脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中釋放ATP 的SWELL1 通道參與神經(jīng)病理性疼痛

一、研究背景

神經(jīng)病理性疼痛是一種常見的、使人衰弱的慢性疼痛綜合征，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。在周圍神經(jīng)損傷后，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，并發(fā)生形態(tài)改變、增殖、信號分子（包括多種嘌呤能受體如P2X4R、P2X7R 和P2Y12R）上調(diào)。嘌呤能系統(tǒng)是調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞激活最重要的信號通路之一。當(dāng)嘌呤能受體受到刺激時，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的神經(jīng)調(diào)質(zhì)將導(dǎo)致突觸傳遞和脊髓背角神經(jīng)元活動的異常。這些病理改變會加劇脊髓傷害性信息傳遞，并可能將非傷害性刺激轉(zhuǎn)化為疼痛信號。阻斷脊髓嘌呤能受體可逆轉(zhuǎn)疼痛超敏反應(yīng)，表明神經(jīng)病理性疼痛需要細(xì)胞ATP觸發(fā)的嘌呤能信號。然而，周圍神經(jīng)損傷后脊髓內(nèi)ATP 釋放增加的機(jī)制尚不清楚。

體積調(diào)控陰離子通道 (volume-regulated anion channel, VRAC) 由滲透性細(xì)胞腫脹所激活，介導(dǎo)氯離子和各種有機(jī)滲透物從細(xì)胞中釋放，從而利于水通過滲透外排，導(dǎo)致調(diào)控性細(xì)胞體積下降。在腫脹細(xì)胞中檢測到依賴VRAC 的ATP。然而，ATP 是通過VRAC 本身直接釋放還是通過間接機(jī)制釋放尚不清楚。既往研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射卡貝諾洛酮（一種連接蛋白/泛連接蛋白半通道和VRAC 的非特異性阻斷劑）可抑制嚙齒動物的神經(jīng)病理性疼痛，提示VRAC 可能參與神經(jīng)病理性疼痛過程，本研究對此進(jìn)行了探討。

二、主要研究結(jié)果

1.SWELL1 依賴性VRAC 是一種ATP 釋放通道

為了確定ATP 是否直接通過VRAC 通道滲透，該研究首先在表達(dá)VRAC 的HeLa 細(xì)胞中進(jìn)行了實驗，用等摩爾ATP 代替細(xì)胞內(nèi)的Cl-作為唯一的滲透陰離子和灌注低滲溶液來激活VRAC 電流。全細(xì)胞膜片鉗記錄到大量的向內(nèi)電流，而在敲除Swell1的細(xì)胞中由ATP 外排介導(dǎo)的內(nèi)向電流被消除，證明SWELL1 通道對于VRAC 的ATP 通透是必要的，逆轉(zhuǎn)電位的變化同樣表明VRAC 通道對ATP 具有高通透性。熒光素-熒光素酶實驗也檢測到低滲溶液處理后HeLa 細(xì)胞外大量釋放的ATP。根據(jù)電生理數(shù)據(jù)和既往敲低實驗的結(jié)果，細(xì)胞腫脹可誘導(dǎo)野生型(WT)細(xì)胞中ATP 外排明顯增加，而在Swell1敲除(KO)細(xì)胞中則無作用，并且這種ATP 釋放可以被已知的VRAC 阻滯劑oxobutyric acid (DCPIB) 以劑量依賴的方式所抑制。

為了進(jìn)一步測試VRAC 介導(dǎo)的ATP 釋放是否可以被周圍細(xì)胞檢測到，該研究使用sniffer patch方法作為細(xì)胞外ATP 的靈敏功能性生物測定法。以HeLa 細(xì)胞為源細(xì)胞，轉(zhuǎn)染P2X2R-黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP) 的人胚胎腎 (human embryonic kidney, HEK) 293T 細(xì)胞為鄰近的傳感器細(xì)胞進(jìn)行雙全細(xì)胞膜片鉗記錄。結(jié)果顯示高滲溶液激活了WT 源細(xì)胞中的VRAC 和傳感器細(xì)胞中的P2X2R，并在鄰近的傳感器細(xì)胞中檢測到依賴VRAC的ATP 外排（約占P2X2R 完全激活的5%）。在Swell1KO 源細(xì)胞中，VRAC 電流被消除且KO 細(xì)胞中也無ATP 釋放，證明依賴SWELL1 的VRAC 通道傳導(dǎo)和釋放ATP。

