補肺活血膠囊“異病同治”慢性阻塞性肺疾病和特發(fā)性肺纖維化的機制探討

張婷婷,高 梅,曲蒙蒙,嚴鎵文,吉郡珠,余海濱,2

(1. 河南中醫(yī)藥大學,河南 鄭州 450000;2. 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)和特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)是呼吸系統(tǒng)常見的異質性疾病,均以通氣功能障礙為主要特征,其患病率居高不下且遷延難愈,給患者造成了巨大的經(jīng)濟及心理負擔。流行病學研究發(fā)現(xiàn),我國40歲以上COPD患者高達9 990萬余人[1],預計到2030年將有超過105萬人死于COPD[2],是繼心血管疾病及中風之后的導致死亡的第3大疾病[3]。COPD的主要病理特征是異常炎癥反應導致的氣道、血管以及肺實質的改變,以小氣道疾病和肺氣腫等為主要表現(xiàn)[4]。IPF多發(fā)生于50歲以上的中老年人,男性多于女性,其主要病理學特征為肺泡外基質的過度積累所導致的肺部瘢痕組織形成、肺泡結構異常以及肺功能不可逆的喪失[5],是當前社會面臨的主要健康問題之一。“異病同治”是指病機相同的不同疾病可以采用同一種方法進行治療,即“證同則治同”[6]。傳統(tǒng)醫(yī)學認為,COPD可歸屬為“肺脹”“咳嗽”等范疇,IPF則被冠為“肺痿”“肺痹”之名,二者病變臟腑皆責之肺、脾、腎,其病機均與氣虛、痰濁、血瘀有關[7-9]。補肺活血膠囊由黃芪、赤芍、補骨脂3味中藥組成,其中黃芪擅補肺脾之氣,赤芍長于清熱涼血、活血化瘀,二者配伍調氣和血,補骨脂則以溫腎助陽、納氣平喘為主,全方肺脾腎兼顧且氣血陰陽同調,共奏補肺納腎、益氣活血之功。相關研究表明,補肺活血膠囊在治療COPD及IPF方面具有抗炎、調節(jié)免疫、調節(jié)蛋白酶-抗蛋白酶平衡、改善肺功能及肺組織損傷等功能[10-12],臨床應用頗為廣泛,但其作用機制尚未完全明確,仍需進一步深入探討。本研究旨在從“異病同治”的角度,利用網(wǎng)絡藥理學方法探討補肺活血膠囊對COPD及IPF發(fā)揮治療作用的關鍵成分、核心靶點、生物學進程以及主要信號通路等,并用分子對接技術對關鍵活性成分及核心靶點蛋白進行初步驗證,進一步明確其分子作用機制,以期為臨床用藥及后續(xù)實驗研究提供方向和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1篩選補肺活血膠囊活性成分及靶點 通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫分別以“HUANG QI”“CHI SHAO”“BU GU ZHI”為檢索詞獲取補肺活血膠囊的藥物活性成分及相應靶點,以“score cutoff≥20且adjusted P-value≤0.05”為標準進行篩選。

1.2獲取補肺活血膠囊與COPD及IPF的交集靶點 分別以“Chronic Obstructive Pulmonary Disease”“Idiopathic Pulmonary Fibrosis”為關鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲取疾病靶點,并以“Relevance score≥中位數(shù)”為條件進行篩選,與從TTD及DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索到的疾病靶點合并去重,然后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫對藥物與疾病相關靶點進行標準化處理,并用易漢博生物信息在線作圖工具(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html)進行映射,所得交集靶點即為補肺活血膠囊治療COPD及IPF的共同靶點。

1.3構建“中藥-成分-交集靶點”網(wǎng)絡及PPI網(wǎng)絡 將補肺活血膠囊治療COPD及IPF的中藥、活性成分及交集靶點信息錄入Excel,建立相應表格后導入Cytoscape 3.9.1軟件,構建“中藥-成分-交集靶點”網(wǎng)絡,并根據(jù)相應度(degree)值篩選主要活性成分,隨后利用STRING 11.5在線分析平臺對交集靶點構建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(protein-protein interaction networks,PPI),設置物種為人類,置信度(medium confidence)≥0.4,并隱去孤立靶點。

