從人體腸道菌群及脂代謝的角度比較水蘇糖與益生菌糾正腸道失衡的能力

汪清美，趙 培，陳慶森，賈 彥，閆亞麗

（1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院制藥工程學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

目前，依據(jù)微生態(tài)學(xué)原理制成的微生態(tài)制劑（microecologics）在治療便秘、腹瀉等腸道疾病方面有很普遍的應(yīng)用。益生菌、益生元和合生元都屬于微生態(tài)制劑[1-2]。報(bào)道已揭示人體攜帶有超出人體細(xì)胞數(shù)十倍甚至上百倍的微生物，其編碼的基因在數(shù)量上遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出人類自身編碼的基因，僅在腸道中寄居的微生物就有約1 800 個(gè)屬，至少40 000 種細(xì)菌，這些細(xì)菌通稱為腸道菌群，即“人體腸道元基因組”[3]。雖然人體腸道內(nèi)棲生著的微生物數(shù)量高達(dá)1014個(gè)，但細(xì)菌數(shù)量和種類卻隨著胃腸道微生物密度增高逐步增加，這表明腸道菌群分布是不均勻的[4]。

研究顯示，人體腸道菌群結(jié)構(gòu)受人體內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境共同作用和影響，宿主基因型、年齡、飲食、疾病、藥物等成為影響人體腸道菌群結(jié)構(gòu)的主要因素[2,5]。在這些因素的影響下，個(gè)體與個(gè)體之間腸道菌群的多樣性和結(jié)構(gòu)也存在著差異。Wang Fang等[6]通過(guò)Illumina測(cè)序分析了中國(guó)廣西巴馬縣年齡在85～99 歲和100～108 歲兩組老年人的腸道菌群。結(jié)果顯示，在百歲老人中，腸道菌群的變化與年齡和高纖維膳食的攝入量相關(guān)。大量研究表明，腸道正常菌群對(duì)宿主健康有著十分重要的功效[7-8]。正常情況下，人體腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)處于平衡狀態(tài)，若這種平衡被外界擾亂，就會(huì)造成菌群失調(diào)，導(dǎo)致腸道功能紊亂，甚至引發(fā)或加重疾病。許多研究也證實(shí)腸道菌群失調(diào)與便秘、腹瀉、腸易激綜合征等腸道疾病相關(guān)。因此，許多研究試圖通過(guò)改善腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)來(lái)對(duì)一些疾病進(jìn)行針對(duì)性治療，使人體恢復(fù)和維持健康狀態(tài)[9]。總之，胃腸道的健康直接影響著人們的生活質(zhì)量和生活狀態(tài)以及健康水平，所以利用益生菌或益生元等非臨床治療的手段來(lái)達(dá)到健康的目的顯得尤為重要[10-11]。本研究選擇一組特殊的志愿者為研究對(duì)象，從改善腸道微生態(tài)著手，利用Ion Torrent PGM?測(cè)序平臺(tái)觀察微生態(tài)制劑干預(yù)后各類腸道疾病志愿者腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)分析測(cè)定腸道糞便中膽固醇和膽汁酸代謝的變化。利用生物信息學(xué)的分析，建立腸道菌群結(jié)構(gòu)變化與脂代謝產(chǎn)物變化的相關(guān)性圖譜，探究服用微生態(tài)制劑糾正志愿者腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡和改善脂代謝的能力，旨在為微生態(tài)制劑在治療人體腸道疾病和改善人體健康方面提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水蘇糖、復(fù)合益生菌（compound probiotics，CPb）和合生元MF-13由河北一然生物科技有限公司提供，其組成見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。

總膽固醇測(cè)定試劑盒 北京北化康泰臨床試劑有限公司；總膽汁酸測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 德國(guó)QIAGEN公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit 寶生物工程（大連）有限公司；Qubit?dsDNA HS Assay Kit美國(guó)Invitrogen公司；PfuDNA Polymerase 美國(guó)Thermo Scientific公司；Ion Plus Fragment Library Kit、Agencourt?AMPure?XP Kit、Ion Xpress? Barcode Adapters Kit、Ion PGM? Template OT2 400 Kit、Ion PGM? Sequencing 400 Kit v2 美國(guó)Life Technologies公司。

1.2 儀器與設(shè)備

900超低溫冰箱、磁力架 美國(guó)Thermo Scientific公司；SW-CJ-2DD單人雙面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DYY-2C 電泳儀 北京六一儀器廠；508-U001 Ion Torrent PGM測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Life Technologies公司；2100生物分析儀 美國(guó)Agilent公司；Qubit 2.0熒光計(jì) 美國(guó)賽默飛世爾公司；Biowave DNA II-3分光光度計(jì) 英國(guó)柏諾公司。

1.3 方法

1.3.1 招募志愿者以及糞便樣本采集

本研究招募了一組特殊志愿者，來(lái)自合作單位河北一然生物科技有限公司，參與本研究的志愿者12 名（6男、6女），均為其公司職員和家屬，其腸道健康狀況包括健康、便秘、腹瀉、排便不規(guī)律以及口臭和失眠等癥狀（其中便秘、腹瀉癥狀由臨床醫(yī)學(xué)給定的癥狀界定，其他為自述癥狀）。在完全符合倫理道德情況下，與志愿者說(shuō)明實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮透嬷獙?shí)驗(yàn)流程，對(duì)志愿者進(jìn)行培訓(xùn)。微生態(tài)制劑干預(yù)方法參考文獻(xiàn)[24]。實(shí)驗(yàn)期間，要求志愿者不服用抗生素藥物以及其他藥物。

糞便采集：發(fā)給志愿者糞便收集袋、采集樣本的棉棒、保存樣本的凍存管，經(jīng)培訓(xùn)后，自行采集糞便樣本，將采集的糞便樣品立即放入-20 ℃冷凍環(huán)境中。于干冰環(huán)境中4 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，存放于-80 ℃冰箱。采集樣本的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 本研究糞便樣本收集信息Table 1 Information about fecal samples collected in this study

1.3.2 糞便微生物16S rRNA高通量測(cè)序

糞便微生物DNA的提取參考文獻(xiàn)[12]。將DNA提取液適當(dāng)稀釋，結(jié)果A260nm/A280nm在1.8～2.0之間；取樣品DNA提取液5 μL，采用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像儀下觀察DNA條帶狀態(tài)，結(jié)果顯示獲得了完整且濃度較高的糞便細(xì)菌DNA。16S rRNA V3區(qū)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增參考文獻(xiàn)[12]。按照Ion Plus Fragment Library Kit和Ion Xpress?Barcode Adapters Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建。

按照Ion PGM? Template OT2 400 Kit試劑盒說(shuō)明書配置模板制備體系，最后按照Ion OneTouch 2儀器標(biāo)準(zhǔn)操作說(shuō)明進(jìn)行測(cè)序模板的制備，按照Ion OneTouchTMES操作規(guī)范并利用Ion PGMTMTemplate OT2 200 Kit試劑盒配置富集和洗脫反應(yīng)體系，Ion OneTouchTMES儀器自動(dòng)進(jìn)行離子微球顆粒（ion sphere particles，ISPs）的富集。上機(jī)測(cè)序操作參見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。