2.SWELL1 通道對小膠質(zhì)細(xì)胞中VRAC 活性和ATP 釋放至關(guān)重要

接下來該作者研究了小膠質(zhì)細(xì)胞中VRAC 活性是否需要SWELL1。通過Western blot 觀察到SWELL1 蛋白在小鼠BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)。低滲溶液可引起小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的Cl-電流且具有VRAC 特征，即外向整流和DCPIB 敏感性。除了細(xì)胞腫脹，VRAC 還可以被其他生理相關(guān)的刺激激活，包括鞘氨醇-1-磷酸 (sphingosine-1-phosphate, S1P)，一種與神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)的炎癥介質(zhì)。S1P 在正常等滲緩沖液中誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生DCPIB 敏感、外向整流的VRAC 電流，該作用依賴于S1P 受體和活性氧 (reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生，且S1P 誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量ATP。為了檢測S1P 誘導(dǎo)的ATP 釋放是否依賴于VRAC，使用CRISPR-Cas9 技術(shù)敲除BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中的Swell1。S1P 處理后，VRAC 電流和ATP 外排均被阻斷，說明SWELL1 是BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中VRAC的重要亞基，可能在炎癥過程中介導(dǎo)ATP 釋放。

既往的研究顯示，周圍神經(jīng)損傷后，脊髓細(xì)胞外ATP 水平升高。為了研究這一現(xiàn)象是否由小膠質(zhì)細(xì)胞VRAC 通道介導(dǎo)，該研究使用Cx3cr1-Cre小鼠和Swell1F/F小鼠雜交，獲得了小膠質(zhì)細(xì)胞特異性Swell1敲除小鼠 (conditional knockout, cKO)。利用坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI) 模型，發(fā)現(xiàn)CCI 組中Swell1F/F對照組小鼠的腰段脊髓切片細(xì)胞外ATP 的濃度顯著高于假手術(shù)組，并且Swell1cKO 小鼠CCI 后細(xì)胞外ATP 的增加被抑制，表明小膠質(zhì)細(xì)胞SWELL1 通道參與CCI 后ATP 釋放增加過程。Swell1cKO 小鼠細(xì)胞外ATP 水平的降低可能是由于直接通過小膠質(zhì)細(xì)胞Swell1通道釋放的ATP 減少，或小膠質(zhì)細(xì)胞的激活被間接減少，或者很可能是兩者兼而有之。

3.CCI 誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛樣行為在小膠質(zhì)細(xì)胞特異性Swell1 cKO 小鼠中減少

接下來檢測了小膠質(zhì)細(xì)胞SWELL1 的表達(dá)是否受周圍神經(jīng)損傷的調(diào)節(jié)。RNAscope 原位雜交顯示小膠質(zhì)細(xì)胞Swell1的表達(dá)在神經(jīng)損傷的反應(yīng)中有所增加。而且，小膠質(zhì)細(xì)胞Swell1的缺失不影響基礎(chǔ)痛閾，但CCI 誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛和熱痛覺過敏消失。此外，CCI 誘導(dǎo)的步態(tài)異常在小膠質(zhì)細(xì)胞缺失Swell1的情況下也有降低。以上結(jié)果證明小膠質(zhì)細(xì)胞中的SWELL1 通道在神經(jīng)病理性疼痛樣行為的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞的性別二態(tài)性及其在神經(jīng)病理性疼痛中的作用已經(jīng)得到證實。為了檢測特異性Swell1cKO 的小膠質(zhì)細(xì)胞是否也存在這種性別差異，該研究在周圍神經(jīng)損傷后的雌性小鼠中也進(jìn)行了一系列相同的行為測試。結(jié)果顯示小膠質(zhì)細(xì)胞SWELL1 在調(diào)節(jié)疼痛樣行為方面具有性別二態(tài)性，在雄性小鼠中比在雌性小鼠中發(fā)揮更突出的作用。這種性別差異與最近一些關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞在雄性小鼠而非雌性小鼠疼痛中的獨特重要作用的文獻(xiàn)一致，其潛在的機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

