超聲功率對牛肉干品質(zhì)及牛肉肌原纖維蛋白結構的影響

董智銘，么紫瑤，姜萩婉，蔣博文，王見釗，陳 倩，張文濤

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

牛肉干是中國傳統(tǒng)特色干肉制品的代表，但傳統(tǒng)牛肉干多采用手工作坊式生產(chǎn)，在實際生產(chǎn)過程中憑借生產(chǎn)者的經(jīng)驗控制產(chǎn)品質(zhì)量，容易存在“質(zhì)地硬、色澤差、品質(zhì)不穩(wěn)”等問題[1]。腌制是賦予肉干風味、保證產(chǎn)品安全的主要加工環(huán)節(jié)[2]，常用的腌制技術包括干腌法和濕腌法。干腌法的腌制時間長、效率低、腌制效果不均，產(chǎn)品質(zhì)地堅硬[3]。濕腌法的腌制效率同干腌法，并且原料長期處于鹽水中會導致色澤風味欠佳[4]。因此，一些物理輔助腌制技術，如鹽水注射、變壓滾揉、超聲波輔助腌制等，逐漸被用于原料肉的腌制，以提高腌制效率，改善產(chǎn)品品質(zhì)[5]。

超聲波作為一種綠色安全的物理輔助手段，其與濕法腌制相結合可加速腌制進程、提高保水性、改善食鹽分布以及產(chǎn)品嫩度[6-7]。超聲波輔助腌制對肉制品的品質(zhì)提升作用可歸因于其“聲空化”效應，本質(zhì)是在液體介質(zhì)中，聲波壓力波動導致微小氣泡的快速形成與坍塌[8]。在此過程中能量的大量釋放會在局部區(qū)域產(chǎn)生極高的溫度和強烈的剪切應力[9]，產(chǎn)生的沖擊波、微射流等機械效應增強了腌制過程中的傳質(zhì)，并引起肌肉組織和蛋白結構的變化，從而影響肌肉的品質(zhì)及感官特性[10]。

目前，超聲輔助腌制技術多用于改善鮮肉、醬鹵制品品質(zhì)及感官特性[11-12]，缺乏超聲技術對牛肉干品質(zhì)與牛肉蛋白結構影響的系統(tǒng)分析。基于此，本研究采用超聲輔助腌制技術對肉干進行腌制，探究不同超聲功率對牛肉干理化、品質(zhì)特性及新鮮牛肉條肌原纖維蛋白結構的影響，以期為牛肉干品質(zhì)特性改善及超聲腌制技術的工業(yè)化應用提供理論參考和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉購于哈爾濱大莊園實業(yè)有限公司，中國西門塔爾母牛（平均18～20 月齡、活體質(zhì)量450～500 kg）按照GB/T 19477—2018《畜禽屠宰操作規(guī)程 牛》進行屠宰，于4 ℃下冷卻排酸48 h，取牛胴體左右兩側背部最長肌，真空包裝后用保溫箱運至東北農(nóng)業(yè)大學食品學院肉品實驗室（冰塊的體積為牛肉的兩倍）。

食鹽、姜粉、味精、白糖、食品級亞硝酸鈉 哈爾濱億人添加劑有限公司；砂仁、桂皮、茴香、胡椒、八角、肉豆蔻、草蔻、丁香、白芷 襄陽高新技術開發(fā)區(qū)食化香精商行；所用化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

PB-30 pH計 德國Sartorius科學儀器公司；超聲波輔助冷凍機 南京先歐儀器制造有限公司；ZE6000色差計日本電色工業(yè)株式會社；S-3400N掃描電子顯微鏡日本Hitachi公司；TA-XT Plus型質(zhì)構分析儀 英國Stable Micro Systems公司；AquaLab水分活度儀美國Decagon Devices公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；202型電熱恒溫干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司；GL-21M冷凍離心機 湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉干的制作

