲霉細(xì)胞為轉(zhuǎn)化菌株,以此探索獲取稀有人參皂苷Rh1的微生物轉(zhuǎn)化法.

    1 材料與方法

    1.1 菌種、試劑和培養(yǎng)基

    黑曲霉菌,由實驗室分離并保存.Span-20,生工生物工程上海股份有限公司;四氯化碳、吐溫-60、吐溫- 80,天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;EDTA,BioFRoxx;戊二醛,天津盛奧化學(xué)試劑有限公司;乙醇,廣東光華科技股份有限公司;液氮,普諾斯商貿(mào)有限公司;三醇組人參皂苷(含Re、Rg1、R1,其中Rg1含量大于50%,Re和R1含量小于10%),云南西草生物科技有限公司;Rh1標(biāo)樣,云南與諾生物工程有限責(zé)任公司;硅膠板,青島海洋化工廠分廠.PDB黑曲霉菌絲體培養(yǎng)基(1 L):20 g葡萄糖,200 g馬鈴薯,自然pH.PDA黑曲霉孢子培養(yǎng)基(1 L): 20 g葡萄糖,20 g瓊脂,200 g馬鈴薯,自然pH.液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1 L): 1 g酵母粉,1 g胰蛋白胨,2 g三醇組人參皂苷(Rg1含量大于50%、Re和R1含量小于10%),自然pH.

    1.2 儀器

    電子天平,Denver Instrument TP-214;恒溫培養(yǎng)振蕩器,Eppendorf Thermonixer;恒溫水浴鍋,北京長風(fēng)儀器儀表公司;離心機,Eppendorf Centrifuge 5418;超聲破碎儀,Kudos Ultrasonic;搖床,Shiping Rocking Incubator;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,EYELA OSB -2100;高效液相色譜儀,Agilent 1100.

    1.3 實驗方法

    1.3.1種子液的制備與誘導(dǎo)培養(yǎng) 在三角瓶(250 mL)中加入50 mL PDB培養(yǎng)基,接種黑曲霉孢子,在28 ℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)2 d,制得黑曲霉菌絲體,作為種子液待用.在三角瓶(250 mL)中加入50 mL液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基,接種10%的種子液,在30 ℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d后,轉(zhuǎn)至室溫靜置培養(yǎng)7 d直至在培養(yǎng)基中能夠檢測到有稀有人參皂苷Rh1產(chǎn)生.

    1.3.2透性化細(xì)胞的制備 1)化學(xué)法.將濕重1 g 的黑曲霉細(xì)胞置于2 mL離心管中,然后加入表1中的透性化試劑1 mL.在28 ℃、50 r·min-1條件下振蕩處理30 min,離心5 min (12 000 r·min-1),以去除透性化試劑.用0.2 mol·L-1磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉+0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉,pH=8.0)洗滌沉淀細(xì)胞,離心5 min (12 000 r·min-1),最終收集的菌體即為通透性細(xì)胞.

    2)物理法.凍融處理:將濕重1 g的黑曲霉細(xì)胞置于2 mL離心管中,使用凍融(液氮速凍、45 ℃水浴溶解)的方法處理細(xì)胞,離心5 min (12 000 r·min-1)后收集得到的菌體即為通透性細(xì)胞.超聲處理:用磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉+0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉,pH=8.0)洗滌誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞,離心5 min (12 000 r·min-1)后將沉淀超聲處理(53 kHz) 15 min即得通透性細(xì)胞.

    表1 不同方法選用的試劑及其用量

    3)聯(lián)合法.將濕重1 g的黑曲霉細(xì)胞置于2 mL離心管中,分別使用凍融(液氮速凍+45 ℃水浴溶解)+超聲的方法、凍融+化學(xué)的方法、凍融+超聲+化學(xué)的方法、超聲+化學(xué)的方法處理細(xì)胞,然后離心5 min (12 000 r·min-1)去除透性化試劑.用磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉+0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉,pH=8.0)洗滌細(xì)胞后再離心5 min (12 000 r·min-1)即得通透性細(xì)胞.

