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    利用透性化黑曲霉細(xì)胞制備稀有人參皂苷Rh1的方法研究

    2019-10-08 03:03:22耿瑜蔣明星熊正紅文孟良
    關(guān)鍵詞:透性黑曲霉通透性

    耿瑜, 蔣明星, 熊正紅, 文孟良*

    ( 1.云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 云南 昆明 650500; 2.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 云南 昆明 650214 )

    0 引言

    三七人參皂苷是三七的主要藥效成分之一,包括Rb1、Rb2、Rg1、R1等常量人參皂苷組分[1-2].研究表明,常量人參皂苷在人體內(nèi)代謝后,其產(chǎn)生的稀有人參皂苷在抗炎、抗腫瘤、抗氧化以及提高免疫方面具有顯著的療效[3-7].目前,稀有人參皂苷Rh1主要是通過合成和轉(zhuǎn)化的方法來獲取[8],其中微生物轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)體系穩(wěn)定、菌種生長迅速、轉(zhuǎn)化周期短且無需分離純化酶液等優(yōu)點,受到眾多研究者的青睞[9].目前,我國利用微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)生產(chǎn)稀有人參皂苷的研究仍處于初期階段[3],相關(guān)研究多集中于把分離純化得到的單一常量人參皂苷轉(zhuǎn)化為另一種稀有人參皂苷.例如,利用Mucilaginibacter sp.(鞘氨醇單胞菌)和Microbacterium esteraromaticum(酯香微桿菌)的β -glucosidase重組酶將Re、Rg1轉(zhuǎn)化為Rg2和Rh1[10-11];利用Aspergillus niger(黑曲霉菌)中的β -glucosidase將Rf轉(zhuǎn)化為Rh1[12].本文以三七的三醇組常量人參皂苷(含Re、Rg1、R1)為底物,以透性化處理的黑曲霉細(xì)胞為轉(zhuǎn)化菌株,以此探索獲取稀有人參皂苷Rh1的微生物轉(zhuǎn)化法.

    1 材料與方法

    1.1 菌種、試劑和培養(yǎng)基

    黑曲霉菌,由實驗室分離并保存.Span-20,生工生物工程上海股份有限公司;四氯化碳、吐溫-60、吐溫- 80,天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;EDTA,BioFRoxx;戊二醛,天津盛奧化學(xué)試劑有限公司;乙醇,廣東光華科技股份有限公司;液氮,普諾斯商貿(mào)有限公司;三醇組人參皂苷(含Re、Rg1、R1,其中Rg1含量大于50%,Re和R1含量小于10%),云南西草生物科技有限公司;Rh1標(biāo)樣,云南與諾生物工程有限責(zé)任公司;硅膠板,青島海洋化工廠分廠.PDB黑曲霉菌絲體培養(yǎng)基(1 L):20 g葡萄糖,200 g馬鈴薯,自然pH.PDA黑曲霉孢子培養(yǎng)基(1 L): 20 g葡萄糖,20 g瓊脂,200 g馬鈴薯,自然pH.液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1 L): 1 g酵母粉,1 g胰蛋白胨,2 g三醇組人參皂苷(Rg1含量大于50%、Re和R1含量小于10%),自然pH.

    1.2 儀器

    電子天平,Denver Instrument TP-214;恒溫培養(yǎng)振蕩器,Eppendorf Thermonixer;恒溫水浴鍋,北京長風(fēng)儀器儀表公司;離心機,Eppendorf Centrifuge 5418;超聲破碎儀,Kudos Ultrasonic;搖床,Shiping Rocking Incubator;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,EYELA OSB -2100;高效液相色譜儀,Agilent 1100.

    1.3 實驗方法

    1.3.1種子液的制備與誘導(dǎo)培養(yǎng) 在三角瓶(250 mL)中加入50 mL PDB培養(yǎng)基,接種黑曲霉孢子,在28 ℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)2 d,制得黑曲霉菌絲體,作為種子液待用.在三角瓶(250 mL)中加入50 mL液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基,接種10%的種子液,在30 ℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d后,轉(zhuǎn)至室溫靜置培養(yǎng)7 d直至在培養(yǎng)基中能夠檢測到有稀有人參皂苷Rh1產(chǎn)生.

    1.3.2透性化細(xì)胞的制備 1)化學(xué)法.將濕重1 g 的黑曲霉細(xì)胞置于2 mL離心管中,然后加入表1中的透性化試劑1 mL.在28 ℃、50 r·min-1條件下振蕩處理30 min,離心5 min (12 000 r·min-1),以去除透性化試劑.用0.2 mol·L-1磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉+0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉,pH=8.0)洗滌沉淀細(xì)胞,離心5 min (12 000 r·min-1),最終收集的菌體即為通透性細(xì)胞.

    2)物理法.凍融處理:將濕重1 g的黑曲霉細(xì)胞置于2 mL離心管中,使用凍融(液氮速凍、45 ℃水浴溶解)的方法處理細(xì)胞,離心5 min (12 000 r·min-1)后收集得到的菌體即為通透性細(xì)胞.超聲處理:用磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉+0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉,pH=8.0)洗滌誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞,離心5 min (12 000 r·min-1)后將沉淀超聲處理(53 kHz) 15 min即得通透性細(xì)胞.