工藝流程：牛里脊的預處理→修割切條→制備腌制液→超聲輔助腌制30 min→靜置腌制10 h→自然發(fā)酵6 d→成品

牛肉切條：將牛里脊去除筋膜，順著肌原纖維的方向將其切成規(guī)則的2 cm×2 cm×10 cm的長條狀。

制備腌制液：肉液比1∶3，以4 000 g牛肉計，配制12 000 mL腌制液。砂仁480 g、草寇120 g、桂皮600 g、茴香240 g、胡椒240 g、八角240 g、肉豆蔻240 g、丁香120 g、白芷120 g，使用料袋包裝備用，用12 000 mL水進行熬煮，水沸后繼續(xù)煮30 min，并維持水量在12 000 mL，冷卻。根據(jù)水的總質(zhì)量計算食鹽質(zhì)量分數(shù)為6%，亞硝酸鈉質(zhì)量分數(shù)為0.01%。加入姜粉240 g、白糖240 g、味精240 g，攪拌均勻即得到腌制料汁。

超聲處理：根據(jù)預實驗結果，設置腌制溫度為10 ℃，30 kHz頻率下超聲輔助腌制30 min，超聲功率分別設置為0、150、300、450、600 W，超聲處理40 s，間歇5 s。

靜置腌制：將超聲處理好的牛肉條于10 ℃靜置腌制10 h。

自然發(fā)酵：將腌制后的牛肉條放入發(fā)酵箱中，設置溫度為25 ℃，相對濕度為75%～80%，發(fā)酵6 d獲得成品。

將經(jīng)超聲處理后、自然發(fā)酵前的牛肉條和經(jīng)自然發(fā)酵后的牛肉干進行后續(xù)理化及品質(zhì)指標測定。

1.3.2 牛肉條及牛肉干理化、品質(zhì)特性測定

1.3.2.1 水分活度和水分含量的測定

水分活度測定參照杜洪振等[13]的方法；水分質(zhì)量分數(shù)測定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》[14]。

1.3.2.2 pH值和鹽含量的測定

pH值測定參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》[15]；氯化鈉質(zhì)量分數(shù)（以下簡稱鹽含量）測定參照GB 5009.44—2016《食品安全國家標準 食品中氯化物的測定》[16]。

1.3.2.3 色澤的測定

色澤參照張麗萍等[17]的方法采用ZE6000色差計測定，在進行顏色讀數(shù)之前，用黑色和白色標準板校準儀器。

1.3.2.4 剪切力的測定

將牛肉干進行熟制（100 ℃蒸制20 min），然后將其冷卻至室溫，切成1 cm×1 cm×10 cm大小的肉條，進行剪切力的測定。刀頭型號為BSW，力量源30 kg，測前速率10 mm/s，測量長度1.5 cm，切割時刀頭需垂直于肌纖維方向，進行6 次重復實驗，取平均值。

1.3.2.5 牛肉條微觀結構觀察

參照夏秀芳等[18]所采用光學顯微鏡分析肉樣的方法并稍作修改，將牛肉條切成5 mm×5 mm×1 mm的方形狀，經(jīng)處理后使用電子顯微鏡觀察樣品微觀結構，加速電壓5 kV、放大倍數(shù)500。

1.3.2.6 牛肉干感官評價

感官評價小組由20 名畜產(chǎn)品加工研究生（10 名女性和10 名男性）組成。牛肉干在100 ℃下蒸制20 min，冷卻后置于白色盤子中，以3 位阿拉伯數(shù)字隨機編碼后進行感官評估。品評人員根據(jù)顏色（色澤鮮紅：7 分；色澤暗淡：1 分）、硬度（肉質(zhì)堅韌：7 分；肉質(zhì)柔軟：1 分）、滋味（咸味略重：7 分；咸味略淡：1 分）、氣味（香氣濃郁：7 分；有異味或香氣寡淡：1 分）以及總體可接受性（極好：7 分；不佳：1 分）對牛肉干進行評分。