    1.3.3產(chǎn)物檢測 將上述方法得到的透性化細(xì)胞與1 mL 0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的三醇組皂苷溶液水浴反應(yīng)30 min (45 ℃).用等體積正丁醇萃取溶液,然后取正丁醇層溶液進行薄層層析,展開劑為氯仿-甲醇(體積比為85∶15),顯色劑為甲醇-硫酸-乙酸(體積比為85∶5∶10).蒸干每組實驗產(chǎn)量最高的正丁醇層(0.9 mL),將得到的粉末狀樣品溶于5 mL甲醇中,過濾后取10 μL進行高效液相色譜(HPLC)檢測.色譜柱為Lichrospher C18色譜柱,柱溫為30 ℃,紫外檢測波長為203 nm,進樣量為10 μL,流動相為水(A)和乙腈(B).流動相洗脫梯度: 0~52 min, 69%(A)+31%(B); 52~53 min, 35%(A)+65%(B); 53~69 min, 100%(B); 69~76 min, 69%(A)+31%(B)(百分?jǐn)?shù)均為體積分?jǐn)?shù)).

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同試劑透性化處理黑曲霉細(xì)胞對Rh1產(chǎn)量的影響

    利用不同試劑對黑曲霉細(xì)胞進行透性化處理后,使用磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉+0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉,pH=8.0)洗滌通透性細(xì)胞,然后將其與0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的三醇組人參皂苷溶液反應(yīng)30 min (45 ℃),結(jié)果如圖1所示.對照組細(xì)胞用1 mL無菌水代替透性化試劑進行處理.

    由圖1可知,不同的透性化試劑對細(xì)胞產(chǎn)生的影響不同.四氯化碳組、四氯化碳+乙醇組的Rh1轉(zhuǎn)化率低于對照組,其原因可能是四氯化碳、四氯化碳+乙醇抑制了生物的修復(fù)功能[16],進而導(dǎo)致細(xì)胞死亡和蛋白變性; 45% span-20組、span-20+EDTA組、span-20+乙醇組的Rh1轉(zhuǎn)化率與對照組接近,這可能是45% span-20、span-20+EDTA、span-20+乙醇組未能損傷細(xì)胞膜表面蛋白,因而無法提升黑曲霉細(xì)胞的通透性作用;甲苯組、戊二醛組、乙醇組、吐溫- 60組、吐溫- 80組、EDTA組的Rh1轉(zhuǎn)化率均得到提高,其中EDTA組的轉(zhuǎn)化率最好.甲苯組、戊二醛組和乙醇組能夠提高Rh1轉(zhuǎn)化率的可能原因是,這3種試劑對微生物細(xì)胞具有微毒性,能部分損傷黑曲霉的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜,進而能夠促進細(xì)胞通透性的提高[17].吐溫-60組和吐溫-80組能夠提高Rh1轉(zhuǎn)化率的可能原因是,去垢劑促使細(xì)胞膜自溶,從而提高了細(xì)胞通透性[14].螯合劑能夠提高Rh1轉(zhuǎn)化率的可能原因是,EDTA螯合細(xì)胞膜表面的陽離子后,失去陽離子的失活膜蛋白破壞了細(xì)胞膜的完整性,進而提高了細(xì)胞的通透性[18].

    1為Rh1標(biāo)樣; 2為對照組; 3為2%甲苯; 4為2%戊二醛; 5為2% CCl4; 6為1% CCl4+2.25% EDTA; 7為1% CCl4+5%乙醇; 8為45% span-20; 9為22.5% span-20+2.25% EDTA; 10為22.5% span-20+5%乙醇; 11為0.4%吐溫- 60; 12為0.4%吐溫- 80; 13為4.5% EDTA; 14為10%乙醇圖1 不同試劑透性化處理黑曲霉細(xì)胞對Rh1產(chǎn)量的影響

    2.2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EDTA對Rh1產(chǎn)量的影響

    分別選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4.5%、5%和6%的EDTA透性化處理黑曲霉細(xì)胞,結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出,用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EDTA透性化處理細(xì)胞時,其Rh1的產(chǎn)量不同;當(dāng)EDTA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時,其Rh1的產(chǎn)量最佳.