1.4篩選核心靶點 將構建的PPI網(wǎng)絡保存為TSV格式并導入Cytoscape軟件中,利用Network Analyzer在線工具進行拓撲分析,以“Degree≥2倍中位數(shù)”為標準對交集靶點進行篩選,所得靶點即為補肺活血膠囊異病同治COPD及IPF的核心靶點。

1.5核心靶點的GO、KEGG富集分析 運用Metascape數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行GO功能及KEGG通路富集分析,物種選擇“Homo Spanines”,P-value<0.01,以進一步明確補肺活血膠囊作用于COPD及IPF的共同細胞組分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)、生物過程(biological process, BP)及主要富集的信號通路,并分別根據(jù)-logP值及count值選擇相應條目,利用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)對其結果進行可視化處理。

1.6分子對接 運用PubChem數(shù)據(jù)庫下載補肺活血膠囊作用于COPD及IPF的前5位活性成分的3D結構,并用OpenBabel 3.1.1軟件將其轉化為pdb格式。通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫檢索度值前5位的核心靶點,設置物種為“Homo Sapiens”,實驗方法為X射線衍射法,獲取最優(yōu)評分的PDB ID及其三維結構的pdb文件,并用Pymol軟件去除水和小分子配體,隨后將主要活性成分及核心靶點分別導入AutoDock Vina軟件進行半柔性對接,并選取最優(yōu)構象利用Pymol軟件繪制相應分子對接模式圖。

2 結 果

2.1補肺活血膠囊活性成分及靶點的獲取 通過檢索BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫獲得47種藥物活性成分及1 109個作用靶點,分別去除重復值后最終得到38種活性成分,其中黃芪23種、赤芍4種、補骨脂11種,對應靶點624個。

2.2補肺活血膠囊與COPD及IPF的交集靶點的獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫初步獲得6 407個COPD靶點及3 509個IPF靶點,篩選后得到3 204個COPD靶點及1 755個IPF靶點。與從DisGeNET和TTD數(shù)據(jù)庫篩選的相應靶點合并去重后獲得3 836個COPD靶點和2 139個IPF靶點。將藥物與疾病靶點標準化處理后進行映射,并且繪制相應韋恩圖,見圖1,共得到180個交集靶點。

圖1 補肺活血膠囊與COPD和IPF的交集靶點韋恩圖

2.3“中藥-成分-交集靶點”網(wǎng)絡及PPI網(wǎng)絡的構建 將相關信息導入Cytoscape 3.9.1軟件繪制“中藥-成分-交集靶點”網(wǎng)絡圖,見圖2,其中黃色代表補肺活血膠囊中的3味中藥,綠色代表相應活性成分,藍色代表交集靶點。利用Network Analyzer在線工具對該網(wǎng)絡進行拓撲分析,篩選到前5位化合物成分分別為異補骨脂素(又稱異補骨脂內(nèi)酯、當歸素,angelicin)、刀豆氨酸(canavanine)、豆甾醇(stigmasterol)、補骨脂酚(backuchiol)以及β-谷甾醇(beta-sitosterol),其Degree值分別為33,32,31,27,22。通過STRING數(shù)據(jù)庫對180個交集靶點進行PPI網(wǎng)絡分析,見圖3,共有180個節(jié)點,1 759條邊,平均節(jié)點度值19.5。表明補肺活血膠囊是通過多種活性成分作用于多個潛在靶點協(xié)同參與“異病同治”COPD及IPF的分子機制。

圖2 “中藥-成分-交集靶點”網(wǎng)絡圖

2.4核心靶點的篩選 借助Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡進行拓撲分析,以Degree≥30為標準篩選到33個核心靶點,主要涉及ALB(Degree:98)、Akt1(Degree:94)、INS(Degree:93)、TNF(Degree:89)、IL1B(Degree:72)等,這些核心靶點即為補肺活血膠囊“異病同治”COPD和IPF的關鍵靶點。對核心靶點進行可視化,見圖4,節(jié)點越大、顏色越深說明該靶點在治療中發(fā)揮的作用越重要。