4.CCI 誘導(dǎo)的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞增生和背角神經(jīng)元過度興奮在小膠質(zhì)細(xì)胞特異性Swell1 cKO 小鼠中減少

脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞在周圍神經(jīng)損傷的反應(yīng)中會發(fā)生顯著的增殖和形態(tài)變化，這種變化對神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展至關(guān)重要。Iba1 免疫染色觀察到，生理條件下Swell1的缺失不會導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活，但CCI 引起的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的活化降低，說明SWELL1 對于CCI 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞改變是必需的。已知活化的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞分泌各種信號分子，包括白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)，可誘導(dǎo)背角神經(jīng)元興奮性增加和神經(jīng)病理性疼痛。與小膠質(zhì)細(xì)胞活化降低一致，CCI 后Swell1cKO 小鼠脊髓IL-1β 濃度與WT 相比顯著降低，提示SWELL1 是周圍神經(jīng)損傷后脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活和促炎變化的重要調(diào)節(jié)因子。

VRAC 介導(dǎo)的Cl-外排已被認(rèn)為是炎癥小體NLRP3（NOD-，LRR-和含pyrin 結(jié)構(gòu)域蛋白3）激活的重要步驟，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β。該研究通過全細(xì)胞膜片鉗記錄Swell1cKO 小鼠的骨髓源性巨噬細(xì)胞(BMDMs) VRAC 電流，發(fā)現(xiàn)SWELL1對于NLRP3 的激活是非必需的，并且VRAC 可能通過間接機(jī)制調(diào)節(jié)脊髓中的IL-1β 水平，包括小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。

SWELL1 對小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元相互作用在調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛又有何作用？該研究通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，CCI 后小鼠脊髓背角內(nèi)的c-Fos+神經(jīng)元數(shù)量增加，部分原因可能是周圍神經(jīng)損傷后自發(fā)性神經(jīng)元活動和神經(jīng)元激活增加；相比之下，Swell1cKO 小鼠CCI 后脊髓背角c-Fos+神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少。II 層背角神經(jīng)元在處理傷害性信息中至關(guān)重要，既往的研究表明，周圍神經(jīng)損傷增加II 層背角神經(jīng)元突觸傳遞和興奮性。該研究使用全細(xì)胞膜片鉗記錄II 層背角神經(jīng)元的自發(fā)性興奮性突觸后電流 (sEPSCs) 的振幅和頻率，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞Swell1敲除小鼠，CCI 誘導(dǎo)興奮性突觸傳遞增強(qiáng)受到抑制。這些結(jié)果說明小膠質(zhì)細(xì)胞SWELL1 通道參與CCI 引起的背角神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)和興奮性突觸傳遞增強(qiáng)。

5.FDA 批準(zhǔn)的藥物文庫篩選并確定雙香豆素是一種有效的VRAC 抑制劑

為了進(jìn)一步支持遺傳學(xué)研究結(jié)果，該研究通過藥理抑制劑研究VRAC 在神經(jīng)病理性疼痛中的功能作用。目前可用的VRAC 小分子阻滯劑往往缺乏有效性和特異性。該研究通過高通量YFP 猝滅實驗和電生理篩選并鑒定出兩種新的VRAC 阻滯劑：雙香豆素 (dicumarol)，一種維生素K 環(huán)氧化還原酶的競爭性抑制劑；安可米 (zafirlukast)，一種半胱氨酸白三烯受體1 拮抗劑。它們可劑量依賴性快速完全抑制低滲透壓誘導(dǎo)的VRAC 電流產(chǎn)生。與安可米相比，雙香豆素的效力略強(qiáng)，且最大血清濃度 (Cmax) 遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過它的IC50，而安可米的Cmax為亞微摩爾濃度，遠(yuǎn)低于IC50 值。因此，對雙香豆素做了進(jìn)一步研究。雙香豆素對HEK293T 細(xì)胞中VRAC 通道和Ca2+激活的Cl-通道 (CaCC/TMEM16A) 無顯著的抑制作用，但可以劑量依賴性阻斷低滲透壓誘導(dǎo)的ATP 釋放并抑制VRAC 電流，表明雙香豆素是一種強(qiáng)選擇性的VRAC 抑制劑。