    1為Rh1標(biāo)樣; 2為對照組; 3為1% EDTA; 4為2% EDTA; 5為3% EDTA; 6為4.5% EDTA; 7為5% EDTA; 8為6% EDTA圖2 不同質(zhì)量分類的EDTA對Rh1產(chǎn)量的影響

    2.3 不同透性化處理時間對Rh1產(chǎn)量的影響

    以3% EDTA為透性化試劑時,不同透性化處理時間對細(xì)胞通透性的影響,如圖3所示.由圖3可以看出,當(dāng)處理時間超過30 min時,Rh1的產(chǎn)量不再明顯增加.這表明,透性化處理30 min即可達到較好的滲透效果.

    1為Rh1標(biāo)樣; 2為對照組; 3為3% EDTA處理15 min; 4為3% EDTA處理30 min; 5為3% EDTA處理45 min; 6為3% EDTA處理60 min; 7為3% EDTA處理75 min; 8為3% EDTA處理90 min圖3 不同透性化處理時間對Rh1產(chǎn)量的影響

    2.4 不同透性化處理方法對Rh1產(chǎn)量的影響

    分別采用物理法(凍融的方法、超聲的方法)、化學(xué)法(3% EDTA)、物理和化學(xué)聯(lián)合法(凍融+超聲的方法、凍融+化學(xué)的方法、超聲+化學(xué)的方法、凍融+超聲+化學(xué)的方法)[13]透性化處理黑曲霉細(xì)胞,結(jié)果如圖4所示.超聲與3% EDTA聯(lián)用的方法獲得通透性細(xì)胞的效果最好,其原因可能是超聲處理對細(xì)胞損傷適宜,既能提高通透性,又可避免因改變外界環(huán)境而對胞內(nèi)復(fù)合酶系造成的傷害,即促進了胞內(nèi)復(fù)合酶系與底物的結(jié)合反應(yīng);凍融法、化學(xué)法、凍融+超聲的方法、凍融+化學(xué)的方法以及凍融+超聲+化學(xué)的方法對Rh1的產(chǎn)量影響不大,均與對照組相似,這可能是凍融的過程能夠引起蛋白交聯(lián),從而導(dǎo)致蛋白變性[19].

    1為Rh1標(biāo)樣; 2為對照組; 3為凍融法; 4為超聲法; 5為3% EDTA法; 6為凍融+超聲的方法; 7為凍融+3% EDTA的方法; 8為超聲+3% EDTA的方法; 9為凍融+超聲+3% EDTA的方法圖4 不同透性化處理方法對Rh1產(chǎn)量的影響

    2.5 產(chǎn)物的HPLC檢測

    取待測樣品(2.1中4.5% EDTA樣品、2.2中3% EDTA樣品、2.3中30 min樣品、2.4中超聲+3% EDTA樣品)的正丁醇層溶液0.9 mL,蒸干后溶解于5 mL甲醇中(稀釋5.56倍).各取10 μL待測樣品進行HPLC檢測,結(jié)果如圖5所示.采用單點校準(zhǔn)法[20]對得到的峰面積數(shù)據(jù),按照公式Ci=Cs×Si/Ss計算Rh1的濃度值,結(jié)果如表2所示.上式中Ci和Cs分別為待測溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液中Rh1組份的濃度(mg·mL-1),Si和Ss分別為待測溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液中Rh1組份的峰面積(mAU). 由圖5 B —圖5 E可知, 4種樣品的出峰保留時間(25.150、25.242、25.008、25.287 min)與Rh1標(biāo)樣(圖5 A,25.310 min)基本一致,這表明透性化處理黑曲霉細(xì)胞的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中有Rh1生成.由表2可知,超聲+3% EDTA聯(lián)用方法的通透性效果最好.