1.3.3 糞便中膽固醇含量的檢測(cè)

參照Kim等[13]方法，稱取糞便樣品0.2 g，轉(zhuǎn)入10 mL離心管，加入5 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V），充分勻漿。勻漿液以4 000 r/min離心l0 min，取2 mL上清移入干凈10 mL離心管，65 ℃水浴條件下用N2吹干，殘?jiān)屑? mL甲醇溶解，按照總膽固醇試劑盒說(shuō)明書測(cè)定提取液中膽固醇的質(zhì)量濃度，并進(jìn)一步計(jì)算出糞便中的膽固醇含量。

1.3.4 糞便中總膽汁酸含量的測(cè)定

用10 mL離心管稱取凍存的糞便樣品約500 mg，加入5 mL蒸餾水，充分勻漿，勻漿液4 000 r/min離心10 min，取上清液[14]，按照總膽汁酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定上清液中總膽汁酸質(zhì)量濃度，并進(jìn)一步計(jì)算出糞便中的膽汁酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)及多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生態(tài)制劑干預(yù)后糞便中膽汁酸和膽固醇含量的變化

如圖1所示，各干預(yù)組中糞便膽汁酸和膽固醇的含量波動(dòng)較大，干預(yù)過(guò)程中均有顯著或極顯著變化，但整體變化趨勢(shì)不明顯。從膽汁酸含量的變化趨勢(shì)來(lái)看，微生態(tài)制劑干預(yù)1～2 周時(shí)，幾乎所有樣本較干預(yù)前都有顯著變化，但在干預(yù)3～8 周或干預(yù)后，除CPb組的失眠樣本外，膽汁酸含量基本上又恢復(fù)到干預(yù)前水平的趨勢(shì)，但含量整體上高于干預(yù)前水平。多數(shù)干預(yù)組膽固醇含量在干預(yù)3～8 周或干預(yù)后階段與干預(yù)前相比有顯著變化（P＜0.05、P＜0.01）。多數(shù)樣本（如水蘇糖干預(yù)組和CPb干預(yù)組）結(jié)果顯示，膽汁酸和膽固醇水平表現(xiàn)出此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，其因可能是膽汁酸的肝腸循環(huán)所致，即當(dāng)腸道膽汁酸隨糞便排放量增加或減少時(shí)，膽固醇通過(guò)在肝臟中代謝來(lái)回補(bǔ)腸道膽汁酸的損失，引起腸道對(duì)膽固醇吸收增強(qiáng)或減弱[14]，而使糞便當(dāng)中膽固醇含量呈現(xiàn)出減少或增加的趨勢(shì)。而在MF-13干預(yù)組中，膽汁酸和膽固醇水平變化趨勢(shì)呈正相關(guān)，且對(duì)促進(jìn)腸道中膽汁酸和膽固醇排出有較明顯的作用，說(shuō)明MF-13可能是通過(guò)影響膽汁酸的正反饋調(diào)節(jié)來(lái)使腸道中膽汁酸和膽固醇排出量增加。

圖1 各人群糞便中膽汁酸（A）和膽固醇（B）含量的變化Fig.1 Changes in bile acid (A) and cholesterol (B) contents in feces of different populations

為進(jìn)一步探究3 種微生態(tài)制劑對(duì)糞便膽汁酸和膽固醇含量的影響，通過(guò)箱線圖將其在干預(yù)各階段的變化趨勢(shì)直觀地展示出來(lái)。從圖2A中可以看出，水蘇糖和CPb干預(yù)組中膽汁酸含量整體水平波動(dòng)，變化趨勢(shì)不明顯，且干預(yù)前后無(wú)顯著性差異；而MF-13干預(yù)組中糞便中膽汁酸水平隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)呈持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，整體上在3～8 周時(shí)增長(zhǎng)顯著（P＜0.05），但在干預(yù)后有所回落，接近干預(yù)前水平。從圖2B中可以看出，水蘇糖和CPb干預(yù)組中膽固醇含量變化總體呈先下降后上升的趨勢(shì)，MF-13干預(yù)組中膽固醇平均含量變化趨勢(shì)與膽汁酸相似，在3～8 周時(shí)最高和最低值差異很大，停止干預(yù)后回到干預(yù)前的平均水平。說(shuō)明3 種微生態(tài)制劑在干預(yù)過(guò)程中對(duì)糞便膽汁酸和膽固醇含量影響最為顯著是MF-13，其能夠促進(jìn)腸道中膽汁酸和膽固醇的排出。但膽汁酸和膽固醇均在3 種微生態(tài)制劑干預(yù)后（即停止干預(yù)）含量恢復(fù)至干預(yù)前水平，表明微生態(tài)制劑對(duì)腸道膽汁酸和膽固醇的代謝可能有改善作用，但沒(méi)有持續(xù)性的影響。

圖2 3 種微生態(tài)制劑對(duì)糞便中膽汁酸（A）和膽固醇（B）含量的影響Fig.2 Effects of three microecological agents on contents of bile acids (A) and cholesterol (B) in feces

2.2 志愿者糞便微生物16S rRNA V3區(qū)測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建

經(jīng)StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光PCR儀擴(kuò)增定量，結(jié)果顯示，各樣本文庫(kù)濃度在50～300 pmol/L范圍內(nèi)，均達(dá)到測(cè)序要求（≥10 pmol/L）。通過(guò)Ion Torrent PGM高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣品文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，最終得到5 907 273 條原始序列，序列長(zhǎng)度大多分布在170～200 bp范圍內(nèi)，由于細(xì)菌16S rRNA基因的V3區(qū)長(zhǎng)度為180 bp左右，所以測(cè)序基本符合V3區(qū)要求。對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，在Bio-Linux操作系統(tǒng)下進(jìn)行fastqc操作，最終，通過(guò)NGStoolkits軟件過(guò)濾掉序列長(zhǎng)度低于50 bp和質(zhì)量低于Q20的序列，得到2 659 306 條高質(zhì)量序列。

以97%序列一致性為前提，經(jīng)過(guò)Usearch軟件對(duì)所有樣品的全部Tags序列進(jìn)行聚類，劃分得到1 067 個(gè)操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），其中有907 個(gè)OTU鑒定到科，666 個(gè)OTU鑒定到屬，587 個(gè)OTU鑒定到種，根據(jù)物種注釋情況，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品注釋到各分類水平上的序列數(shù)目，由此可以了解各分類水平的整體注釋情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 糞便微生物的OTU聚類和注釋情況統(tǒng)計(jì)Fig.3 Clustering and annotation statistics of OTU from fecal microbial samples