圖4 核心靶點網(wǎng)絡圖

2.5核心靶點的GO、KEGG富集分析 利用Mestascape數(shù)據(jù)庫對33個核心靶點分別進行GO、KEGG富集分析,物種選擇人類,P<0.01,共得到975個GO條目以及100條信號通路。GO功能富集分析主要包括對激素的反應、小分子代謝過程的調節(jié)、血液循環(huán)等902個生物過程以及分泌顆粒管腔、細胞質囊泡腔、囊泡腔以及血小板α顆粒管腔等27個細胞組分和受體配體活性、信號受體激活劑活性、四氫生物蝶呤結合、信號受體調節(jié)活性、一氧化氮合酶調節(jié)活性等46個分子功能。按-logP值對其結果進行排序,分別取前10條條目進行可視化,繪制相應圈圖見圖5。由外自內(nèi)第1圈表示富集的分類及相應條目編號;第2圈表示該條目中的總基因數(shù),顏色越深代表-log10(p-value)值越大;第3圈表示該條目富集的核心靶點基因數(shù),即count值;第4圈表示該條目富集的核心靶點基因數(shù)與該條目總基因數(shù)的比值,即RichFactor值。KEGG通路富集分析共得到100條信號通路。結果顯示,核心靶點基因主要涉及癌癥通路、HIF-1信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、前列腺癌、PI3K-Akt信號通路、癌癥中的蛋白聚糖、化學致癌-受體激活、雌激素信號通路、松弛素信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、破骨細胞分化等。按count值取前20條條目繪制氣泡圖,見圖6。說明補肺活血膠囊異病同治COPD及IPF主要是通過多種信號通路共同完成的,其中HIF-1信號通路可能是其發(fā)揮治療作用的主要信號通路,利用KEGG PATHWAY Database在線平臺(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)繪制相應信號通路圖,見圖7。

圖5 GO功能富集分析圈圖

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖7 HIF-1信號通路圖

2.6分子對接結果 將核心靶點蛋白ALB(PDB ID:6M4R)、Akt1(PDB ID:3OS5)、INS(PDB ID:5W2H)、TNF(PDB ID:1TNR)、IL1B(PDB ID:1HIB)與主要活性成分異補骨脂素、刀豆氨酸、豆甾醇、補骨脂酚以及β-豆甾醇進行分子對接,借助JShare在線工具(https://jshare.com.cn/demos/hhhhiz)對分子對接結果繪制相應熱圖,見圖8,顏色越深表示配體與受體間的結合能越低,說明其結合活性越好。研究發(fā)現(xiàn),若分子對接結合能<-4.25 kcal/mol,說明活性成分與靶點蛋白間有一定的結合活性;若結合能<-5.0 kcal/mol,說明二者結合性能較好;若結合能<-7.0 kcal/mol,說明兩者結合活性較高,其分子對接的構象較穩(wěn)定。分子對接結果顯示,所有活性成分與靶點蛋白間均能自由結合并且形成氫鍵,且除TNF與Canavanine外均能較好結合[13-14]。利用Pymol軟件將分子對接結合能≤-10.0 kcal/mol的結果進行可視化,見圖9。

圖8 分子對接熱圖

圖9 部分分子對接結果模式圖

3 討 論

本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法篩選出補肺活血膠囊主要活性成分包括異補骨脂素、刀豆氨酸、豆甾醇等,其中異補骨脂素可作用于33個COPD及IPF的相關靶點,是補肺活血膠囊發(fā)揮“異病同治”作用的首要活性成分。相關研究表明,異補骨脂素不僅能通過顯著下調小鼠體內(nèi)TNF及IL-6的水平,降低脂多糖誘導的炎癥細胞數(shù)量,以作用于NF-κB和MAPK信號通路來控制炎癥反應,減輕肺組織損傷[15];還可以減少體內(nèi)IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子的釋放,抑制氣道高反應性和NF-κB活化[16];此外,還可以通過調節(jié)JNK和ERK通路誘導細胞凋亡,調節(jié)細胞周期來抑制癌細胞的生長和轉移,發(fā)揮抗腫瘤活性[17]。