    表2 單點矯正法測得的樣品濃度

    A為Rh1標(biāo)樣; B為不同試劑透性化處理黑曲霉細(xì)胞的13號樣品(4.5% EDTA); C為不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EDTA透性化處理黑曲霉細(xì)胞的5號樣品(3% EDTA); D為不同透性化處理時間處理黑曲霉細(xì)胞的4號樣品(30 min); E為不同透性化處理方法處理黑曲霉細(xì)胞的8號樣品(超聲+3% EDTA)圖5 產(chǎn)物的HPLC檢測圖

    3 結(jié)論

    本文使用不同透性化試劑、不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的試劑、不同透性化處理時間以及不同的透性化方法對黑曲霉細(xì)胞進行透性化處理以制備稀有人參皂苷Rh1.通過薄層層析檢測和HPLC分析表明, 聯(lián)合3% EDTA與超聲法(53 kHz)時,Rh1的制得效果最好.這表明該方法能在保證細(xì)胞完整性的前提下,提高細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性,進而使底物能夠進入細(xì)胞內(nèi)與復(fù)合酶結(jié)合反應(yīng).該方法對細(xì)胞毒性小,反應(yīng)條件溫和,操作簡單,實用性強.另外,用三七的三醇型常量人參皂苷(Re、Rg1、R1)作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的底物,可節(jié)省分離和純化單一常量人參皂苷成分的時間和成本,因此本文方法為制備Rh1提供了新的思路.