1.3.3 牛肉肌原纖維蛋白結構性質(zhì)測定

1.3.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參照扈瑩瑩等[19]的方法提取超聲處理后牛肉條中的肌原纖維蛋白。

1.3.3.2 肌原纖維碎片化指數(shù)測定

肌原纖維碎片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）測定參照Culler等[20]的方法并稍作修改，使用50 mmol/L哌嗪-N,N’-雙(2-乙磺酸)（piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid)，PIPES）（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）調(diào)節(jié)所提取蛋白溶液質(zhì)量濃度至0.5 mg/mL，記錄540 nm波長處的吸光度，其平均值乘以200即為MFI。

1.3.3.3 羰基含量和總巰基含量的測定

羰基含量與總巰基含量的測定參照溫榮欣等[21]的方法。

1.3.3.4 活性巰基含量的測定

活性巰基含量的測定參考Pan Jinfeng等[22]的方法并稍作修改，使用5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）法進行測定。將10 mmol/L DTNB反應緩沖液（含有0.09 mol/L甘氨酸、0.086 mol/L Tris、8 mol/L尿素、4 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），pH 8.0）添加到蛋白溶液（2 mg/mL）中，并在室溫下反應30 min。通過記錄412 nm和540 nm波長處的吸光度計算活性巰基含量，計算公式如式（1）所示。

式中：73.53＝106/13 600，13 600為摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））；ρ為蛋白溶液質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.3.5 表面疏水性的測定

表面疏水性參照Zhou Yajun等[23]的方法進行測定。將溴酚藍（終質(zhì)量濃度1 mg/mL）添加到蛋白溶液（1 mg/mL）中，在室溫下充分混合后，以3 500×g離心，記錄稀釋10 倍的上清液在595 nm波長處的吸光度。對照組用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L）代替蛋白溶液。通過溴酚藍結合量反映蛋白表面疏水性，溴酚藍結合量按公式（2）計算。

式中：A0為對照組吸光度；Ax為樣品吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)來自3 次重復的獨立實驗，均以平均值±標準差表示。使用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并通過單因素方差分析和鄧肯檢驗確定平均值之間的顯著性差異（以P＜0.05表示差異顯著）。采用Excel和Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 超聲功率對牛肉干水分活度、水分質(zhì)量分數(shù)、pH值的影響

牛肉條經(jīng)自然發(fā)酵后形成了牛肉干，如表1所示，經(jīng)發(fā)酵后牛肉干水分活度、水分質(zhì)量分數(shù)均顯著降低（P＜0.05），這是發(fā)酵過程中肉干內(nèi)部水分的遷移和外部水分的蒸發(fā)導致了水分損失。隨著超聲腌制功率的增加，牛肉條和牛肉干中水分活度與水分質(zhì)量分數(shù)均呈上升趨勢，特別是功率升至450 W和600 W時兩指標較未超聲處理組顯著上升（P＜0.05）。這是因為超聲處理可使肌肉纖維結構受損，鹽溶性蛋白質(zhì)溶出并附于肉的表面，從而有助于在肌纖維中保留更多的水分[24]。此外，空化效應引起的鹽加速擴散可以使肌原纖維蛋白膨脹，從而增加肌肉水分含量，其中氯離子易與肌絲蛋白結合，增加了它們之間的靜電斥力，鈉離子可在肌絲蛋白周圍形成離子“云”將其包裹，這種肌球蛋白和肌動蛋白的膨脹作用可以提供更多的蛋白質(zhì)側鏈來結合水分[25]。

表1 超聲功率對牛肉條及牛肉干水分質(zhì)量分數(shù)、水分活度、pH值的影響Table 1 Effect of ultrasonic power on the moisture content,water activity and pH of beef strips and beef jerky