6.雙香豆素阻斷VRAC 通道可減輕CCI 引起的機(jī)械超敏反應(yīng)

雙香豆素在小膠質(zhì)細(xì)胞中以劑量依賴的方式抑制了低滲透壓誘導(dǎo)的VRAC 電流，其IC50(4.1 μM)與HEK293T 細(xì)胞相似，可有效阻斷S1P 誘導(dǎo)的VRAC電流和小膠質(zhì)細(xì)胞中ATP 的釋放。雙香豆素顯著抑制了CCI 誘導(dǎo)的脊髓背角II 層神經(jīng)元sEPSC 的幅度和頻率增加。在雄性小鼠鞘內(nèi)注射雙香豆素短暫緩解了CCI 誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛，表明其潛在的臨床應(yīng)用價值。

三、討論

盡管各種細(xì)胞類型的滲透性腫脹導(dǎo)致依賴VRAC 的細(xì)胞外ATP 濃度增加，但缺乏VRAC 是ATP 滲透通道的直接證據(jù)，并且VRAC 介導(dǎo)的ATP釋放在生理和疾病狀況中的功能意義尚不清楚。該研究提供了SWELL1 介導(dǎo)VRAC 直接傳導(dǎo)和釋放ATP 的電生理學(xué)證據(jù)。功能上，小膠質(zhì)細(xì)胞SWELL1 通道參與神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的脊髓細(xì)胞外ATP含量的增加，激活脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞，并誘發(fā)背角神經(jīng)元過度興奮和神經(jīng)病理性疼痛樣行為。由FDA批準(zhǔn)的藥物—雙香豆素可作為新型有效的VRAC抑制劑，通過鞘內(nèi)給藥可減輕CCI 后小鼠機(jī)械性觸誘發(fā)痛，為用雙香豆素治療神經(jīng)病理性疼痛提供了可靠的理論依據(jù)。

除了脊髓中的小膠質(zhì)細(xì)胞，該研究中使用的Cx3cr1-Cre品系小鼠也會使腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞和外周巨噬細(xì)胞中Cre 依賴的基因缺失，這兩種細(xì)胞也與神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)。雖然不能排除這些細(xì)胞中VRAC 缺失對Swell1cKO 表型的可能貢獻(xiàn)，但該研究的藥理學(xué)數(shù)據(jù)證明，雙香豆素處理脊髓薄片后抑制了CCI 誘導(dǎo)的脊髓背角神經(jīng)元突觸傳遞增強(qiáng)，鞘內(nèi)給予雙香豆素緩解了CCI 誘導(dǎo)的機(jī)械超敏反應(yīng)，表明脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中的SWELL1 通道對神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。

脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中的VRAC 如何調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛呢？由于小膠質(zhì)細(xì)胞對周圍神經(jīng)損傷反應(yīng)迅速，推測小膠質(zhì)細(xì)胞中的SWELL1 通道被包括S1P在內(nèi)的各種炎癥信號選擇性激活，SWELL1 介導(dǎo)的ATP 釋放進(jìn)一步激活小膠質(zhì)和神經(jīng)元的P2X 和P2Y受體。這種自分泌-旁分泌嘌呤能信號驅(qū)動小膠質(zhì)細(xì)胞激活，引起神經(jīng)活性因子（如IL-1β）的分泌和背角神經(jīng)元的異常活動。未來的研究應(yīng)使用基因表達(dá)譜和活細(xì)胞成像來揭示SWELL1 通道介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活的詳細(xì)機(jī)制。值得注意的是，最近的一項研究使用了類似的cKO 小鼠模型，報道了缺血性腦卒中損傷后，Swell1的丟失并不影響中樞小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。有研究表明SWELL1 對于腦局灶性激光損傷后的小膠質(zhì)細(xì)胞遷移和趨化過程是非必要的。因此，SWELL1 對小膠質(zhì)細(xì)胞激活的調(diào)節(jié)可能取決于損傷類型、位置和特定的病理生理背景。