2.3 志愿者腸道菌群α多樣性分析

2.3.1 測(cè)序深度分析

如圖4A所示，隨著測(cè)序量的增大，所有樣本的Shannon指數(shù)都到達(dá)平臺(tái)期，說(shuō)明在此測(cè)序量下所有樣本中絕大多數(shù)菌群都能被發(fā)現(xiàn)。圖4B顯示，隨著測(cè)序數(shù)據(jù)量的增加，分析得到的類群數(shù)目也逐漸增長(zhǎng)，最終曲線趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。如圖4C所示，隨著物種范圍的擴(kuò)大，所有樣品Chao1指數(shù)基本達(dá)到飽和，說(shuō)明所有樣本中絕大多數(shù)物種都被發(fā)現(xiàn)。如圖4D所示，隨著OTU種類的增多，曲線趨于水平，反映了較好的物種豐度和均勻度。用于判斷樣本量是否能充分估計(jì)物種豐富度的物種累積曲線如圖4E所示，隨著樣本量的增加，曲線趨于平緩，說(shuō)明抽樣量充分，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

圖4 志愿者腸道菌群多樣性分析Fig.4 Analysis of intestinal flora diversity of the volunteers

2.3.2 多樣性指數(shù)分析

如圖5所示，Goods_coverage指數(shù)在3 種微生態(tài)制劑的各干預(yù)階段呈無(wú)規(guī)則小幅度波動(dòng)狀，說(shuō)明人體腸道菌群在各微生態(tài)制劑干預(yù)前后物種多樣性并無(wú)明顯變化。Shannon和Simpson指數(shù)變化總體趨勢(shì)較為相似：在干預(yù)1～4 周階段內(nèi)，MF-13干預(yù)組Shannon和Simpson指數(shù)均有所升高，而水蘇糖和CPb干預(yù)組Shannon和Simpson指數(shù)均有所下降；在干預(yù)5～8 周和干預(yù)后階段，水蘇糖干預(yù)組和MF-13干預(yù)組Shannon指數(shù)持續(xù)均呈下降趨勢(shì)，Simpson指數(shù)干預(yù)后與5～8 周相比均有所下降，而CPb干預(yù)組Shannon和Simpson指數(shù)均為先下降后升高。水蘇糖和CPb干預(yù)組的Chao1指數(shù)在干預(yù)階段呈下降趨勢(shì)，MF-13干預(yù)組Chao1指數(shù)1～4 周階段明顯升高，但隨后的干預(yù)階段呈下降趨勢(shì)。各干預(yù)組中Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)變化說(shuō)明微生態(tài)制劑干預(yù)前后物種的多樣性以及均勻度變化是復(fù)雜的，但整體來(lái)說(shuō)變化不大。

圖5 微生態(tài)制劑對(duì)腸道微生物多樣性指數(shù)的影響Fig.5 Effects of microecological agents on gut microbial diversity indexes

2.4 微生態(tài)制劑對(duì)志愿者腸道菌群在門和屬水平上豐度的影響

2.4.1 門水平的豐度變化

在所得到每個(gè)OTU包含的序列中，選取豐度最高的為代表序列，進(jìn)而以此來(lái)劃分細(xì)菌分類地位，最后運(yùn)用R軟件對(duì)所有樣本在門水平和屬水平上作相對(duì)豐度柱狀圖，如圖6所示。在門水平上選取每個(gè)樣本最大豐度排名前十的物種，所有OTU被劃分為10 個(gè)菌門，即疣微菌門（Verrucomicrobia）、TM7菌門、無(wú)壁菌門（Tenericutes）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）。其中優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），占到了總序列數(shù)的91.65%，其中擬桿菌門（Bacteroidetes）約占總序列數(shù)的70.10%，厚壁菌門（Firmicutes）則占總序列數(shù)的21.55%。其次是變形菌門（Proteobacteria），約占總序列數(shù)的7.30%，放線菌門約占總序列數(shù)的0.85%。無(wú)壁菌門（Tenericutes）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、TM7菌門和疣微菌門（Verrucomicrobia）等在各樣品中所占比例基本都不足0.5%，還有0.1%左右的無(wú)法確定具體分類地位的細(xì)菌（Unassigned）。

圖6 各物種在門水平上的相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of dominant phyla

水蘇糖干預(yù)組各樣本中擬桿菌門相對(duì)豐度在干預(yù)后整體上均有所升高，而厚壁菌門相應(yīng)有所降低，兩者大致呈此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，其中，便秘（C）和大便異常（S1）兩種樣本中擬桿菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度變化幅度較大，擬桿菌門相對(duì)豐度分別由47.55%和29.18%增長(zhǎng)至89.52%和69.96%（干預(yù)前到實(shí)驗(yàn)的最后一個(gè)階段，下同），厚壁菌門相對(duì)豐度分別由44.11%和65.82%降低至8.93%和11.99%；此外，變形菌門相對(duì)豐度在水蘇糖組各樣本中變化較明顯的為便秘（C）（由4.21%降至0.51%）、大便異常（S1）（由2.27%升至16.01%）和失眠（I1）（由7.50%降至3.77%）這3 類樣本；說(shuō)明水蘇糖對(duì)不同腸道環(huán)境的個(gè)體影響存在一定的差異；放線菌門和梭桿菌門所占豐度較小，除健康（H1）和大便異常（S1）樣本外，其余均無(wú)明顯變化。CPb干預(yù)組中，擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度在失眠（I2）樣本中分別呈現(xiàn)增長(zhǎng)和降低的趨勢(shì)，而在健康（H2）樣本中則變化趨勢(shì)與前者相反，在其余樣本（腹瀉（D1）、口氣異常（T1））中變化幅度不大；變形菌門相對(duì)豐度在腹瀉樣本中由7.8%降至0.50%，而在其余樣本（H2、T1、I2）中有增長(zhǎng)趨勢(shì)；放線菌門和梭桿菌門相對(duì)豐度在各樣本中整體變化不明顯。MF-13干預(yù)組中，擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度整體均無(wú)明顯變化；而變形菌門和放線菌門相對(duì)豐度呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，健康（H3）樣本和口氣異常（T2）樣本中變形菌門分別由8.26%和0.8%增長(zhǎng)至16.02%和1.50%，而放線菌門分別由0.75%和0.12%增長(zhǎng)至2.26%和0.44%，梭桿菌門相對(duì)豐度幾乎沒(méi)有變化。