發(fā)酵6 d后牛肉干的pH值顯著低于發(fā)酵前的牛肉條（P＜0.05），這主要是牛肉中的優(yōu)勢微生物發(fā)酵所致。此外，隨著超聲腌制功率的增加，牛肉條的pH值從5.89（0 W）升高至5.98（600 W），牛肉干的pH值從5.21（0 W）升高至5.29（600 W），較低功率超聲處理使得牛肉干pH值略有增加，當功率大于300 W時顯著增加（P＜0.05）。這與Jayasooriya等[26]報道的超聲處理使牛胸腰最長肌和半腱肌pH值顯著增加的結論一致，pH值的升高主要是蛋白質(zhì)結構變化導致離子基團位置的改變所引起的[27]。

2.2 超聲功率對牛肉干色澤的影響

色澤是影響肉制品質(zhì)量和消費者購買欲的重要指標之一，通常良好的牛肉干色澤為高L*值、a*值和低b*值[28]。如表2所示，與發(fā)酵前的牛肉條相比，發(fā)酵后的牛肉干L*值、b*值顯著升高，a*值顯著降低（P＜0.05）。發(fā)酵過程中牛肉肉色變化主要與肉干的含水量和肌紅蛋白的氧化有關。

表2 超聲功率對牛肉條及牛肉干色澤的影響Table 2 Effect of ultrasound power on color paramenters of fresh beef strips and beef jerky

隨著超聲功率的增加，牛肉條與牛肉干L*值和b*值都呈上升趨勢，在600 W時達到最大。L*值的增加可能與超聲處理引起的局部高溫高壓導致亞鐵血紅素被取代和球蛋白變性有關[29]；另外，較高的水分含量也是導致L*值增加的原因[30]，而b*值的增加主要與脂質(zhì)氧化有關。a*值隨著超聲腌制功率的提高先增加后降低，當功率為300 W時，牛肉條和牛肉干a*值達到最高，分別為17.95與16.25。這可能是因為在腌制過程中隨著超聲功率的增大，空化氣泡強大的內(nèi)爆效應可以斷裂分子鍵，產(chǎn)生大量自由基[31]，氧合肌紅蛋白血紅素輔基的Fe2＋受到攻擊失去電子，生成具有Fe3＋的高鐵肌紅蛋白，表現(xiàn)為a*值降低。

2.3 超聲功率對牛肉干鹽含量和剪切力的影響

鹽含量是評價肉類腌制程度的重要指標，超聲功率對牛肉條和牛肉干中鹽含量的影響如圖1A所示。發(fā)酵后的牛肉干中鹽含量顯著高于發(fā)酵前的牛肉條（P＜0.05），這與牛肉在發(fā)酵過程中的水分損失導致食鹽濃縮有關。值得注意的是，牛肉條與牛肉干中鹽含量均隨著超聲腌制功率的提高而顯著增加（P＜0.05），說明超聲處理能夠促進食鹽向肉中擴散。Visy等[32]的研究表明，空化效應可以產(chǎn)生微射流攻擊肌原纖維，從而在肉的邊界產(chǎn)生微通道，有利于食鹽滲透到肉中。超聲處理引起的鹽分加速滲透，提高了肌纖維間的靜電斥力與蛋白溶解[33]，這與觀察到的高功率下的牛肉干擁有較高的水分含量密切相關。

圖1 超聲功率對牛肉條及牛肉干鹽含量（A）和剪切力（B）的影響Fig.1 Effect of ultrasound power on salt content (A) and shear force (B)of fresh beef strips and beef jerky

超聲功率對牛肉條和牛肉干剪切力的影響如圖1B所示，牛肉干的剪切力較牛肉條顯著增加（P＜0.05），發(fā)酵后0、150、300、450、600 W超聲處理的牛肉干剪切力分別升高至28.02、26.19、24.07、23.63 N和21.15 N，這與發(fā)酵過程中水分損失密切相關。此外，隨著超聲功率的提高，牛肉條和牛肉干的剪切力呈下降趨勢，超聲處理后的樣品剪切力顯著低于未經(jīng)處理組（P＜0.05），對于牛肉干而言，300 W和450 W處理組間差異不顯著（P＞0.05）。剪切力的降低可能是空化作用的破壞性和聲波振動導致的肌肉纖維結構弱化引起的，也可能是超聲作用破壞溶酶體，釋放出可以促進蛋白質(zhì)降解的鈣激活酶和組織蛋白酶，進而改善了質(zhì)構特性[34]。