鑒于嘌呤能信號在疼痛中的重要性，其他幾種ATP 釋放機(jī)制也可能與神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)。遺傳學(xué)和藥理學(xué)研究均表明，另外兩個大孔通道連接蛋白-43 (connexin-43) 和泛連接蛋白-1 (pannexin-1)促進(jìn)神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生，盡管尚不確定它們是否調(diào)節(jié)脊髓細(xì)胞外ATP 濃度。脊髓背角神經(jīng)元中胞外分泌的含有ATP 的囊泡對神經(jīng)損傷后細(xì)胞外ATP 含量增加和疼痛超敏反應(yīng)至關(guān)重要，這種機(jī)制似乎不涉及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，因為缺乏囊泡核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白的小鼠表現(xiàn)出與WT 對照組相似的形態(tài)變化和脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。也有報道稱，Cx3cr1-Cre品系小鼠可能使神經(jīng)元中靶基因缺失，盡管部分原因可能是由于報告基因泄漏導(dǎo)致的。然而，該研究并不能排除神經(jīng)元中的SWELL1 通道也參與ATP釋放和疼痛超敏反應(yīng)的可能性。未來的工作需要揭示不同的ATP 釋放機(jī)制和細(xì)胞類型如何共同調(diào)節(jié)脊髓細(xì)胞外ATP 水平，從而誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛。

VRAC 是一種普遍表達(dá)的離子通道，其電流也存在于其他膠質(zhì)細(xì)胞，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞。然而，單獨敲除小膠質(zhì)細(xì)胞中的Swell1和消除VRAC 活性可顯著減少CCI 誘導(dǎo)的雄性小鼠神經(jīng)病理性疼痛樣行為，這突出了小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用在神經(jīng)病理性疼痛中的重要性。值得注意的是，中樞星形膠質(zhì)細(xì)胞中的SWELL1 通道介導(dǎo)谷氨酸釋放，通過興奮毒性加重缺血性腦損傷。因此，雙香豆素治療對機(jī)械痛敏反應(yīng)的緩解可能不是通過單獨抑制小膠質(zhì)細(xì)胞VRAC 和嘌呤能信號來發(fā)揮作用的。未來的研究還應(yīng)包括選擇性地敲除脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中的Swell1，來揭示神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞相互作用和谷氨酸在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持中的作用。

目前可用的大多數(shù)VRAC 抑制劑效力低，選擇性差。雖然DCPIB 是一種相對有效且廣泛使用的VRAC 抑制劑，但它對細(xì)胞具有非特異性和毒性，可抑制或激活六種其他離子通道和轉(zhuǎn)運體。該研究發(fā)現(xiàn)雙香豆素和安可米是有效的選擇性的VRAC阻滯劑，為探索SWELL1 通道的功能及評估其治療潛力提供了急需的藥理學(xué)工具。雙香豆素可達(dá)到的血漿水平顯著高于其抑制VRAC 活性的IC50值，這為將雙香豆素用作治療神經(jīng)病理性疼痛的新方法創(chuàng)造了廣闊的治療窗口。該研究表明，鞘內(nèi)給藥雙香豆素可緩解CCI 引起的機(jī)械性觸誘發(fā)痛。未來的工作將使用不同的藥物治療方案、檢測更多指標(biāo)（如自發(fā)性和持續(xù)性疼痛）和更多的疼痛模型，進(jìn)一步確定藥物的鎮(zhèn)痛情況。這將為更好地靶向Swell1治療神經(jīng)病理性疼痛和其他與VRAC 活動異常相關(guān)的疾?。ㄈ缛毖灾酗L(fēng)）提供可靠的實驗依據(jù)。