    表1 不同方法選用的試劑及其用量

    3)聯(lián)合法.將濕重1 g的黑曲霉細(xì)胞置于2 mL離心管中,分別使用凍融(液氮速凍+45 ℃水浴溶解)+超聲的方法、凍融+化學(xué)的方法、凍融+超聲+化學(xué)的方法、超聲+化學(xué)的方法處理細(xì)胞,然后離心5 min (12 000 r·min-1)去除透性化試劑.用磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉+0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉,pH=8.0)洗滌細(xì)胞后再離心5 min (12 000 r·min-1)即得通透性細(xì)胞.

    1.3.3產(chǎn)物檢測 將上述方法得到的透性化細(xì)胞與1 mL 0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的三醇組皂苷溶液水浴反應(yīng)30 min (45 ℃).用等體積正丁醇萃取溶液,然后取正丁醇層溶液進行薄層層析,展開劑為氯仿-甲醇(體積比為85∶15),顯色劑為甲醇-硫酸-乙酸(體積比為85∶5∶10).蒸干每組實驗產(chǎn)量最高的正丁醇層(0.9 mL),將得到的粉末狀樣品溶于5 mL甲醇中,過濾后取10 μL進行高效液相色譜(HPLC)檢測.色譜柱為Lichrospher C18色譜柱,柱溫為30 ℃,紫外檢測波長為203 nm,進樣量為10 μL,流動相為水(A)和乙腈(B).流動相洗脫梯度: 0~52 min, 69%(A)+31%(B); 52~53 min, 35%(A)+65%(B); 53~69 min, 100%(B); 69~76 min, 69%(A)+31%(B)(百分?jǐn)?shù)均為體積分?jǐn)?shù)).

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同試劑透性化處理黑曲霉細(xì)胞對Rh1產(chǎn)量的影響

    利用不同試劑對黑曲霉細(xì)胞進行透性化處理后,使用磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉+0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉,pH=8.0)洗滌通透性細(xì)胞,然后將其與0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的三醇組人參皂苷溶液反應(yīng)30 min (45 ℃),結(jié)果如圖1所示.對照組細(xì)胞用1 mL無菌水代替透性化試劑進行處理.

    由圖1可知,不同的透性化試劑對細(xì)胞產(chǎn)生的影響不同.四氯化碳組、四氯化碳+乙醇組的Rh1轉(zhuǎn)化率低于對照組,其原因可能是四氯化碳、四氯化碳+乙醇抑制了生物的修復(fù)功能[16],進而導(dǎo)致細(xì)胞死亡和蛋白變性; 45% span-20組、span-20+EDTA組、span-20+乙醇組的Rh1轉(zhuǎn)化率與對照組接近,這可能是45% span-20、span-20+EDTA、span-20+乙醇組未能損傷細(xì)胞膜表面蛋白,因而無法提升黑曲霉細(xì)胞的通透性作用;甲苯組、戊二醛組、乙醇組、吐溫- 60組、吐溫- 80組、EDTA組的Rh1轉(zhuǎn)化率均得到提高,其中EDTA組的轉(zhuǎn)化率最好.甲苯組、戊二醛組和乙醇組能夠提高Rh1轉(zhuǎn)化率的可能原因是,這3種試劑對微生物細(xì)胞具有微毒性,能部分損傷黑曲霉的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜,進而能夠促進細(xì)胞通透性的提高[17].吐溫-60組和吐溫-80組能夠提高Rh1轉(zhuǎn)化率的可能原因是,去垢劑促使細(xì)胞膜自溶,從而提高了細(xì)胞通透性[14].螯合劑能夠提高Rh1轉(zhuǎn)化率的可能原因是,EDTA螯合細(xì)胞膜表面的陽離子后,失去陽離子的失活膜蛋白破壞了細(xì)胞膜的完整性,進而提高了細(xì)胞的通透性[18].

    1為Rh1標(biāo)樣; 2為對照組; 3為2%甲苯; 4為2%戊二醛; 5為2% CCl4; 6為1% CCl4+2.25% EDTA; 7為1% CCl4+5%乙醇; 8為45% span-20; 9為22.5% span-20+2.25% EDTA; 10為22.5% span-20+5%乙醇; 11為0.4%吐溫- 60; 12為0.4%吐溫- 80; 13為4.5% EDTA; 14為10%乙醇圖1 不同試劑透性化處理黑曲霉細(xì)胞對Rh1產(chǎn)量的影響

    2.2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EDTA對Rh1產(chǎn)量的影響

    分別選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4.5%、5%和6%的EDTA透性化處理黑曲霉細(xì)胞,結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出,用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EDTA透性化處理細(xì)胞時,其Rh1的產(chǎn)量不同;當(dāng)EDTA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時,其Rh1的產(chǎn)量最佳.