2.4 超聲功率對牛肉條微觀結構的影響

如圖2所示，隨著超聲功率的增加，肌纖維排列變得散亂，肌束間間隙增大，肌肉結構變得松弛，甚至發(fā)生細胞破裂的現(xiàn)象，這主要是超聲的空化和機械效應所致[35-36]。當功率在600 W時肌纖維斷裂程度最大，超聲功率在300 W和450 W時，肌纖維斷裂程度相近，這可能是超聲在這個功率范圍內(nèi)對牛肉肌纖維破壞程度有限。

圖2 不同超聲功率處理的牛肉條掃描電子顯微鏡圖（500×）Fig.2 Scanning electron microscopic images (500 ×) of fresh beef strips treated with different ultrasound power

2.5 超聲功率對牛肉條MFI的影響

為了進一步揭示超聲處理后牛肉干的品質(zhì)變化機制，對經(jīng)超聲處理后的新鮮牛肉條中肌原纖維蛋白結構進行了分析。MFI是反映肌原纖維蛋白完整性的指標，較大的MFI可能與肌原纖維在I帶Z線附近劇烈斷裂有關[37]。MFI隨超聲功率的變化如圖3所示，在一定范圍內(nèi)，隨著功率的提高（0～450 W），牛肉MFI顯著增加（P＜0.05），當功率從450 W升至600 W時，MFI并無顯著變化（P＞0.05）。超聲處理對牛肉MFI的影響與其空化和機械效應密切相關，二者可以產(chǎn)生強烈的剪切作用，在較短時間就可對肌原纖維蛋白造成劇烈破壞，導致其結構弱化、斷裂，從而提升肉的嫩度[38]。

圖3 超聲功率對牛肉條MFI的影響Fig.3 Effect of ultrasound power on MFI of fresh beef strips

2.6 超聲功率對牛肉條肌原纖維蛋白羰基含量的影響

羰基含量可以反映肌原纖維蛋白的氧化程度，超聲功率對牛肉肌原纖維蛋白羰基含量的影響如圖4所示。未經(jīng)超聲處理的牛肉蛋白羰基含量為0.31 nmol/mg pro，經(jīng)150 W超聲波處理后未發(fā)生顯著變化，超聲功率升高至300 W和450 W時，羰基含量顯著增加（P＜0.05），并且在600 W時達到最大，約為450 W時的2 倍。蛋白質(zhì)的羰基化主要歸因于氨基酸側鏈的氧化，并且脂質(zhì)氧化所生成的醛類化合物也可以與氨基酸側鏈基團結合形成席夫堿，從而使羰基含量增加[39]。此外，研究表明超聲引起的肌肉細胞破裂會導致血紅素和非鐵血紅素的釋放，當血紅素轉化為非鐵血紅素時，來自H2O2的羥基可以氧化氨基酸側鏈生成羰基[40]。此外，超聲空化效應引起鹽的加速滲透也對蛋白質(zhì)羰基化起著促進作用。

圖4 超聲功率對牛肉條肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig.4 Effect of ultrasound power on the carbonyl group content of myofibrillar proteins in fresh beef strips

2.7 超聲功率對牛肉條肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量的影響

半胱氨酸的巰基具有很強的活性，極易受到自由基的攻擊形成二硫鍵，因此巰基含量可以反映蛋白的氧化程度?？値€基含量隨超聲功率的變化如圖5A所示，隨著超聲功率的提高，總巰基含量從59.70 nmol/mg pro（0 W）顯著降低至53.30 nmol/mg pro（600 W）（P＜0.05），這可能是因為巰基中的氫原子被超聲處理過程中產(chǎn)生的自由基捕獲，導致巰基氧化，并在多肽內(nèi)部或多肽間形成二硫鍵[41]。Zhang Ruyu等[42]也發(fā)現(xiàn)，超聲處理的豬肉中總巰基含量隨超聲處理強度的增加而降低。此外，Kang Dacheng等[33]的研究也表明，與靜置腌制相比，超聲輔助腌制顯著降低了牛背最長肌的總巰基含量（P＜0.05）。