    猜你喜歡
    透性黑曲霉通透性
    甲基苯丙胺對大鼠心臟血管通透性的影響初探
    紅景天苷對氯氣暴露致急性肺損傷肺血管通透性的保護作用
    不同水、氮條件對岑溪軟枝油茶葉片膜透性和相對含水量的影響
    復(fù)合誘變選育耐高溫高產(chǎn)葡萄糖酸鹽的黑曲霉菌株
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:22
    黑曲霉產(chǎn)纖維素酶混合發(fā)酵條件的研究
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:20
    酶法制備黑曲霉原生質(zhì)體的條件
    基于海泡石的細(xì)胞透性化
    豬殺菌/通透性增加蛋白基因siRNA載體構(gòu)建及干擾效果評價
    響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件
    透性化處理提高黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶的表觀轉(zhuǎn)苷活力
    色视频在线一区二区三区| 美女国产高潮福利片在线看| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 99国产精品免费福利视频| 韩国精品一区二区三区| 亚洲四区av| 人人澡人人妻人| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久国产精品大桥未久av| 1024香蕉在线观看| 国产成人系列免费观看| 三上悠亚av全集在线观看| 下体分泌物呈黄色| 国产成人免费无遮挡视频| 免费av中文字幕在线| 国产国语露脸激情在线看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 欧美人与善性xxx| avwww免费| 亚洲少妇的诱惑av| 激情视频va一区二区三区| 国产在视频线精品| 国产成人免费无遮挡视频| 看非洲黑人一级黄片| av国产久精品久网站免费入址| 国产视频首页在线观看| 欧美中文综合在线视频| 老司机靠b影院| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲情色 制服丝袜| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 色吧在线观看| 色94色欧美一区二区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久人人97超碰香蕉20202| 欧美成人午夜精品| 色播在线永久视频| 成人影院久久| 桃花免费在线播放| 青草久久国产| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 性高湖久久久久久久久免费观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 成年av动漫网址| 国产精品免费视频内射| 超碰成人久久| 久久热在线av| 一本色道久久久久久精品综合| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 国产成人精品福利久久| 一区福利在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 一个人免费看片子| 天堂俺去俺来也www色官网| 高清欧美精品videossex| 高清不卡的av网站| 国产亚洲最大av| 各种免费的搞黄视频| 一区二区三区精品91| 母亲3免费完整高清在线观看| 一级片免费观看大全| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产成人精品福利久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 天天影视国产精品| 久久久久久人人人人人| 亚洲精品日本国产第一区| 丁香六月欧美| 啦啦啦在线观看免费高清www| 人人妻人人澡人人看| 亚洲美女黄色视频免费看| 男的添女的下面高潮视频| 天天添夜夜摸| 99re6热这里在线精品视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 丁香六月天网| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 9热在线视频观看99| 欧美乱码精品一区二区三区| 日日爽夜夜爽网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久久久视频综合| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲人成电影观看| 国产成人精品久久久久久| 色网站视频免费| 国产在线免费精品| 国产在线免费精品| 国产伦理片在线播放av一区| 欧美97在线视频| 国产精品久久久av美女十八| 免费黄网站久久成人精品| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产精品嫩草影院av在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 两个人看的免费小视频| 激情五月婷婷亚洲| 国产成人啪精品午夜网站| 久久久国产一区二区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 少妇人妻 视频| 波多野结衣一区麻豆| 91国产中文字幕| 超色免费av| av在线观看视频网站免费| 国产黄色免费在线视频| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲久久久国产精品| 免费在线观看完整版高清| 另类亚洲欧美激情| 精品国产一区二区三区四区第35| av在线app专区| 久热这里只有精品99| 看十八女毛片水多多多| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 97人妻天天添夜夜摸| 国产精品久久久久久精品古装| 涩涩av久久男人的天堂| 女性生殖器流出的白浆| 免费观看a级毛片全部| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲一区中文字幕在线| 国产成人欧美| 日日啪夜夜爽| 一级毛片我不卡| 啦啦啦在线免费观看视频4| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 午夜老司机福利片| 最新在线观看一区二区三区 | 美女视频免费永久观看网站| 久久久精品区二区三区| 另类精品久久| 超碰97精品在线观看| 中文字幕制服av| 黄色 视频免费看| 亚洲专区中文字幕在线 | 国产一区二区三区av在线| 黄片无遮挡物在线观看| 中文欧美无线码| 69精品国产乱码久久久| 老司机靠b影院| 国产日韩欧美视频二区| 国产精品一二三区在线看| 秋霞在线观看毛片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 老司机亚洲免费影院| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品免费视频内射| 老司机在亚洲福利影院| 国产精品久久久久久精品电影小说| a级毛片黄视频| av电影中文网址| 亚洲国产欧美网| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 丰满少妇做爰视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产免费一区二区三区四区乱码| 在线观看免费高清a一片| 国精品久久久久久国模美| 亚洲成人手机| 亚洲精品国产av成人精品| 我要看黄色一级片免费的| 不卡av一区二区三区| 超碰成人久久| 又黄又粗又硬又大视频| 老司机亚洲免费影院| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲精品国产av蜜桃| 中文字幕制服av| 亚洲美女搞黄在线观看| 丁香六月天网| 精品国产一区二区三区四区第35| 尾随美女入室| 看免费成人av毛片| 岛国毛片在线播放| 国产高清不卡午夜福利| 久久精品国产亚洲av高清一级| 日韩人妻精品一区2区三区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲美女视频黄频| 国产精品人妻久久久影院| 一级片'在线观看视频| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲色图综合在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| a级毛片黄视频| 