    1為Rh1標(biāo)樣; 2為對照組; 3為1% EDTA; 4為2% EDTA; 5為3% EDTA; 6為4.5% EDTA; 7為5% EDTA; 8為6% EDTA圖2 不同質(zhì)量分類的EDTA對Rh1產(chǎn)量的影響

    2.3 不同透性化處理時間對Rh1產(chǎn)量的影響

    以3% EDTA為透性化試劑時,不同透性化處理時間對細(xì)胞通透性的影響,如圖3所示.由圖3可以看出,當(dāng)處理時間超過30 min時,Rh1的產(chǎn)量不再明顯增加.這表明,透性化處理30 min即可達到較好的滲透效果.

    1為Rh1標(biāo)樣; 2為對照組; 3為3% EDTA處理15 min; 4為3% EDTA處理30 min; 5為3% EDTA處理45 min; 6為3% EDTA處理60 min; 7為3% EDTA處理75 min; 8為3% EDTA處理90 min圖3 不同透性化處理時間對Rh1產(chǎn)量的影響

    2.4 不同透性化處理方法對Rh1產(chǎn)量的影響

    分別采用物理法(凍融的方法、超聲的方法)、化學(xué)法(3% EDTA)、物理和化學(xué)聯(lián)合法(凍融+超聲的方法、凍融+化學(xué)的方法、超聲+化學(xué)的方法、凍融+超聲+化學(xué)的方法)[13]透性化處理黑曲霉細(xì)胞,結(jié)果如圖4所示.超聲與3% EDTA聯(lián)用的方法獲得通透性細(xì)胞的效果最好,其原因可能是超聲處理對細(xì)胞損傷適宜,既能提高通透性,又可避免因改變外界環(huán)境而對胞內(nèi)復(fù)合酶系造成的傷害,即促進了胞內(nèi)復(fù)合酶系與底物的結(jié)合反應(yīng);凍融法、化學(xué)法、凍融+超聲的方法、凍融+化學(xué)的方法以及凍融+超聲+化學(xué)的方法對Rh1的產(chǎn)量影響不大,均與對照組相似,這可能是凍融的過程能夠引起蛋白交聯(lián),從而導(dǎo)致蛋白變性[19].

    1為Rh1標(biāo)樣; 2為對照組; 3為凍融法; 4為超聲法; 5為3% EDTA法; 6為凍融+超聲的方法; 7為凍融+3% EDTA的方法; 8為超聲+3% EDTA的方法; 9為凍融+超聲+3% EDTA的方法圖4 不同透性化處理方法對Rh1產(chǎn)量的影響

    2.5 產(chǎn)物的HPLC檢測

    取待測樣品(2.1中4.5% EDTA樣品、2.2中3% EDTA樣品、2.3中30 min樣品、2.4中超聲+3% EDTA樣品)的正丁醇層溶液0.9 mL,蒸干后溶解于5 mL甲醇中(稀釋5.56倍).各取10 μL待測樣品進行HPLC檢測,結(jié)果如圖5所示.采用單點校準(zhǔn)法[20]對得到的峰面積數(shù)據(jù),按照公式Ci=Cs×Si/Ss計算Rh1的濃度值,結(jié)果如表2所示.上式中Ci和Cs分別為待測溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液中Rh1組份的濃度(mg·mL-1),Si和Ss分別為待測溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液中Rh1組份的峰面積(mAU). 由圖5 B —圖5 E可知, 4種樣品的出峰保留時間(25.150、25.242、25.008、25.287 min)與Rh1標(biāo)樣(圖5 A,25.310 min)基本一致,這表明透性化處理黑曲霉細(xì)胞的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中有Rh1生成.由表2可知,超聲+3% EDTA聯(lián)用方法的通透性效果最好.

    表2 單點矯正法測得的樣品濃度

    A為Rh1標(biāo)樣; B為不同試劑透性化處理黑曲霉細(xì)胞的13號樣品(4.5% EDTA); C為不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EDTA透性化處理黑曲霉細(xì)胞的5號樣品(3% EDTA); D為不同透性化處理時間處理黑曲霉細(xì)胞的4號樣品(30 min); E為不同透性化處理方法處理黑曲霉細(xì)胞的8號樣品(超聲+3% EDTA)圖5 產(chǎn)物的HPLC檢測圖

    3 結(jié)論

    本文使用不同透性化試劑、不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的試劑、不同透性化處理時間以及不同的透性化方法對黑曲霉細(xì)胞進行透性化處理以制備稀有人參皂苷Rh1.通過薄層層析檢測和HPLC分析表明, 聯(lián)合3% EDTA與超聲法(53 kHz)時,Rh1的制得效果最好.這表明該方法能在保證細(xì)胞完整性的前提下,提高細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性,進而使底物能夠進入細(xì)胞內(nèi)與復(fù)合酶結(jié)合反應(yīng).該方法對細(xì)胞毒性小,反應(yīng)條件溫和,操作簡單,實用性強.另外,用三七的三醇型常量人參皂苷(Re、Rg1、R1)作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的底物,可節(jié)省分離和純化單一常量人參皂苷成分的時間和成本,因此本文方法為制備Rh1提供了新的思路.

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