從各類志愿者樣本來(lái)看，在微生態(tài)制劑干預(yù)前，同類志愿者之間腸道菌群在門水平上的結(jié)構(gòu)存在差異。健康人群（H1、H2、H3，分別由水蘇糖、CPb和MF-13干預(yù)）腸道菌群在門水平上的變化表現(xiàn)為：H1樣本擬桿菌門、放線菌門和梭桿菌門相對(duì)豐度增高，而厚壁菌門和變形菌門相對(duì)豐度下降。H2樣本擬桿菌門相對(duì)豐度有所降低，厚壁菌門和變形菌門相對(duì)豐度增加，放線菌門和梭桿菌門相對(duì)豐度變化趨勢(shì)不明顯；H3樣本擬桿菌門、厚壁菌門和梭桿菌門相對(duì)豐度變化幅度較小，而放線菌門和變形菌門相對(duì)豐度增長(zhǎng)趨勢(shì)較明顯。說(shuō)明在日常飲食不受控制的前提下，3 種微生態(tài)制劑對(duì)健康志愿者腸道菌群豐度有不同的影響，有較為突出的個(gè)體差異，總地來(lái)看，水蘇糖對(duì)腸道菌群擬桿菌門和厚壁菌門比例的調(diào)節(jié)作用最明顯。便秘人群（C1、C2均由水蘇糖干預(yù)）腸道菌群門水平上的變化為：擬桿菌門相對(duì)豐度大幅增長(zhǎng)，厚壁菌門和變形菌門相對(duì)豐度明顯降低，而放線菌門和梭桿菌門變化趨勢(shì)不明顯。說(shuō)明水蘇糖對(duì)便秘人群腸道菌群結(jié)構(gòu)有明顯的調(diào)節(jié)作用，并且在干預(yù)后各菌門的豐度水平逐漸接近于同組健康人群，此外，包含有很多病原菌的變形菌門豐度降低，可能也對(duì)患者的腸道健康起到積極作用。失眠人群I1、I2兩個(gè)樣本（分別由水蘇糖和CPb干預(yù)）的擬桿菌門和厚壁菌門豐度變化趨勢(shì)相同，而變形菌門豐度與其變化趨勢(shì)相反。說(shuō)明CPb與水蘇糖在調(diào)節(jié)擬桿菌門和厚壁菌門豐度變化有相似作用，而CPb中包含的各種外源益生菌可能同時(shí)對(duì)變形菌門的增殖產(chǎn)生促進(jìn)作用?？跉猱惓Ｈ巳海═1、T2，分別由CPb和MF-13干預(yù)）兩樣本干預(yù)前后腸道菌群門水平結(jié)構(gòu)均相似，干預(yù)后，擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度變化不大，而變形菌門和放線菌門豐度均有所升高。說(shuō)明CPb和MF-13自身攜帶的外源益生菌可能主要通過(guò)改變這兩者的豐度來(lái)調(diào)節(jié)腸道菌群。腹瀉樣本（D1，由CPb干預(yù)）中變化趨勢(shì)較為明顯的是變形菌門和放線菌門，同以上CPb組干預(yù)結(jié)果；腹脹樣本（A1，由水蘇糖干預(yù)）和大便異常樣本（S1，由水蘇糖干預(yù)）菌群變化趨勢(shì)同以上水蘇糖組干預(yù)結(jié)果。

通過(guò)以上結(jié)果可以得出，水蘇糖對(duì)人體腸道菌群中擬桿菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度影響較大，能大幅提高擬桿菌門豐度而降低厚壁菌門豐度，并以此來(lái)影響整體腸道菌群結(jié)構(gòu)。有調(diào)查報(bào)告顯示，成年人體腸道內(nèi)擬桿菌門和厚壁菌門存在一種相互促進(jìn)的共生關(guān)系，且兩者的比例與肥胖之間有直接關(guān)系，兩者比例降低會(huì)促進(jìn)肥胖，而擬桿菌門豐度升高或厚壁菌門降低也伴隨著體脂量的減少[15]。以此推斷水蘇糖可能具備預(yù)防人體肥胖發(fā)生的功能。CPb干預(yù)組中，可能由于樣本量較少，除個(gè)別樣本外，擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度整體變化規(guī)律不明顯，在整個(gè)干預(yù)過(guò)程中呈現(xiàn)波動(dòng)，對(duì)腸道菌群整體結(jié)構(gòu)影響較小，這也可能與志愿者的飲食、生活習(xí)慣不同以及干預(yù)時(shí)間較短有關(guān)。MF-13對(duì)擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度無(wú)明顯影響，而對(duì)變形菌門和放線菌門菌群的增殖有促進(jìn)作用，可能是MF-13含有的益生元為其含有的外源益生菌同時(shí)提供了增殖底物，并促進(jìn)了腸道內(nèi)變形菌門和放線菌門菌群的增殖。

2.4.2 屬水平的豐度變化

在屬水平上選取每個(gè)樣本最大豐度排名前十的物種，如圖7所示，包括擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、毛螺菌屬（Lachnospira）、巨型球菌屬（Megasphaera）、薩特氏菌屬（Sutterella）、巨單胞菌屬（Megamonas）、柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium）、Parabacteroides、光崗菌屬（Mitsuokella）以及小類桿菌屬（Dialister）。其中優(yōu)勢(shì)菌屬為同屬于擬桿菌門下的擬桿菌屬（Bacteroides）和普雷沃氏菌屬（Prevotella）（各占總序列數(shù)的33.1%和33.8%）。

圖7 各物種在屬水平上的相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundance of dominant genera

在水蘇糖干預(yù)組中，普雷沃氏菌屬（Prevotella）隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)相對(duì)豐度呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，而擬桿菌屬（Bacteroides）則波動(dòng)變化，其中變化較明顯的為便秘樣本C1和大便異常樣本S1，樣本C1在水蘇糖干預(yù)后，普氏桿菌屬和擬桿菌屬分別由2.84%和13.79%增長(zhǎng)至16.49%和64.64%；在干預(yù)過(guò)程中樣本S1普氏桿菌屬和擬桿菌屬豐度均有增長(zhǎng)趨勢(shì)，但停止干預(yù)后擬桿菌屬又回降至干預(yù)前水平，而普氏桿菌屬豐度由8.40%增長(zhǎng)至72.90%；毛螺菌屬（Lachnospira）、柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium）和巨型球菌屬（Megasphaera）在干預(yù)過(guò)程中相對(duì)豐度普遍呈下降趨勢(shì)；薩特氏菌屬（Sutterella）相對(duì)豐度變化較明顯的是樣本C1，其由最1.45%降低至0.18%，其次是樣本I1，其由1.26%降低至0.31%，而在其余樣本中變化不大；巨單胞菌屬（Megamonas）相對(duì)豐度在樣本H1和樣本A1中有所降低，分別由3.4%和0.2%降低至0.68%和0.05%，而在樣本C1中由0.01%增至0.34%；Parabacteroides相對(duì)豐度在樣本S1和I1中變化幅度較大，分別由1.24%和0.32%降低至0.25%和0.05%，而在其余樣本中變化不大；除樣本S1外，其余各樣本中的光崗菌屬（Mitsuokella）相對(duì)豐度幾乎沒(méi)有變化；小類桿菌屬（Dialister）在各樣本中豐度有增高趨勢(shì)，但變化不顯著。在CPb干預(yù)組中，普雷沃氏菌屬（Prevotella）和擬桿菌屬（Bacteroides）相對(duì)豐度總體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在失眠樣本I2中擬桿菌屬相對(duì)豐度大幅增長(zhǎng)，由19.8%增長(zhǎng)至82.84%；毛螺菌屬（Lachnospira）和柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium）在各樣本中相對(duì)豐度基本變化不大，只在腹瀉樣本D1中變化明顯，毛螺菌屬相對(duì)豐度由9.75%降至0.23%，而柔嫩梭菌相對(duì)豐度在大幅升高之后又降低到原水平；薩特氏菌屬（Sutterella）相對(duì)豐度在樣本D1中降低，在樣本I2中由0.78%增至5.23%；巨型球菌屬（Megasphaera）、Parabacteroides、光崗菌屬（Mitsuokella）、小類桿菌屬（Dialister）和巨單胞菌屬（Megamonas）相對(duì)豐度則無(wú)顯著變化。在MF-13干預(yù)組中，口氣異常樣本T2中普雷沃氏菌屬（Prevotella）相對(duì)豐度先降低后升高，但最終低于干預(yù)前水平，小類桿菌屬（Dialister）和毛螺菌屬（Lachnospira）相對(duì)豐度呈降低趨勢(shì)，薩特氏菌屬（Sutterella）呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，其余菌屬變化不明顯；健康樣本H3中菌群相對(duì)豐度變化則表現(xiàn)為Parabacteroides和巨單胞菌屬（Megamonas）略微升高，毛螺菌屬（Lachnospira）略微降低。