圖5 超聲功率對牛肉條肌原纖維蛋白總巰基（A）及活性巰基（B）含量的影響Fig.5 Effect of ultrasound power on the contents of total sulfhydryl (A)and active sulfhydryl (B) groups in myofibrillar proteins of fresh beef strips

超聲功率對肌原纖維蛋白活性巰基含量的影響如圖5B所示，超聲功率越大，活性巰基含量越高，當功率達到600 W時，活性巰基含量達到39.23 nmol/mg pro。Amiri等[43]研究也發(fā)現(xiàn)，隨著超聲強度的增加，牛肉肌原纖維蛋白的結構逐漸伸展，暴露出更多的活性巰基基團，其含量顯著增加，康大成[31]的研究也證明了此結論。

2.8 超聲功率對牛肉條肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性可反映蛋白表面疏水基團數(shù)量及分布，通過溴酚藍與肌原纖維蛋白的結合作用可以分析肌原纖維蛋白的表面疏水程度[23]。如圖6所示，經(jīng)超聲處理后，牛肉條肌原纖維蛋白的溴酚藍結合量從15.35 μg（0 W）增至51.64 μg（600 W）（P＜0.05）。這可能是由于超聲的空化效應引起的機械力破壞了肌原纖維蛋白分子間作用力，使得肌原纖維蛋白結構展開，進而暴露出更多埋藏在內(nèi)部的疏水基團。這與Chen Lin等[44]的研究結果一致，蛋白質(zhì)在超聲過程中發(fā)生去折疊和復性，加速分子內(nèi)部非極性和疏水性氨基酸（甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等）的暴露，從而增加了其表面疏水性。

圖6 超聲功率對牛肉條肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.6 Effect of ultrasound power on the surface hydrophobicity of myofibrillar proteins in fresh beef strips

2.9 超聲功率對牛肉干感官評價的影響

如圖7所示，隨著超聲功率的提高（0～300 W），牛肉干顏色得分顯著增加（P＜0.05），盡管在超聲450 W和600 W時紅度略有下降，但肉眼觀察并無顯著差別。此外，牛肉干氣味與滋味得分隨著超聲功率增加而增加，這與超聲波促進腌料傳質(zhì)有關。超聲功率超過300 W后，硬度得分顯著降低（P＜0.05），這與剪切力分析結果相印證，說明增大超聲功率可改善牛肉干感官嫩度。總體而言，超聲功率300 W處理的牛肉干總體可接受性最高。

圖7 超聲功率對牛肉干感官評價的影響Fig.7 Effect of ultrasound power on sensory evaluation of beef jerky

3 結論

本實驗研究了超聲腌制功率對牛肉干品質(zhì)特性及牛肉肌原纖維蛋白結構的影響。結果表明，隨著超聲功率的提高，牛肉MFI上升，表面疏水性增強，羰基、活性巰基含量增加，總巰基含量下降，表現(xiàn)為牛肉條與牛肉干水分質(zhì)量分數(shù)、水分活度、pH值和鹽含量顯著增加，剪切力顯著降低，以及肌肉微觀結構松散。這說明超聲處理破壞了肌原纖維蛋白的結構，促使其結構展開，暴露出更多疏水基團，在有效改善牛肉干嫩度的同時，也增加了水分的保持，加快了食鹽滲透，進而提高了牛肉干的保水性和鹽含量。但超聲功率過高引起的高pH值和水分含量不利于牛肉干的貯藏，另外，過高的功率還會增加蛋白過度氧化的風險及額外的能源消耗。綜上，結合感官評價結果，超聲功率300 W時牛肉干的整體品質(zhì)最佳。