国产精品一二三区在线看| 韩国精品一区二区三区| 美女午夜性视频免费| 日韩一区二区视频免费看| 欧美人与善性xxx| 免费高清在线观看日韩| 男女下面插进去视频免费观看| 久久性视频一级片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产激情久久老熟女| 久久ye,这里只有精品| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 一区二区三区乱码不卡18| 国产黄色视频一区二区在线观看| 一区二区三区激情视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲成人免费av在线播放| 精品一品国产午夜福利视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 在线看a的网站| 亚洲人成电影观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 黄色怎么调成土黄色| 97人妻天天添夜夜摸| 精品视频人人做人人爽| 母亲3免费完整高清在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产精品免费大片| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久人人爽人人片av| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲人成网站在线观看播放| 大香蕉久久网| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产高清不卡午夜福利| 51午夜福利影视在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 色吧在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 黄色怎么调成土黄色| 丝袜美足系列| 韩国av在线不卡| 蜜桃国产av成人99| 国产日韩欧美视频二区| 中文字幕制服av| 亚洲第一av免费看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 777米奇影视久久| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 咕卡用的链子| 丝袜脚勾引网站| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 一区福利在线观看| 波野结衣二区三区在线| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 人人妻人人澡人人看| 欧美国产精品一级二级三级| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美日韩精品网址| 韩国精品一区二区三区| 久久天堂一区二区三区四区| 久久久久久久久久久免费av| 视频在线观看一区二区三区| 极品人妻少妇av视频| 国产片内射在线| 亚洲四区av| 欧美 日韩 精品 国产| 成人午夜精彩视频在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 香蕉国产在线看| 亚洲国产欧美在线一区| av卡一久久| 国产成人欧美| 女人久久www免费人成看片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 成人国语在线视频| 在线观看免费高清a一片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | av在线app专区| 国产成人一区二区在线| 51午夜福利影视在线观看| 日韩伦理黄色片| 搡老乐熟女国产| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 一区福利在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 两性夫妻黄色片| 搡老乐熟女国产| av不卡在线播放| 十八禁高潮呻吟视频| 国产成人一区二区在线| 久久免费观看电影| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产 精品1| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产精品.久久久| 国产 一区精品| 久久影院123| a 毛片基地| 亚洲成人免费av在线播放| 黄色视频不卡| 亚洲美女黄色视频免费看| 少妇的丰满在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲三区欧美一区| 久热这里只有精品99| 亚洲中文av在线| 欧美黑人欧美精品刺激| av.在线天堂| 90打野战视频偷拍视频| a级毛片在线看网站| 十分钟在线观看高清视频www| 色视频在线一区二区三区| 97人妻天天添夜夜摸| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 成人免费观看视频高清| 麻豆av在线久日| 成人国产av品久久久| 欧美日韩综合久久久久久| 久久免费观看电影| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 乱人伦中国视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 满18在线观看网站| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 涩涩av久久男人的天堂| 高清视频免费观看一区二区| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 9191精品国产免费久久| 亚洲成人一二三区av| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美xxⅹ黑人| 日本vs欧美在线观看视频| 日本av手机在线免费观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 搡老岳熟女国产| 国产一区二区激情短视频 | 国产av国产精品国产| 国产亚洲av高清不卡| 91成人精品电影| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲人成77777在线视频| 妹子高潮喷水视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 母亲3免费完整高清在线观看| 一级毛片 在线播放| 国产免费视频播放在线视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久热这里只有精品99| 精品福利永久在线观看| 国产男女内射视频| 久久久久精品性色| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产av国产精品国产| 自线自在国产av| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲伊人久久精品综合| 久久国产亚洲av麻豆专区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 在线天堂中文资源库| 欧美日韩福利视频一区二区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 中文字幕制服av| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 美女中出高潮动态图| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲综合色网址| 国产精品一区二区精品视频观看| avwww免费| 人成视频在线观看免费观看| 夫妻午夜视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 1024香蕉在线观看| 国产精品无大码| av在线播放精品| 亚洲伊人色综图| 99精国产麻豆久久婷婷| 中文字幕色久视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 两个人免费观看高清视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 青春草亚洲视频在线观看| 老司机靠b影院| 伦理电影大哥的女人| 精品久久久久久电影网| 午夜91福利影院| 