以上結(jié)果表明3 種微生態(tài)制劑均能提高普雷沃氏菌屬、擬桿菌屬的相對(duì)豐度，而對(duì)其余菌屬相對(duì)豐度影響主要表現(xiàn)在病理（便秘、腹瀉、大便異常以及腹脹）人群樣本中，如水蘇糖能降低便秘和失眠樣本中變形菌門下的薩特菌屬的相對(duì)豐度，CPb有降低腹瀉樣本中薩特菌屬以及升高具有抗炎性的柔嫩梭菌屬（Faeca Libacterium）相對(duì)豐度的作用，MF-13能夠提高樣本中Parabacteroides的相對(duì)豐度，有研究顯示，健康人腸道中Parabacteroides水平高于腸道疾病患者[16]。說(shuō)明微生態(tài)制劑對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)影響特點(diǎn)雖有不同，但是均能通過(guò)降低有害菌或提高有益菌的豐度來(lái)改善腸道病理狀況。

不同志愿者腸道內(nèi)核心菌屬呈現(xiàn)較大的差異性，大致分為兩類：一類以擬桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，另一類以普雷沃氏菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。以為擬桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬的為健康（H2、H3）、便秘（C1）、腹瀉（D1）、口氣異常（T1）、失眠（I2）志愿者，擬桿菌屬的平均相對(duì)豐度為60.70%，而以普雷沃氏菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬的為健康、腹脹（A1）、口氣異常（T2）、失眠（I1）志愿者，普雷沃氏菌屬的平均相對(duì)豐度為79.92%。這與Wu等[17]的研究相符，其將居民的腸道菌群劃分為以擬桿菌屬（Bacteroides）和普雷沃氏菌屬（Prevotella）為核心的兩種獨(dú)立腸道型（enterotype）[18]。

在以普雷沃氏菌屬（Prevotella）為核心菌屬的樣本（如H1、H2、A1、T2、I1）中，微生態(tài)制劑干預(yù)前后，除H2樣本的核心菌屬相對(duì)豐度有較大波動(dòng)外，大部分樣本核心菌屬相對(duì)豐度未有大幅度變化；在以擬桿菌屬（Bacteroides）為核心菌屬的樣本（如H3、D1、T1）中，擬桿菌屬相對(duì)豐度在微生態(tài)制劑干預(yù)過(guò)程中有一些波動(dòng)，其中腹瀉樣本（D1）在CPb干預(yù)第1周擬桿菌屬菌群豐度迅速升高，但隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)又恢復(fù)至接近干預(yù)前水平。以上結(jié)果說(shuō)明，各類微生態(tài)制劑對(duì)人體腸道菌群核心菌屬的影響較小，同時(shí)也印證了腸道菌群是一個(gè)處于動(dòng)態(tài)平衡的生態(tài)系統(tǒng)，在人類進(jìn)化過(guò)程當(dāng)中，通過(guò)長(zhǎng)期飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣及生存環(huán)境影響而形成的腸型結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，其穩(wěn)定與人體健康息息相關(guān)[19-20]，因此，本研究有力地證明，短時(shí)間內(nèi)在外界的擾動(dòng)或干預(yù)下，腸道原有的菌群結(jié)構(gòu)不會(huì)發(fā)生較大改變。而個(gè)別樣本與以上變化結(jié)果不同，如便秘樣本C1、大便異常樣本S1及失眠樣本I2在干預(yù)前后核心菌屬均有波動(dòng)甚至改變，但在干預(yù)后基本保持穩(wěn)定，說(shuō)明病理狀態(tài)下的樣本可能本身存在腸道菌群失調(diào)的狀況，而在微生態(tài)制劑干預(yù)作用下，可逐步恢復(fù)到穩(wěn)定的健康狀態(tài)，也可能由于取樣不均勻的原因，造成了核心菌屬的較大波動(dòng)。

2.5 微生態(tài)制劑對(duì)腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的影響

2.5.1 樣品聚類分析和降維分析

利用多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)和UniFrac系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化方法分析微生態(tài)制劑干預(yù)后人體腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的變化。首先，為了進(jìn)一步研究OTUs的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系以及后續(xù)β多樣性指數(shù)研究的需要，通過(guò)多序列比對(duì)得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，選取相對(duì)豐度排名前10的屬所對(duì)應(yīng)OTUs的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系數(shù)據(jù)，并結(jié)合每個(gè)OTUs的相對(duì)豐度及其代表序列的物種注釋置信度信息進(jìn)行整合展示[21-22]。這些屬中的OTU之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系如圖8所示。同屬于擬桿菌門的普雷沃氏菌屬（Prevotella）和擬桿菌屬（Bacteroides）為人體腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌屬，而且在進(jìn)化關(guān)系上較為接近，與前文中研究結(jié)果相同；其次，菌群豐度從大到小排列依次為薩特菌屬（Sutteralla）、柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium）、Parabacteroides、巨單胞菌屬（Megamonas）、小類桿菌屬（Dialister）、Blautia菌屬、毛螺菌屬（Lachnospira）和Phascolartobacterium菌屬。

圖8 OTU的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree of all OTU

隨后對(duì)OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行unweighted 和weighted UniFrac分析，生成相關(guān)的UniFrac距離矩陣。通過(guò)基于UniFrac的非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）分析和基于OTU水平的無(wú)度量多維標(biāo)定（non-metric multi-dimensional scaling，NMDS）分析[23]）來(lái)分析微生態(tài)制劑對(duì)人體腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的影響。