PPI網(wǎng)絡結果表明補肺活血膠囊“異病同治”COPD和IPF主要通過多個潛在靶點共同發(fā)揮治療作用,其中ALB、Akt1、INS、TNF、IL1B等核心靶點尤為重要。相關實驗研究結果表明[18],Akt1可以通過上調巨噬細胞中促纖維化細胞因子IL-13的產(chǎn)生來調節(jié)肺纖維化,而它的缺乏則會導致膠原蛋白沉積和纖維形成減少;除此之外,Larson-Casey等[19]發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細胞中Akt1誘導的線粒體自噬與細胞凋亡抗性以及促纖維化極化有關,這對探索IPF的潛在治療策略具有重要意義。TNF-α作為一種常見的促炎細胞因子,在許多炎癥反應中發(fā)揮著至關重要的作用。在IPF患者體內(nèi),脂多糖迅速刺激巨噬細胞中TNF-α的產(chǎn)生,然后激活NF-κB通路誘導趨化因子CXCL13基因的表達,進而控制肺中異位淋巴結構的新生[20];另外,當細胞受到TNF-α刺激時,NF-κB與κB位點結合,進一步激活TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性細胞因子,反過來增強炎性反應,加重COPD患者肺組織損傷[21]。一項大型研究發(fā)現(xiàn),IL1B可能是COPD氣道炎癥的新參與者,它在COPD患者小氣道上皮細胞中顯著上調,但在肺組織、痰液和血液中沒有,推測這可能是由于對外源性刺激以及炎癥微環(huán)境的反應[22]。由此推測補肺活血膠囊可通過多種活性成分作用于上述靶點,控制COPD和IPF炎癥反應的發(fā)生發(fā)展,從而達到治療疾病的目的。

GO功能富集分析結果表明補肺活血膠囊主要通過參與對激素的反應、血液循環(huán)、調節(jié)小分子代謝過程、蛋白質磷酸化以及平滑肌細胞增殖等生物學進程來發(fā)揮治療COPD和IPF的作用,這與COPD和IPF的復雜發(fā)病機制以及病理生理學特點相吻合。

KEGG通路富集分析結果顯示補肺活血膠囊“異病同治”COPD和IPF主要與HIF-1、PI3K-Akt、TNF等信號通路密切相關。研究表明,大多數(shù)慢性炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病與缺氧有關[23]。COPD和IPF患者的氣道通常以慢性炎癥、結構改變以及黏液分泌過多所致的氣道阻塞等為特征,這可能引起肺局部組織區(qū)域耗氧量增加,進一步導致微環(huán)境缺氧,反過來影響炎癥的消退。當HIF-1信號通路被激活后,與其相關的蛋白HIF-1α在患者肺組織中的過度表達,增加的HIF-1α可以上調肺動脈平滑肌細胞中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體VEGF2,進一步在外周血管生成和氣道重塑中發(fā)揮作用[24]。PI3K/Akt信號通路作為調節(jié)細胞生長、增殖、分化和凋亡的關鍵信號通路之一,它的激活不僅可以通過調節(jié)下游的mTOR、HIF-1α和FoxO等來參與肺纖維化[25],而且可以促進COPD大鼠氣道平滑肌細胞的增殖、遷移和黏附[26],極有可能是治療COPD和IPF的合理治療位點。

分子對接結果預測出補肺活血膠囊中主要活性成分均可與潛在核心靶點自由結合,一定程度上驗證了網(wǎng)絡藥理學結果的準確性,為后續(xù)藥理學研究提供了一定的方向。

綜上所述,本研究基于“異病同治”理論,利用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術從分子層面揭示了補肺活血膠囊主要通過多成分、多靶點以及多條信號通路協(xié)同發(fā)揮“異病同治”COPD和IPF的作用機制。然而,網(wǎng)絡藥理學方法也存在一定的局限性。首先,相關數(shù)據(jù)庫更新不及時,某些活性成分和靶點尚未被錄入或者尚未被研究發(fā)現(xiàn);其次,網(wǎng)絡藥理學只是把中藥組成單純相加,并未考慮到藥物間的配伍關系以及藥物含量、濃度等影響因素;最后,網(wǎng)絡藥理學與分子對接結果均為預測所得,補肺活血膠囊“異病同治”COPD和IPF的潛在分子作用機制仍需進一步的實驗驗證。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。