国产亚洲精品第一综合不卡| 天堂中文最新版在线下载| xxx大片免费视频| 97人妻天天添夜夜摸| 九草在线视频观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 高清欧美精品videossex| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久99精品国语久久久| 国产av国产精品国产| 涩涩av久久男人的天堂| 国产成人精品无人区| 成人影院久久| 国产成人欧美| 色网站视频免费| 各种免费的搞黄视频| 欧美日韩精品网址| 免费看不卡的av| 美女主播在线视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日韩一本色道免费dvd| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 熟妇人妻不卡中文字幕| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产男女内射视频| 韩国av在线不卡| 久久精品人人爽人人爽视色| 女人精品久久久久毛片| 9热在线视频观看99| kizo精华| 一区二区av电影网| www日本在线高清视频| 国产成人一区二区在线| 精品一区二区免费观看| 最近手机中文字幕大全| 国产精品国产av在线观看| 国产精品一国产av| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美97在线视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产免费视频播放在线视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 视频在线观看一区二区三区| 精品少妇久久久久久888优播| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 咕卡用的链子| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 18禁观看日本| 制服丝袜香蕉在线| 国产精品欧美亚洲77777| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 在线天堂最新版资源| 国产高清国产精品国产三级| 久久精品国产a三级三级三级| 在线看a的网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲国产精品国产精品| 一级,二级,三级黄色视频| 观看美女的网站| 午夜影院在线不卡| 大香蕉久久成人网| 午夜免费鲁丝| 国产日韩欧美视频二区| www.av在线官网国产| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美激情极品国产一区二区三区| 最新在线观看一区二区三区 | 搡老乐熟女国产| 韩国精品一区二区三区| 母亲3免费完整高清在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 秋霞伦理黄片| 日韩制服骚丝袜av| 久久久久国产精品人妻一区二区| 九草在线视频观看| 多毛熟女@视频| 亚洲精品一区蜜桃| 免费人妻精品一区二区三区视频| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲精品美女久久av网站| 国产激情久久老熟女| 亚洲美女搞黄在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看 | 91精品三级在线观看| 久久ye,这里只有精品| www.自偷自拍.com| 亚洲人成电影观看| a级毛片黄视频| 亚洲成人av在线免费| 两个人看的免费小视频| 精品一区二区三卡| 极品人妻少妇av视频| 久久人人爽人人片av| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产成人av激情在线播放| 搡老岳熟女国产| 99热国产这里只有精品6| 久久久久网色| 国产精品一区二区在线观看99| 91老司机精品| 日韩欧美一区视频在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 老司机靠b影院| 18在线观看网站| 国产精品熟女久久久久浪| 久久久国产精品麻豆| 在线观看国产h片| 成年动漫av网址| 国产麻豆69| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 成人亚洲精品一区在线观看| 9色porny在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 久久久久视频综合| 嫩草影视91久久| 观看av在线不卡| 一区二区三区激情视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 老司机深夜福利视频在线观看 | 少妇人妻久久综合中文| 国产精品熟女久久久久浪| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲美女黄色视频免费看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲图色成人| 男女之事视频高清在线观看 | 男人舔女人的私密视频| 国产精品一区二区在线观看99| 在线观看三级黄色| 国产精品国产三级国产专区5o| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲美女视频黄频| a级毛片黄视频| 捣出白浆h1v1| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 久久亚洲国产成人精品v| 欧美精品一区二区免费开放| 久久精品久久精品一区二区三区| 如何舔出高潮| 亚洲第一区二区三区不卡| 丰满乱子伦码专区| 五月天丁香电影| 国产精品国产av在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 国产成人免费观看mmmm| 99久久99久久久精品蜜桃| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲av男天堂| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲人成网站在线观看播放| 色综合欧美亚洲国产小说| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 国产精品免费大片| 亚洲成人免费av在线播放| 51午夜福利影视在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 新久久久久国产一级毛片| 日本色播在线视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久久国产精品麻豆| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产成人欧美| 亚洲成色77777| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲av综合色区一区| 看免费成人av毛片| 亚洲精品国产色婷婷电影| 老司机靠b影院| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲人成77777在线视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 男女无遮挡免费网站观看| 中国三级夫妇交换| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 伊人亚洲综合成人网| a级毛片黄视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 欧美另类一区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲熟女精品中文字幕| 色播在线永久视频| 女人久久www免费人成看片| 高清av免费在线| 国产精品久久久av美女十八| 视频在线观看一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 亚洲精品视频女| 欧美乱码精品一区二区三区| 色网站视频免费| 亚洲国产欧美在线一区| 国产日韩欧美在线精品| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 麻豆乱淫一区二区| 一区二区三区精品91| 不卡av一区二区三区| 男女免费视频国产| 欧美日韩视频高清一区二区三区二|