UPGMA聚類結(jié)果如圖9所示，左側(cè)為聚類樹(shù)，右側(cè)為各樣品在門水平上最大相對(duì)豐度排名前十物種的相對(duì)豐度分布圖。NMDS結(jié)果如圖10所示，其結(jié)果與UPGMA聚類結(jié)果相同。NMDS結(jié)果顯示，不同受試人群樣點(diǎn)群基本上分開(kāi)，而同類志愿者樣點(diǎn)基本聚在一起，很好地反映出各類人群腸道菌群結(jié)構(gòu)差異的特點(diǎn)。從圖中各樣點(diǎn)群來(lái)看，失眠（I2）與健康（H1、H2）樣點(diǎn)未交疊在一起，便秘（C1、C2）、大便異常（S1）、健康（H3）及腹瀉（D1）樣點(diǎn)的距離較接近，而口氣異常（T1）和腹脹（A1）樣點(diǎn)與其他樣點(diǎn)分開(kāi)距離較大且各自緊密成簇，微生態(tài)制劑干預(yù)后樣點(diǎn)與干預(yù)前樣點(diǎn)分開(kāi)距離較小，且與其他樣本點(diǎn)無(wú)任何交疊，原因可能是志愿者的腸道菌群結(jié)構(gòu)相對(duì)較穩(wěn)定，受外界干預(yù)擾動(dòng)較小；從各樣點(diǎn)群內(nèi)來(lái)看，各類人群菌群結(jié)構(gòu)基本上是隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，與干預(yù)前差異增大，而停止干預(yù)后，樣點(diǎn)又逐漸接近干預(yù)前的樣點(diǎn)，雖然微生態(tài)制劑干預(yù)的過(guò)程中對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)有一定的調(diào)節(jié)作用，但干預(yù)停止后腸道菌群結(jié)構(gòu)又恢復(fù)至干預(yù)前，可能是因?yàn)橹驹刚唢嬍辰Y(jié)構(gòu)、年齡或生活習(xí)慣對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)作用較大原因。說(shuō)明相對(duì)短期的外源干預(yù)并不能使腸道菌群結(jié)構(gòu)有較大改變。其中較為特殊的是便秘（C1）樣點(diǎn)，在微生態(tài)制劑干預(yù)前后在圖中橫軸方向上拉開(kāi)較大距離，并逐漸靠向腹瀉樣點(diǎn)群，說(shuō)明水蘇糖對(duì)便秘志愿者的腸道菌群結(jié)構(gòu)有著顯著的調(diào)節(jié)作用，并有助于改善便秘的病理狀況。

圖9 基于weighted UniFrac距離的UPGMA聚類樹(shù)Fig.9 UPGMA clustering tree based on the weighted Unifrac distance

圖10 志愿者腸道微生物樣本的NMDS分析Fig.10 NMDS analysis of fecal microbial samples from volunteers

2.5.2 樣本豐度聚類結(jié)果

如圖11所示，所有樣本中，除口氣異常樣本T1、腹脹樣本A1中干預(yù)前后樣本均單獨(dú)聚在一起外，其余受試人群的樣本均出現(xiàn)交疊，其中交疊跨度最大的為便秘樣本，此結(jié)果與圖10結(jié)果相似，說(shuō)明微生態(tài)制劑對(duì)大部分樣本腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，尤其是對(duì)水蘇糖干預(yù)下的便秘樣本影響顯著。

圖11 物種豐度聚類熱圖Fig.11 Heatmap showing the clustering of species abundance

從圖11可以看出，各樣品的菌屬存在明顯的差異，差異明顯的為普雷沃氏菌屬（Prevotella）和擬桿菌屬（Bacteroides），兩菌屬對(duì)應(yīng)區(qū)域黃、藍(lán)顏色差異明顯，從橫向（樣本）來(lái)看，普雷沃氏菌屬在左右兩側(cè)偏藍(lán)，中間偏黃，而擬桿菌屬在左右兩側(cè)偏黃，中間偏藍(lán)，說(shuō)明兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，同時(shí)可以看出，聚類圖根據(jù)這兩種菌屬的豐度將受試樣本主要?jiǎng)澐譃榉謩e以擬桿菌屬和普雷沃氏菌屬為核心菌屬的兩類，再次印證了腸道型的概念。

物種豐度聚類熱圖中菌屬豐度較高的菌屬及其對(duì)應(yīng)的樣本，以及樣本中膽固醇和膽汁酸含量變化情況如表2所示?？梢钥闯鲈诟深A(yù)前，C1、C2、S1、I2、DI這些病理樣本相對(duì)豐度較高的菌群不同，并且在干預(yù)中和干預(yù)后階段這些菌群豐度大幅降低，說(shuō)明微生態(tài)制劑的干預(yù)可能導(dǎo)致了這些菌群豐度的降低，并且這些菌群也可能是引起相應(yīng)病理狀況的特征菌。在干預(yù)中階段，樣本H1、C2、S1、H2、T1、T2、H3中有一些菌群豐度升高，在干預(yù)后階段H3樣本中也有相應(yīng)菌群豐度增加，其中在MF-13干預(yù)下，外源益生菌Parabacteroides和Bifidobacterium相對(duì)豐度大幅增加。說(shuō)明3 種制劑具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，其中MF-13對(duì)于增加腸道菌群中的有益菌有更顯著的作用。

表2 個(gè)體中豐度較高的腸道菌群Table 2 Intestinal bacterial genera with high abundance in individuals

此外，結(jié)合膽汁酸和膽固醇含量變化來(lái)看，如在干預(yù)前，C1.P、C2.P、D1.P樣本對(duì)應(yīng)的糞便膽固醇和膽汁酸水平均較低，但在干預(yù)后兩者均有升高趨勢(shì)，在干預(yù)中階段，H1.S.4、S1.S.3、T2.S.1等樣本對(duì)應(yīng)的糞便膽固醇和膽汁酸水平有升高或者降低，而這些樣本對(duì)應(yīng)的豐度較高的菌屬隨后豐度降低，說(shuō)明這些菌屬可能是影響腸道脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵菌屬，但其對(duì)糞便膽固醇和膽汁酸水平變化的影響規(guī)律不盡相同，并且這些較高豐度的菌屬以及其對(duì)于腸道脂質(zhì)代謝的具體作用機(jī)制和潛在臨床意義還有待于一步探索。

2.6 Metastat統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

經(jīng)Metastat分析檢測(cè)各組腸道菌群中具有明顯差異的物種。從各干預(yù)組來(lái)看，樣本在微生態(tài)制劑干預(yù)前后并無(wú)OTUs豐度的明顯變化，因本研究中志愿者復(fù)雜、分組較多，且具有不同的腸型[18]，所以嘗試從腸型入手，分析微生態(tài)制劑干預(yù)過(guò)程中同種腸型下各樣本間腸道菌群中具有顯著性差異的菌屬。文獻(xiàn)[24]展示了不同受試人群腸道菌群具有顯著差異（P＜0.05、q＜0.05，q值是P值校正后的結(jié)果）的物種，與本研究中的差異物種一致。

分析以普雷沃氏屬為核心菌屬的樣本H1、A1、I1、T2，以健康樣本H1為參照，將樣本A1、I1、T2分別與其進(jìn)行兩兩對(duì)比經(jīng)Metastat分析發(fā)現(xiàn)（表格未附上，下同），腹脹樣本A1、失眠樣本I1與H1之間在門、綱和目水平上沒(méi)有差異顯著的菌群，而樣本A1中消化球菌科（Peptococcaceae）相對(duì)豐度高于樣本H1，失眠樣本I1與H1相比，Barnesiellaceae科和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）相對(duì)豐度較低，而B(niǎo)utyricicoccus相對(duì)豐度較高；口氣異常樣本T2與H1相比，厚壁菌門（Firmicutes）及其門下的梭菌綱（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）及毛螺菌科（Lachnospiraceae）相對(duì)豐度較高，并且T2中變形菌門下的變形菌綱（Deltaproteobacteria）、脫硫弧菌目（Desulfovibrionales）、脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）和嗜膽菌屬（Bilophila），以及放線菌門下的Coriobacteriia綱相對(duì)豐度均顯著高于樣本H1。

分析以擬桿菌屬為核心菌屬的樣本H3、C1、D1、S1、I2、T1，以健康樣本H3為參照，進(jìn)行兩兩對(duì)比，經(jīng)Metastat分析發(fā)現(xiàn)，便秘樣本C1中與健康樣本H3菌群存在顯著差異的為變形菌門及其門下的β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、伯克氏菌目（Burkholderiales）、產(chǎn)堿桿菌科（Alcaligenaceae）以及薩特氏菌屬（Sutterella），此外，樣本C1擬桿菌門下的普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、[Odoribacteraceae]科、理研菌科（Rikenellaceae）及普雷沃氏菌屬（Prevotella）、[Odoribacter]相對(duì)豐度顯著高于H3，而薩特菌屬（Sutterella）和光崗菌屬（Mitsuokella）相對(duì)豐度較低；大便異常樣本S1中差異較顯著的為β-變形菌綱及其下的產(chǎn)堿桿菌科及薩特氏菌屬和擬桿菌門下的[Paraprevotellaceae]菌科及Paraprevotella菌屬，其相對(duì)豐度顯著低于樣本H3；腹瀉樣本D1中差異顯著的是變形菌門下的β-變形菌綱、伯克氏菌目（Burkholderiales）、產(chǎn)堿桿菌科（Alcaligenaceae）和薩特氏菌屬（Sutterella），以及厚壁菌門下的光崗菌屬（Mitsuokella）和小類桿菌屬（Dialister），其相對(duì)豐度較低；失眠樣本I2與H3差異顯著的為光崗菌屬（Mitsuokella）；而口氣異常樣本T1與H3差異顯著的菌群較多，有4 個(gè)菌門、4 個(gè)菌綱、5 個(gè)菌目、11 個(gè)菌科、12 個(gè)菌屬差異顯著，主要是分布在擬桿菌門及其門下的綱、目、科、屬相對(duì)豐度較高，梭桿菌門和厚壁菌門及其門下所屬物種、變形菌門、放線菌門下所屬物種相對(duì)豐度較低，此結(jié)果與NMDS分析結(jié)果相似（樣本T1在NMDS圖上與其他樣本樣點(diǎn)距離分開(kāi)較大）。

3 討論

從整體上看，本研究通過(guò)對(duì)微生態(tài)制劑干預(yù)后不同疾病人群腸道微生物α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，在水蘇糖和CPb干預(yù)組中呈波動(dòng)甚至有降低趨勢(shì)，但干預(yù)前后無(wú)明顯性差異；而MF-13對(duì)樣本內(nèi)物種豐度及多樣性的提高有促進(jìn)作用，其原因可能是MF-13含有的益生菌和益生元共同促進(jìn)了腸道內(nèi)相關(guān)菌群的增殖，并且其促進(jìn)作用較單獨(dú)的益生元或益生菌更明顯，說(shuō)明合生元MF-13能夠在一定程度上改善宿主腸道微生物的多樣性和物種豐度。李艷艷等探討不同組合的合生元對(duì)CCl4所致急性化學(xué)性肝損傷小鼠的肝臟保護(hù)作用，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠擬桿菌門和變形菌門相對(duì)豐度升高，而厚壁菌門相對(duì)豐度降低[25]。此外，在干預(yù)過(guò)程中由于未對(duì)外界因素（如飲食和作息習(xí)慣等）進(jìn)行控制，且各干預(yù)組中存在個(gè)體間生理狀態(tài)的差異，這些因素可能對(duì)腸道微生物多樣性產(chǎn)生較大干擾，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，微生態(tài)制劑對(duì)腸道微生物多樣性并無(wú)明顯變化，提示在多種外界因素存在情況下，微生態(tài)制劑可能在一定程度上抵御了外界因素對(duì)腸道微生物多樣性的干擾，維持了腸道微生態(tài)的平衡。

本研究對(duì)各類志愿者所有樣本在門水平和屬水平上的相對(duì)豐度變化進(jìn)行分析，在門水平上占優(yōu)勢(shì)的為擬桿菌門和厚壁菌門，各干預(yù)組門水平相對(duì)豐度變化結(jié)果顯示，水蘇糖對(duì)兩大優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度影響趨勢(shì)較明顯，其能促進(jìn)擬桿菌門而抑制厚壁菌門菌群的增殖；CPb對(duì)各菌門的豐度變化無(wú)顯著影響；而MF-13對(duì)變形菌門和放線菌門相對(duì)豐度影響較明顯，兩者均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。結(jié)果表明，水蘇糖作為一種增殖因子，可能促進(jìn)了腸道內(nèi)某些菌群的增殖，間接抑制了另一些菌群的增殖，而較集中地表現(xiàn)在擬桿菌門菌群相對(duì)豐度增長(zhǎng)和厚壁菌門相對(duì)豐度的降低。許多研究顯示，肥胖者腸道內(nèi)兩者的比例往往低于健康者。提示水蘇糖有維持機(jī)體健康的潛在益生作用。CPb對(duì)各菌門的豐度變化無(wú)明顯影響，可能與外界干擾因素或干預(yù)周期長(zhǎng)短相關(guān)。而MF-13同時(shí)含有益生菌與益生元，能使其含有的外源益生菌更好地定植于腸道內(nèi)，從而促進(jìn)放線菌門的增殖，但結(jié)果顯示同時(shí)伴隨有變形菌門的增殖，其可能的原因是腸道各菌群之間復(fù)雜的共生及競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系所致。從菌屬水平上的分析發(fā)現(xiàn)，志愿者被劃分為擬桿菌屬腸型和普雷沃氏菌屬兩種腸型，這與Wu等[17]的研究結(jié)果相似。從微生態(tài)制劑對(duì)腸型的影響來(lái)看，除個(gè)別樣本外，3 種微生態(tài)制劑對(duì)于腸型即核心菌屬的改變幾乎無(wú)影響，說(shuō)明相較于短期的微生態(tài)制劑干預(yù)，長(zhǎng)期固定的膳食結(jié)構(gòu)對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的形成及穩(wěn)定有著深遠(yuǎn)的影響。岳文秀等[26]的研究結(jié)果顯示，紅葡萄酒花色苷可促進(jìn)腸道益生菌生長(zhǎng)，抑制部分有害菌增殖，可調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能、提高人體腸道新陳代謝能力，但未說(shuō)明停止干預(yù)時(shí)，腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化情況。微生態(tài)制劑干預(yù)后，個(gè)別樣本中核心菌屬變化較大，但隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，核心菌屬逐漸穩(wěn)定，原因可能是志愿者本身處于的病理狀態(tài)的影響或者是初期取樣不均造成。另外，3 種微生態(tài)制劑均能普遍提高普雷沃氏菌屬和擬桿菌屬的相對(duì)豐度，對(duì)于病理樣本菌群的影響主要表現(xiàn)為提高有益菌相對(duì)豐度而降低有害菌的豐度。

在NMDS分析和聚類分析中，微生態(tài)制劑干預(yù)過(guò)程中大部分志愿者腸道菌群結(jié)構(gòu)出現(xiàn)交疊，而停止干預(yù)后，又接近于干預(yù)前狀態(tài)，說(shuō)明微生態(tài)制劑對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變有一定的影響，但并不能產(chǎn)生持續(xù)性的影響，同時(shí)揭示腸道微生態(tài)一直處于動(dòng)態(tài)平衡，外在干擾因素消失后，又恢復(fù)到干擾前狀態(tài)。但對(duì)于病理樣本，如便秘和腹瀉樣本干預(yù)前后相比腸道菌群結(jié)構(gòu)變化較大，在停止干預(yù)后并未出現(xiàn)恢復(fù)至干預(yù)前狀態(tài)，表明微生態(tài)制劑可能對(duì)于失調(diào)的腸道菌群有著明顯的調(diào)節(jié)作用和益生作用。本研究還對(duì)同種腸型人群下個(gè)體間菌群差異進(jìn)行了Metastat分析，將各類疾病人群與健康人群對(duì)比，意在找到存在顯著差異的菌群。分析發(fā)現(xiàn)即使在同種腸型下比較，個(gè)體之間存在的差異仍較大，其結(jié)果與NMDS及聚類分析結(jié)果相似，與健康人群存在差異菌群越多，在NMDS及聚類圖上相應(yīng)的距離也越遠(yuǎn)。

總之，因各干預(yù)組樣本量及受試個(gè)體差異較大，本實(shí)驗(yàn)未能找出各微生態(tài)制劑在干預(yù)前后腸道菌群結(jié)構(gòu)明確的變化規(guī)律，但通過(guò)干預(yù)前后的比較發(fā)現(xiàn)，3 種微生態(tài)制劑對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)，特別是對(duì)于病理狀態(tài)下個(gè)體的腸道菌群有一定的調(diào)節(jié)作用，并使其趨向于健康狀態(tài)。

膽固醇是人體必需的營(yíng)養(yǎng)成分，而膽汁酸有助于腸道中膳食脂肪和脂溶性維生素的吸收[27]，膽固醇在肝臟中經(jīng)一系列酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)換膽汁酸，兩者的代謝密切相關(guān)，在肝腸循環(huán)中互相調(diào)控，以維持機(jī)體代謝平衡，其中，腸道內(nèi)菌群對(duì)膽汁酸和膽固醇的代謝發(fā)揮著重要作用。許多研究顯示，益生菌如乳酸桿菌、雙歧桿菌以及糞球菌等能夠促進(jìn)腸道內(nèi)膽汁酸的排出，減少膽汁酸的肝腸循環(huán)，同時(shí)促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼?，如此，益生菌在降低機(jī)體膽汁酸的同時(shí)能夠降低血液中膽固醇水平，而兩者在糞便中的含量有所增加。

本研究結(jié)果顯示，水蘇糖和CPb對(duì)糞便中膽汁酸和膽固醇含量變化趨勢(shì)的影響不明顯，膽汁酸和膽固醇水平在水蘇糖和CPb組表現(xiàn)出此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，可能是膽汁酸和膽固醇的肝腸循環(huán)和膽固醇的回補(bǔ)作用所致；而在MF-13干預(yù)組中，膽汁酸和膽固醇水平變化趨勢(shì)呈現(xiàn)正相關(guān)，MF-13對(duì)糞便中膽汁酸和膽固醇的排放有促進(jìn)作用，且整體上均在干預(yù)階段3～8 周時(shí)作用顯著（P＜0.05），但在干預(yù)停止后糞便中膽汁酸和膽固醇含量均回落至干預(yù)前水平。一方面，MF-13在促進(jìn)腸道中膽汁酸排出的同時(shí)也能促進(jìn)膽固醇的排出，說(shuō)明MF-13除了能對(duì)膽汁酸的肝腸循環(huán)產(chǎn)生影響外，還有可能是其所含有的某些益生菌及其引起的腸道中某些變化的菌屬，通過(guò)某些降膽固醇機(jī)制來(lái)促進(jìn)機(jī)體膽固醇的排出；另一方面，3 種微生態(tài)制劑在停止干預(yù)后，對(duì)糞便膽汁酸和膽固醇水平不再產(chǎn)生影響，此結(jié)果與腸道菌群在門、屬水平豐度和菌群結(jié)構(gòu)的變化結(jié)果相類似，表明相對(duì)短期的干預(yù)不能產(chǎn)生持續(xù)性的影響，提示相對(duì)短期內(nèi)，益生菌在腸道內(nèi)的定殖或其所引起的相關(guān)菌屬的變化是不穩(wěn)定的。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)微生態(tài)制劑干預(yù)不同腸道疾病人群，利用二代測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)的分析方法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)3 種益生菌制劑均會(huì)對(duì)腸道菌群的多樣性和結(jié)構(gòu)造成影響。在門水平上，水蘇糖能促進(jìn)擬桿菌門而抑制厚壁菌門菌群的增殖；CPb對(duì)擬桿菌門和厚壁菌門菌群相對(duì)豐度的影響不明顯，在整個(gè)干預(yù)過(guò)程中各菌門的豐度變化呈現(xiàn)波動(dòng)；合生元MF-13對(duì)擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度無(wú)明顯影響，而對(duì)變形菌門和放線菌門菌群的增殖有促進(jìn)作用。在屬水平上，水蘇糖能明顯降低便秘和失眠樣本中變形菌門下的薩特菌屬的豐度，CPb對(duì)降低腹瀉樣本中薩特菌屬以及升高柔嫩梭菌屬的豐度有明顯作用，MF-13能夠提高樣本中Parabacteroides的豐度。在腸道菌群結(jié)構(gòu)上，大部分樣本在微生態(tài)制劑干預(yù)過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生變化，并有群體間相互交疊的趨勢(shì)，而干預(yù)停止后又趨于干預(yù)前狀態(tài)。說(shuō)明短期的微生態(tài)制劑干預(yù)相較于長(zhǎng)期的飲食結(jié)構(gòu)、環(huán)境和生活習(xí)慣等，對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的糾正是暫時(shí)性而非持久性的，且從腸型的改變上來(lái)看，其糾正的強(qiáng)度也相對(duì)較弱。

另外，通過(guò)對(duì)各類人群糞便樣本中膽固醇和膽汁酸含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在3 種微生態(tài)制劑干預(yù)過(guò)程中，水蘇糖和CPb對(duì)志愿者糞便膽汁酸和膽固醇含量變化趨勢(shì)整體不明顯，而MF-13對(duì)腸道膽汁酸和膽固醇的排出整體上有顯著的促進(jìn)作用（P＜0.05），但干預(yù)的持續(xù)性不明顯，表明MF-13有利于改善膽固醇的代謝，在干預(yù)過(guò)程中對(duì)維持機(jī)體健康狀態(tài)具有積極作用。